מודל ב Ovo לבדיקת תרכובות מימטי-אינסולין
23 באפריל 2018
במחקר זה, אנו מתארים מערכת ב- ovo ככלי מבטיח לבדוק אינסולין-מימטי תרכובות אורגניזם חי. היתרונות העיקריים כוללים תפוקה הולמת ועלויות מקובל, המאפשרים הזיהוי של פיטוכימיקלים עם אינסולין-מימטי מאפיינים.
המטרה הכוללת של מודל עוברי האפרוח המותאם המוצג היא לאפיין חומרים בעלי תכונות חיקוי אינסולין באורגניזם חי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחקר חולי הסוכרת כגון מציאת תמציות צמחים בעלות תכונות חיקוי אינסולין המפחיתות את רמות הגלוקוז בדם ללא תופעות לוואי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבדוק את יעילותן של תרכובות באורגניזם חי עם שיעורי תפוקה נאותים, וכי אין צורך באישור של ועדת אתיקה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההכנה והחיתוך, מכיוון שהכלים אינם מוכנים בקלות, או לעתים קרובות נחתכים לחלוטין והולכים לאיבוד. בדוק את הביציות להפריה לאחר הדגירה בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס עם לחות ממוצעת של 40 עד 60 אחוז למשך עד 11 יום. לשם כך, טבלו את שולי מנורת המנורה בכרית דיו, ואז נרו את הצד המחודד של הביצה.
כדי לזהות את שלפוחית האוויר, בדוק אם יש הבדלים בבהירות בחלק העליון של הביצה. שלפוחית האוויר מופיעה כאזור עגול ושקוף יותר, בעוד שהאלבומין נראה כהה יותר. סמן את מיקום שלפוחית האוויר על ידי לחיצה קלה על המנורה על הביצה בעזרת הדיו שהוחל בעבר.
אל תכלול ביצים לא מופרות, שאינן מראות הבדל בבהירות בין האלבומין לשלפוחית האוויר. הכן את חיקוי האינסולין, או האינסולין, על ידי דילול לריכוז הרצוי בתמיסת המלח המאוזנת של האנק. כדי למרוח את התרכובת שנבחרה, השתמש בזוג פינצטה מחודדת כדי לנקר בזהירות את קליפת הביצה באזור המסומן של שלפוחית האוויר ליצירת חור השווה לקוטר מזרק המחט.
השתמש במזרק סטרילי של מיליליטר כדי להזריק 300 מיקרוליטר מתמיסת החיץ המכילה את החומר המעניין. כדי לקבוע את השפעת הפחתת הגלוקוז בדם של חומר, החזירו את הביצים לחממה ומדדו את רמת הגלוקוז בדם לאחר 60, 120 ו-180 דקות. בנקודת הזמן המתאימה, הסר בזהירות את קליפת הביצה מעל שלפוחית האוויר ואזן את קרום קליפת הביצה על ידי הוספת מספיק מאגר PBS כדי לכסות את כל הממברנה.
לאחר ששפכו עודפי PBS, השתמשו בפינצטה מחודדת כדי למשוך בזהירות את קרום קליפת הביצה. השתמש במספריים מיקרו כדי לחתוך ולהסיר את הממברנה הכוריואלנטואית תוך הימנעות מכלי דם גדולים בקרום. אתר את הכלי הגדול שמקורו בבטן העובר.
הרם את הכלי הזה מהאלבומין בעזרת מספריים מיקרו סגורים והנח אותו על רצועת pH מפלסטיק. הזז את רצועת ה-pH מתחת לכלי ומשוך לאחור את המספריים המיקרו בזהירות. חיוני להכין את כלי הדם הגדולים שמקורם בבטן, שכן קטנים יותר עלולים להיקרע ולהפוך את איסוף הדם לבלתי אפשרי.
הסר כל נוזל המקיף את הכלי בעזרת פיפטה כדי למנוע דילול הדם. לאחר מכן, השתמש בנייר סינון כדי לייבש את הכלי ואת רצועת ה-pH. לאיסוף דם, חשוב לא לחתוך לחלוטין את הכלי מכיוון שהוא ילך לאיבוד.
