זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2
21 במאי 2018
שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לזהות את המולקולות הסינרגטיות, המגבירות זו את פעילות זו, כאשר הן משולבות באמצעות סינון תפוקה גבוהה. זוגות תרופות סינרגטיים הם אסטרטגיה מבטיחה, למאבק בזיהומים עמידים לתרופות, אך קשה לזהות אותם. שיטה זו יכולה לזהות מולקולות המקיימות אינטראקציה עם תרופות אנטי-מיקרוביאליות קיימות המשמשות לטיפול במחלות זיהומיות.
בטווח הארוך שילובים אלה יכולים להיכנס להערכה פרה-קלינית ובסופו של דבר לשפר את הטיפול בחולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעשות זאת עם כל אורגניזם מעניין ועם כל ספרייה של מולקולות קטנות. ההשלכות של טכניקה זו, משתרעות לכיוון טיפול במחלות זיהומיות מרובות מכיוון שהיא עובדת עם כל אורגניזם מעניין.
השתמש בגיליון אלקטרוני סטנדרטי כדי לחשב את ציון הצמיחה הממוצע וסטיית התקן עבור כל המוטאנטים, בנוכחות ריכוז מסוים של המולקולה הקטנה שנוספה. לאחר מכן, חשב את ציוני Z עבור כל אחד מריכוזי המולקולות הקטנות. לאחר מכן, הדגישו את המוטציות הגנטיות עם ציוני Z משמעותיים.
ראשית, גדלו תרבית E.coli במדיום מינימלי M9, למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ממיסים את המולקולות הקטנות בדימתיל סולפוקסיד בריכוז גבוה מעל 10 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום M9 לכל באר בצלחת של 96 בארות.
פיפטה 100 מיקרוליטר נוספים של מדיום M9 בעמודה הראשונה כך שהנפח בעמודה זו הוא 200 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף כ -10 מיקרוליטר מתמיסת המולקולה הקטנה המרוכזת, בעמודה הראשונה. לאחר הוספת המולקולות הקטנות, התחל לדלל אותו על פני ציר ה-X של הצלחת.
המשיכו לדלל עד שיש, 100 מיקרוליטר בעמודה 11. לאחר ערבוב עמודה 11, השליכו 100 מיקרוליטר מעמודה זו. נניח שיהיה רק בינוני בעמודה 12 כדי לנרמל את הנתונים.
לאחר מכן, רשום את ערך הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של תרבית הלילה שגדלה במדיום מינימלי M9. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של התרבות לכל באר. כך שיש 1000 תאים לבאר.
לאחר מכן, נער את הצלחת בעדינות. ושימו לב לקריאת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר עבור נקודת זמן של שעת אפס. לאחר רישום הקריאה, דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך יום.
שוב, מדוד את ערך הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר עבור נקודת זמן של 24 שעות. כדי לבצע את בדיקת לוח השחמט, גדל תרבית E.coli במדיום מינימלי M9 למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום M9 לכל באר והוסף עוד 100 מיקרוליטר מאותו מדיום בעמודה אחת של צלחת 96 בארות.
לאחר מכן, הוסף את הבדיקות מולקולות קטנות, בכל באר בעמודה הראשונה. ולהוסיף כפול מהריכוז בבאר A1. לאחר מכן, צור שיפוע דילול לאורך ציר X על ידי העברת 100 מיקרוליטר, מעמודה אחת לעמודה שתיים. המשך בתהליך הדילול, עד להוספת 100 מיקרוליטר בעמודה 11.
לאחר ערבוב עמודה 11, השליכו 100 מיקרוליטר מהעמודה הזו והשאירו את עמודה 12 עם מדיום בלבד ללא תרופות. צור שיפוע נוסף לדילול התרופה השני. לשם כך, הוסף 100 מיקרוליטר מהמדיום המכיל שני X, ריכוז מעכב מינימלי של מולקולת הקלט בשורה A.לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר משורה A ל-B.המשיכו בתהליך הדילול, עד שמוסיפים 100 מיקרוליטר בשורה G.לאחר ערבוב שורה G, השליכו 100 מיקרוליטר מהבאר.
