Name: ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: חקור שיטה לייצור מטריצה חוץ-תאית של הלשון באמצעות ביוריאקטור מיני תלת-ממדי. מודל זה משחזר תכונות היסטופתולוגיות של קרצינומה של תאים קשקשיים בלשון ומסייע למחקר סרטן הפה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים להכיר את התמיכה של מענקי מחקר הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31371390), את תוכנית המיזם המדינה ההיי-טק פיתוח (2014AA020702), התוכנית של גואנג-דונג מדע וטכנולוגיה (2016B030231001).

כל העבודה חיה המבוצעת על פי חוק רווחת בעלי חיים, המוסדיים הנחיות ואושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה, אוניברסיטת סון יאט סן.
1. הכנת TEM
<ol><li>מבצע עכברים באמצעות נקע בצוואר הרחם ולהסיר את הלשונות באמצעות פינצטה ומספריים כירורגי סטרילי.</li>
	<li>לטבול את הלשונות 75% אתנול למשך 3 דקות, ולאחר מכן להכניס את הלשון כל mL 1.5 ראנבן (EP) שפופרת עם 1 מ"ל של 10 מ מ פוספט סטרילי buffered פתרון (PBS). הערה: הריכוז של PBS בכל השלבים הבאים הוא בדיוק כמו הריכוז בשלב זה.</li>
	<li>תא פירוק על ידי הקפאה הפשרה: להקפיא את הלשונות צינורות EP ב-80 מעלות צלזיוס עבור 1 h ולאחר מכן להפשיר את הלשונות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות 3 מחזורים.</li>
	<li>לטעון את כל הלשון על חתיכת תפירה באמצעות מחט כירורגית, לעטוף את סוף התפר עם חתיכה קטנה של אלומיניום סטרילי. ביצוע הפעולה לצלחת תרבות 3.5 ס"מ או 6 ס מ המכיל 75% אתנול בתנאים סטריליים. הערה: אורך כל פיסת תפירה המתאים הוא כ-20 ס מ, הגודל המתאים של כל חתיכה של נייר כסף על 0.3 ס מ2 (1 ס"מ × 0.3 ס מ). הלשון ייטען ליד זכרי.</li>
	<li>יש לשטוף את הלשון כל 3 מ"ל של PBS סטרילי בקערה תרבות 3.5 ס"מ או 6 ס מ עבור 30 ס' בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.</li>
	<li>לשטוף את הלשונות במים הנדסה גנטית: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של מים הנדסה גנטית סטרילי ריכוז סופי של 90 µg/mL. מכניסים את הלשונות הבקבוק המכילה בר מערבבים. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים. הערה: עד 5 הלשונות ניתן להכניס את הבקבוק אותו תמורת מטפסים משתרגים של התפר. נייר הכסף הוא בסוף התפר הבקבוק כדי למנוע החלקה את הלשון. הלשונות יוצבו 2 ס מ מתחתית הבקבוק על-ידי התאמת אורך התפר שנותרו בתוך הבקבוק. הערה זו היא גם שלבים 1.8, 1.10, 1.12, ו- 1.16.</li>
	<li>לשים את הבקבוק פגים במשך 12 שעות.</li>
	<li>לשטוף את הלשונות עם NaCl: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של 1 סטרילי M NaCl כדי ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.</li>
	<li>לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>תא פירוק על ידי טריטון X-100: להוסיף ampicilin ריכוז הסופי של 90 µg/mL לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של % 2 סטרילי טריטון X-100 ב- PBS. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.</li>
	<li>לשים את הבקבוק פגים במשך 48 שעות.</li>
	<li>לשטוף את לשונות ב- /MgCl2CaCl2: הוספת ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של סטרילי 5 מ מ CaCl2/MgCl2 ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.</li>
	<li>לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>עיכול על ידי DNase: הוספת 1 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) על כל שפופרת EP. להוסיף DNase לתוך HBSS בהתאמה לריכוז סופי של 300 מיקרומטר. להעביר את כל הלשון לתוך כל שפופרת EP, חלק התפר בחוץ. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים. הערה: ודא לחלק תפר אשר נשאר בתוך הבקבוקים השלבים הקודמים גם נשאר בתוך הצינור EP בשלב זה, וודא כי לחלק תפר אשר נשאר בחוץ הבקבוקים השלבים הקודמים גם נשאר בחוץ EP בשלב זה.</li>
	<li>דגירה הלשונות צינורות EP ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>לשטוף את הלשונות עם PBS: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של PBS סטרילי ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.</li>
	<li>לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>אחסן את TEM מוכן סטרילי PBS ב 4 ° C עד השימוש.</li>
</ol>2. תלת מימדי (3D) למפת TSCC
<ol><li>
בניית מודל TSCC סטטי
	<ol>