לאחר מכן, השתמש במספריים מיקרו כדי לחתוך את כלי הדם בזהירות בצד אחד. אין לחתוך יותר ממחצית הכלי כדי למנוע חיתוך מוחלט של הכלי. אוספים את הדם הדולף על רצועת ה-pH בעזרת פיפטה.
נדרשים 10 מיקרוליטר דם כדי לקבוע את רמות הגלוקוז באמצעות מד הגלוקוז בדם. לאחר מריחת התרכובת שנבחרה למשך 24 שעות, יש לאזן את קרום קליפת הביצה עם PBS כמו קודם למשך 30 שניות לפחות. הסר עודף PBS buffer על ידי שפיכתו.
לאחר מכן, משוך את קרום קליפת הביצה בזהירות בעזרת פינצטה מחודדת. בדוק אם יש נגעים בכלי הדם, ואשר את החיוניות על ידי התבוננות בתנועה של עובר הגוזל. לניסויים אלה נעשה שימוש בתמציות שהוכנו מ-combretum indicum, או זוחל הרנגון, ותמצית לא ידועה הנושאת את הכותרת 0845.
כפי שמצוין באיור זה, התמצית מזחל רנגון לא הביאה לירידה משמעותית בגלוקוז בדם ביצה. עם זאת, ריכוז הגלוקוז בדם הופחת בהצלחה עם תמצית 0845 עם השפעה משמעותית שנצפתה כאשר זמן הדגירה התארך. בהשוואה לביצים לא מטופלות, טיפול בביצים עם תמצית צמחים רעילה ביום ה-10 למשך 24 שעות הוביל לנגעים חמורים בכלי הדם בקרום הכוריו-אלנטואי.
נגעים נראו גם על העובר המטופל בהשוואה לביקורת רגילה. לאחר השליטה, ניתן לנתח שתי ביציות לרמות גלוקוז ורעילות תוך חמש דקות אם מבוצעות כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין כלי דם ולאסוף דם במודל עוברי התרנגולת כדי לכמת את השפעות הפחתת הגלוקוז בדם של תרכובות טבעיות או סינתטיות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מודל שונה של עובר אפרופה ככלי להערכת תרכובות דמויות אינסולין. המערכת בתוך הביצה (in-ovo) מאפשרת לבחון תמציות צמחים שעשויות להפחית את רמות הגלוקוז בדם ללא תופעות לוואי, ובכך להדגים יתרונות משמעותיים ביעילות ובעלויות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מחקר סוכרת
- בדיקות פיטוכימיות
- תרכובות דמויות אינסולין
רקע
- מודל העובר של האפרו מספק פלטפורמה של אורגניזם חי לצורך בדיקות.
- השיטה חוסכת תהליכי בחינה אתיים, ובכך מאיצה את המחקר.
- היא נותנת מענה לצורך בחלופות לאינסולין כימי.
מטרת המחקר
- זיהוי תמציות צמחים בעלות תכונות דמויות אינסולין.
- הערכת השפעתן על הורדת רמות הגלוקוז בדם.
- בחינת תופעות לוואי פוטנציאליות במערכת חיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש במודל עוברי של אפרואי שעבר התאמה.
- תרכובות המדמות אינסולין הוחשקו לתוך שלפוחית האוויר.
- רמות הגלוקוז בדם נמדדו לאחר יישום התרכובות.
- שלבים קריטיים כללו הארה של הביצה (candling), הכנת כלי דם וטכניקות לאיסוף דם.
תוצאות עיקריות
- תמצית 0845 הפחיתה באופן משמעותי את רמות הגלוקוז בדם בהשוואה לקבוצות הביקורת.
- לא נצפתה השפעה משמעותית מתמצית ה-Rangoon creeper.
- נגעים הרסניים הופיעו בעקבות חשיפה לתמצית רעילה.