לאחר מכן חסנו את הצלחת בשני מיקרוליטר של התרבות לכל באר. כך שיש 1000 תאים לבאר. לאחר מכן, מדוד את קריאת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר עבור נקודת זמן של שעת אפס.
לאחר רישום הקריאה, דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ולאחר מכן, מדוד את ערך הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר עבור נקודת זמן של 24 שעות. כדי לבצע סינון בתפוקה גבוהה, עבור תרופות סינרגטיות, תרבית הן מסוג פרא והן תאים מוטנטיים לחיזוי סינרגיה במדיום מינימלי M9.
לאחר מכן, הוסף את התרופות מהספרייה למדיום. לאחר מכן, חסנו צלחת אחת של תרופות ספרייה עם סוג הבר וצלחת אחת נוספת עם חיידקים מוטנטיים עם חיזוי סינרגיה. לוח זה מייצג את בדיקת לוח השחמט המשמשת לחקירת שילובי תרופות סינרגטיים.
בלוח זה, באר F9 עם ציון ה-FICI הנמוך ביותר של 0.07 מצביע על כך שזוג המולקולות הקטנות הוא סינרגטי. לוחית זו מייצגת את בדיקת לוח השחמט לחקירת שילוב תרופות שאינו מקיים אינטראקציה. בלוח זה, הבאר C3 עם ציון ה-FICI הנמוך ביותר של 1.0 מצביעה על כך שזוג המולקולות הקטנות אינו מקיים אינטראקציה זה עם זה.
לוח זה מייצג את בדיקת לוח השחמט המשמשת לחקירת שילובי תרופות אנטגוניסטיים. בלוח זה, ובכן A1 עם ציון ה-FICI הנמוך ביותר של 8.0 מצביע על כך שהאינטראקציה בין מולקולות התרופה היא אנטגוניסטית. לאחר מכן, Befeldin A, תרופה בעלת מולקולה קטנה בפלוקונזול, משמשת לחקר הצמיחה של פורמינים C ו-U.
התרשים מראה כי הצמיחה הן של הסוג הפראי והן של מוטנט חיזוי הסינרגיה מעוכבת מעט ובאותה מידה. זה מצביע על כך שבפלדין A ופלוקונזול הם שותפים תרופתיים לא סינרגטיים. נהפוך הוא, הצמיחה של מוטציה של חיזוי סינרגיה של פורמינים C ו-U מעוכבת באופן משמעותי, בנוכחות Refromisyn ו-Fluconazole.
מה שמצביע על כך שהתרופות הן שותפות סינרגטיות. מעניין שצמיחת הטבע אינה מעוכבת כלל. כאן נצפה הבדל הגידול הגדול ביותר, בין 32 ל -49 שעות לאחר החיסון.
לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לקצר את הזמן לזיהוי אינטראקציות סינרגטיות עם תרופות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לא לשלב תרופות בעמודה האחרונה בשורה האחרונה של בדיקת לוח השחמט. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות לזיהוי מולקולות סינרגטיות, על מנת לזהות אינטראקציות תרופתיות סינרגטיות נוספות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במתודולוגיית O2M כדי לזהות סמני סינרגיה משוערים על מנת למצוא אינטראקציות תרופתיות סינרגטיות עם האורגניזם המעניין שלך. אל תשכח שבעוד שעבודה עם כמה מולקולות קטנות עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט בכל אמצעי הזהירות ב-MSDS, בעת ביצוע פרוטוקול זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה לזיהוי מולקולות קטנות בעלות השפעה סינרגית, המגבירות את פעילותן כאשר הן משולבות. הגישה עושה שימוש בסריקה בתופעת גבוהה (high-throughput screening) כדי לגלות זוגות תרופות שיכולים להילחם ביעילות בזיהומים העמידים לתרופות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פרמקולוגיה
- פיתוח תרופות
- מחלות זיהומיות
רקע
- זיהוי אמפירי של שילובי תרופות סינרגטיים הוא מאתגר.