<li>זרע 1.0 x 106 TSCC תאים בודדים (Cal27) לתוך תבשיל תרבות 3.5 ס"מ. להוסיף 3 מיליליטר של Dulbecco ששינה בינוני/F12 (DF12) המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) של נשר, ampicilin 90 µg/mL ו 90 kanamycin µg/mL.</li>
		<li>התרבות התאים Cal27 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. ודא כי התאים לכסות לפחות 60% שטח של תחתית צלחת.</li>
		<li>להעמיס TEM על טפט Cal27 בצלחת תרבות.</li>
		<li>מכניסים את המנה חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס במשך 28 ימים.</li>
		<li>רענן המדיום תרבות כל יום במהלך תהליך התרבות תאים. ריכוז2 CO בחממה הוא 5%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בניית מודל TSCC מנוער
	<ol>
<li>
הכנת minibioreactor מנוער מתוצרת עצמית
		<ol>
<li>. תוציא את הבוכנה של מזרק 10 מ</li>
			<li>. תחפור בור (בקוטר של 1 ס מ) ליד הטרמינל התחתון של המוט וטען בר מערבבים לתוך החור.</li>
			<li>. תחפור בור (בקוטר של 0.5 ס מ) במרכז הפקק של בקבוק פלסטיק רחב-הפה, לשים את מוט בוכנה דרך הכובע.</li>
			<li>לחתוך חצי שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, הכול על הצד החיצוני של הפקק.</li>
			<li>לצרף עוד קרסים המוט על ידי ליפוף המוט עם חוטי דייג אשר קשורות של עוד קרסים. הערה: עד 4 עוד קרסים שניתן לחבר לו מוט-ברזל.</li>
			<li>אוטוקלב המתחם מתוצרת עצמית לפני השימוש. הערה: לעשות לא אוטוקלבים. הפה רחב בקבוק הפלסטיק. שימוש חדש סטרילי רחב-הפה בקבוק פלסטיק בעת culturing תאים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תרבית תאים דינמי
	<ol>
<li>זרע 1.0 x 106 Cal27 תאים בודדים ב- minibioreactor מתוצרת עצמית. להוסיף 150 מ ל בינונית DF12 אשר מכיל 10% FBS, ampicilin µg/mL 90 ו kanamycin 90 µg/mL.</li>
		<li>להעמיס TEM על minibioreactor באמצעות את עוד קרסים מחובר המוט.</li>
		<li>להדק את הפקק ולשים את minibioreactor על פגים. הפעל את minibioreactor ב 200 סל ד ב חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7-14 ימים. הערה: ריכוז CO2 בחממה2 CO הוא 5%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+lingual+and+hypoglossal+nerve+function+and+quality+of+life+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer.</a> J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).</li>
<li>Patel, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma+in+young+white+women%2C+Age+18+to+44+Years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years.</a> J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).</li>
<li>Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tongue+tissue+as+an+in+vitro.+model+for+studying+tongue+cancer+and+tongue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).</li>
<li>Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restricted+progenitors+for+the+repopulation+of+decellularized+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart.</a> Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+model+of+lung+regeneration%3A+detergent-mediated+decellularization+and+initial+in+vitro+recellularization+with+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Daly, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+binding+and+recellularization+of+decellularized+mouse+lung+scaffolds+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Wallis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+detergent-based+protocols+for+mouse+lung+de-cellularization+and+re-cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat. Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+scaffolds+for+in+vitro+expansion%2C+differentiation%2C+and+organization+of+primary+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול ומבוססת על ייצור ECM decellularized צריך לשמור את ההרכב ECM מקורית בעת הסרת רכיבים תאית ברקמות כמעט לחלוטין21. למרות decellularization כעת מדווחת פרוטוקולים אשר דורשים זלוף דרך להערכת להסיר חומרים הסלולר בתחבורה הולכת חום, עצבנות מכני אומצה, המכונה השיטה המסורתית פשוט וזול22 , 23 , 24 , 25 , 26. יתר על כן, מאז הלשון הוא עשיר li...