מסקנות
- המחקר מדגים את התועלת של מודל עובר האפרופה בהערכת תרכובות המדמות אינסולין.
- שיטה זו משפרת את יעילות המחקר במציאת חלופות בטוחות לאינסולין.
- ההשלכות כוללות הבנה טובה יותר של תפקידם של תרכובות צמחיות בטיפול בסוכרת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה של תרכובות דמויות-אינסולין בשלב הגילוי דורשת מודלים ב-in vivo שהם חזויים, ניתנים להרחבה ומפושטים מבחינה אתית, כדי לסנן מועמדים לפני מחקרים ביונקים. מודל עוברי האפרוח המשופר מאפשר הערכה כמותית ומהירה של השפעות להורדת סוכר בדם ושל רעילות, ובכך תומך בהפחתת סיכונים בשלב מוקדם עבור מועמדים סינתטיים וצמחיים כאחד. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיק הפיתוח על ידי אספקת נתונים ברי-יישום על יעילות ובטיחות התרכובות במערכת חיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- תומך בתיקוף תפקודי של פעילות דמוית אינסולין באורגניזם חי.
- מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפת אותות של יעילות ורעילות גלויה כאחד.
- מסייע במיון מהיר של תרכובות מועמדות לפני מחקרים בינקים הדורשים משאבים רבים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת תואמת-תפוקה למדידה כמותית של גלוקוז בדם לאחר מתן התרכובת.
- מסטנדרט את הערכת ההשפעות של התרכובת על translocation של Glut4 ועל ספיגת גלוקוז.
- מאפשר סריקה הניתנת לשחזור של תמציות סינתטיות וצמחיות לבחינת תכונות דמויות-אינסולין.
מחקרeיזואלי ופרה-קליני
- מגשר בין סריקה in vitro למודלים פרה-קליניים של יונקים למחקר של מחלות מטבוליות.
- מאפשר זיהוי מוקדם של רעילות או נגעים וסקולריים, ובכך מסייע בהערכת סיכונים תרגומית (translational).
- תומך ברצף של הערכת הבטיחות והיעילות של מועמדים למולקולות טיפוליות במערכות מודלים שונות.
שילוב בקו עיבוד ובזרימת עבודה
מודל in ovo זה מגשר בין סריקה in vitro למחקרי קדם-קליניים ביונקים, ומספק הקשר של אורגניזם חי להערכת תפקוד ובטיחות של תרכובות הפועלות כמימטיקה לאינסולין.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות למנגנוני הורדת גלוקוז ומעקב אחר מעורבות המטרה in vivo.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות וניתנות לשחזור של גלוקוז בדם לצורך ניתוח השוואתי של יעילות המועמדים.
- אנליטיקה: תומכת בהערכה סטטיסטית של הפחתת גלוקוז ונקודות קצביות של רעילות לאורך נקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מסייעת בקידום מותאם סיכונים על ידי חשיפת רעילות מוקדמת או היעדר יעילות בהקשר של אורגניזם שלם.
- שימוש חוזר ארגוני: מספקת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר ומיועלת מבחינה אתית להערכה איטרטיבית של תרכובות בקווי פיתוח של מחלות מטבוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת מועמדים באמצעות שילוב נתוני יעילות ורעילות ממערכת חיה.
- ערך תפעולי: מייעל את הסינון בשלבים מוקדמים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים להרחבה, ללא צורך באישורי אתיקה לבעלי חיים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go), ובכך מפחית סיכון ביולוגי והוצאות משאבים בשלבים מאוחרים יותר.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים למולקולות דמויות אינסולין (insulin-mimetic) בעלי פוטנציאל תרגומי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בטיפול בעוברים, הכנת כלי דם ואיסוף דם.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומכשור למדידת גלוקוז בדם.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת תרכובות ומינונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מחלקות תרכובות שונות או נקודות קצה מטבוליות.
- טכניקה קפדנית חיונית כדי למנוע אובדן של כלי דם או דילול דגימות, העלולים לפגוע ביושרה של הנתונים.