הלשון יש תפקידים חשובים שונים, כגון deglutition, חיתוך, טעימות. לפיכך, ירידת ערך של פונקציה הלשון יש השפעה רבה על איכות החיים של המטופלים1. הגידול השכיח ביותר בחלל הפה הוא לשון קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC), אשר מתרחשת בדרך כלל אצל אנשים לשתות אלכוהול או לעשן טבק2.
בשנים האחרונות, הושגה התקדמות במחקר בסיסי על TSCC. היעדר מחקר יעיל במבחנה מודלים נשאר להיות אחת הבעיות הגדולות ביותר. לפיכך, מטריצות (ECM) הופך להיות פתרון אפשרי. מאז ה-ECM הוא מסגרת רשת מורכבת המורכב מטריקס מאורגן מאוד רכיבים, לגרדום חומרים שיש, מבנה דמוי ECM ו קומפוזיציה יהיה כשיר לחקר הסרטן. Decellularized ECM יכולה לספק באופן מושלם את הנישה התאים של אותו מקור במבחנה, אשר הופך להיות היתרון המשמעותי ביותר של ה-ECM.
ECM יכול להישמר עם מרכיבי התא הוסר מן הרקמות דרך decellularization באמצעות חומרי ניקוי ואנזימים. ECM רכיבים שונים, לרבות קולגן, fibronectin laminin במטריצת decellularized מספקים microenvironment דמויי רקמה מקורי של תאים בתרבית, לקדם את הישרדות, התפשטות, התמיינות של תאים3. יתר על כן, אפשר לצמצם את immunogenicity עבור השתלת ברמה מינימלית עם חסרונו של מרכיבי התא ב- ECM.
עד כה, נוסו שיטות ייצור עבור decellularized ECM ברקמות שונות ובאיברים, כגון הלב4,5,6,7, כבד8,9,10 ,11, ריאות12,13,14,15,16,17ו-18,כליות19 , 20. עם זאת, אין מחקרים רלוונטיים להיות מצאו בעבודה דומה בלשון לפי מיטב הידע שלנו.
במחקר זה, לשון decellularized מטריצה חוץ-תאית (TEM) היה מפוברק בצורה יעילה וגם בזול על ידי סדרה של פיזי, כימי, טיפול אנזימטי. ואז TEM שימשה מסכם את הדברים TSCC במבחנה, מציג סימולציה המתאים TSCC התנהגות והתפתחות. TEM יש הביו טוב, כמו גם היכולת להנחות את התאים הגומחה רקמות ספציפיות, אשר מציין כי TEM יכול להיות פוטנציאל גדול TSCC מחקר3. בפרוטוקול שמוצג כאן מספקת מבחר של החוקרים ללמוד על פתוגנזה או טיפולים קליניים של TSCC.

<table><tbody><tr><td>עכברי C57-BL/6J</td><td>מעבדת אוניברסיטת סון יאט-סן מרכז</td><td></td><td></td>בעלי חיים</tr><tr><td>אתנול</td><td>גואנגג'ואו מפעל ריאגנטים כימיים</td><td>HB15-GR-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A501218</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>דיבסיסי נתרן פוספט</td><td>גואנגג'ואו מפעל</td> <td>ריאגנטים כימייםBE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונובסיסי&nbsp;</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>צינור EP 1.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 ס"מ צלחת תרבית תאים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>6 ס"מ צלחת תרבית תאים</td><td>גריינר</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>V900502</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>449164</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A601988</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>תפר כירורגי</td><td>שנחאי Jinhuan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק פה רחב</td><td>SHUNIU</td><td>1407</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מגנטי</td><td>AS ONE</td><td>1-4602-32</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>Hunan Pingan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>גריינר</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>תא Cal27</td><td>האקדמיה הסינית למדעים, בנק התאים של שנחאי</td><td>לשון קרצינומה של תאי קשקש קו תאים</td>U2OS תא האקדמיה הסינית למדעים, בנק התאים של שנחאי קו תאי אוסטאוסרקומה אנושית DMEM/F12 סיגמא-אולדריץ' D0547 נתרן פירובט סיגמא-אולדריץ' P5280 חומצה ללא הפס BBI <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>A600264</tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; מקרר C</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מטהר מים</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

על מנת לבנות מודל אפקטיבית ומציאותית עבור הלשון קשקש קרצינומה (TSCC) במבחנה, השיטות נוצרו כדי לייצר decellularized הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) אשר מספק פונקציונליות פיגומים בנייה TSCC. TEM מספק נישה במבחנה צמיחת תאים, בידול של נדידת תאים. מזערים של מטריצה חוץ-תאית מקורי (ECM) ויצירות ביוכימי בתוך המטריקס decellularized מספקים רקמות ספציפיות נישות עיגון תאים. הזיוף של TEM ניתן למימוש על ידי עיכול deoxyribonuclease (DNase) בליווי של רעלני אורגני או לא. פרוטוקול זה קלה לתפעול ומבטיחה יעילות גבוהה עבור decellularization. TEM הראה cytocompatibility חיובית עבור תאים TSCC בתנאים תרבות סטטי או מנוער, המאפשרת בניית המודל TSCC. ביוריאקטור מתוצרת עצמית שימש גם עבור התנאי מנוער מתמשך עבור תרבית תאים. TSCC שוחזר באמצעות TEM הראה את התכונות והמאפיינים הדומה histopathology TSCC קליני, מציעה את הפוטנציאל במחקר TSCC.

פרוטוקול זה עבור הכנת TEM מתברר להיות יעילים והולמים. TEM הראה decellularization מושלם לעומת רקמות בשפת. היעילות של decellularization אושר ע י hematoxylin-אאוזין (הוא) צביעת (איור 1א-ב). הוא מכתים את התוצאות חשף להיעלמותן של צביעת גרעינית ב- TEM (איור 1B). יתר על כן, ה-DNA כימות תוכן מהעבודה הקודמת הראו כי ה-DNA הוסר כמעט לחלוטין TEM3. פרוטוקול זה הראה גם נזק נדיר שלמות רק...

שיטה מוצגים כאן עבור הכנת הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) עם decellularization יעיל. TEM יכול לשמש פיגומים פונקציונלי של הבנייה מחדש של מודל קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC) לשון בתנאים סטטי או מנוער תרבות.

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של סרטן הפה, כגון כיצד לבנות מודל T-assist מתאים במבחנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש-TSCC משוחזר מבטא מאפייני גידול הדומים מאוד להיסטופתולוגיה קלינית של TSCC. כאשר עלה לראשונה הרעיון לשיטה זו כאשר הבנו שתאי TSCC בתרבית דו-ממדית לא הציגו כראוי את הפנוטיפ המקורי של TSCC.יתר על כן, הבנו את החשיבות של מטריצה חוץ-תאית להתחמקות מסרטן והתמיינות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהכנת מטריצה חוץ-תאית של הלשון ותרבית תלת מימדית באמצעות מיני ביו-ריאקטור קשים ללימוד באמצעות מילים בלבד, והם הטובים ביותר להבהרה. לאחר בידוד הלשונות מעכברים שהומתו על פי פרוטוקול הטקסט, טבלו את הרקמה באתנול 75% למשך שלוש דקות.לאחר מכן העבירו כל לשון לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי של 10 מילי-מולר. כדי לבצע ליזה של תאים, הקפיאו את הלשונות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הפשירו את הרקמה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.חזור על ההקפאה/הפשרה פעמיים נוספות. לאחר מכן, בצלחת תרבית של 3 1/2 ס"מ או שישה סנטימטרים המכילה 75% אתנול, השתמש במחט כירורגית כדי להעמיס כל לשון על פיסת תפר כירורגי. ועם חתיכה קטנה של נייר כסף סטרילי, עטפו את קצה התפר.בצלחת תרבית של 3 1/2 סנטימטר או שישה סנטימטרים, השתמש בשלושה מיליליטר PBS כד

fabrication-tongue-extracellular-matrix-reconstitution-tongue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סקירה מקיפה של טכניקות מעורב ביצירת מודל עכברי של סרטן הפה ניטור כמותי של הפלישה הגידול בתוך הלשון באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון של תאים שכותרתו מוצג. מערכת זו יכולה לשמש פלטפורמה שימושי להערכת יעילות התרופה מולקולרית של תרכובות אנטי פולשנית.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

בסרטון זה אנו מתארים את הבידוד של תאי אפיתל מלשון מורין. תאים אלה יכולים להיות תרבית נוספת כדי ליצור מושבות תאים.

בידוד ותרבית תאי אפיתל לשון מורין: הליך לבידוד ותרבית תאי אפיתל לשון ממודל עכבר

סרטון זה מדגים את הכנת המטריצה החוץ תאית של לשון מורין באמצעות שיטת דה-צלולריזציה, הכוללת חשיפת הלשון שנקטפה לסדרה של טיפולים פיזיקליים, כימיים ואנזימטיים. פיגום TEM שנוצר שומר על הרכב המטריקס החוץ תאי המקורי שלו, ומסיר את רכיבי התא.

ייצור מטריצה חוץ-תאית ממודל עכבר: הליך יעיל להכנת מטריצה חוץ-תאית לשון דה-תאית מלשון מורין

מטריצה ​​מקורית המופק פיברובלסטים רקמה מהונדסות היא כלי המתעוררים ליצירת מצע סטרומה אשר תומך בהתפשטות תאי אפיתל ובידול. הנה פרוטוקול יישום מתודולוגיה זו כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאים שונים של סטרומה בביולוגיה של תא הסרטני מוצג.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט האדם הנורמלי.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

פיתוח של מודלים murine עם גנים ספציפיים מוטציה בראש ובצוואר חולי סרטן נדרש להבנת neoplasia. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור שינוי בלתי מתורבת של תאי הלשון הראשי murine באמצעות מערכת וירוס הקשורים adeno-Cas9 כדי ליצור קווים מורין HNC התאים עם שינויים גנומית ספציפיים.

בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת

פיתחנו פרוטוקול כללי כדי לנתק כמות גדולה של תאים בודדים באיכות גבוהה מן האפיתל ו mesenchyme / רקמת חיבור של לשונות עכבר עובריות ובוגרות.

ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.

מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים

שיטה ייחודית לכריתה כירורגית של גידולי קרצינומה של תאי קשקש אוראליים שנוצרו בחלל הפה מוצגת כאן.

מודל כריתת גידול רלוונטי לתרגום עבור מודלים פרה-קליניים של עכברים של קרצינומה של תאי קשקש בפה

חקור שיטה לייצור מטריצה חוץ-תאית של הלשון באמצעות ביוריאקטור מיני תלת-ממדי. מודל זה משחזר תכונות היסטופתולוגיות של קרצינומה של תאים קשקשיים בלשון ומסייע למחקר סרטן הפה.

ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה

גלה סרטונים נוספים