- שילובים אלה הם קריטיים לטיפול בזיהומים עמידים לתרופות.
- ניתן להחיל את המתודולוגיה על כל אורגניזם רלוונטי.
- הדבר מאפשר שימוש בספריות שונות של מולקולות קטנות.
מטרת המחקר
- לזיהוי מולקולות סינרגיסטיות המשפרות את יעילותם של תרופות אנטימיקרוביאליות קיימות.
- להקל על גילוי שילובי תרופות לצורך הערכה פרה-קלינית.
- לשפר את הטיפול במטופלים באמצעות אסטרטגיות טיפול יעילות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סריקה בthroughput גבוה לזיהוי זוגות תרופות בעלי השפעה סינרגית.
- הערכה של אינטראקציות בין מולקולות קטנות לתרופות קיימות.
- יישום של השיטה באורגניזמים שונים.
- הערכה של שילובים פוטנציאליים לשימוש טיפולי.
תוצאות עיקריות
- זיהוי זוגות תרופות סינרגיסטיים המראים פעילות מוגברת.
- הדגמת ישימותה של השיטה עבור אורגניזמים שונים.
- פוטנציאל של שילובים אלו למעבר לניסויים פרה-קליניים.
- השלכות על הטיפול במחלות זיהומיות מרובות.
מסקנות
- המתודולוגיה מציעה אסטרטגיה מבטיחה לגילוי שילובי תרופות יעילים.
- היא נותנת מענה לאתגר של עמידות לתרופות במחלות זיהומיות.
- לגישה זו עשויה להיות השפעה משמעותית על הטיפול בחולים ועל תוצאות הטיפול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
זיהוי מהיר של שילובי תרופות סינרגטיים הוא אתגר קריטי בגילוי תרופות אנטימיקרוביאליות, המשפיע ישירות על היכולת להתמודד עם זיהומים עמידים לתרופות. שיטת ה-Overlap2 (O2M) מאפשרת חיזוי ותיקוף בתוספת של תפוקה גבוהה (high-throughput) של זוגות מולקולות קטנות סינרגטיות, ובכך תומכת במיון תיקי תרופות ובצמצום סיכונים בשלבים מוקדמים. גישה זו מגבירה את הביטחון החיזוי בפיתוח טיפולים משולבים ומאיצה את ההתקדמות לעבר הערכה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה שיטתית של השערות טיפוליות בנוגע ליעילות של שילובים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין אינטראקציות סינרגית לאדיטיבית או אנטגוניסטית.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות פרופיל רגישות של מוטנטים.
- משפר את הביטחון החזוי לצורך תיעדוף זוגות של תרופות בצינור הפיתוח (discovery pipeline).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות מיקרוביאליות שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקה רב-סבביים (high-throughput) חסונים.
- מסטנדרט את בדיקות עיכוב הגדילה הכמותיות לזיהוי סינרגיה הניתן לשחזור.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של ספריות גדולות של מולקולות קטנות לבדיקת אפקטים של שילובים.
- מספק נתונים מהימנים להערכת תרכובות ולמיון (triage) בשלבי ההמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי הגילוי למטרות טרנסלציוניות על ידי זיהוי שילובי תרופות עם פוטנציאל להתגבר על עמידות.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני של שילובי תרופות אנטימיקרוביאליות.
- מספקת הפחתת סיכונים מתובססת-מכניזם להעברת זוגות סינרגים למחקרי in vivo.
שילוב תהליכים וזרימות עבודה
שיטת ה-O2M משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות מוקדמות, דרך זיהוי מועמדים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני של שילובים אנטימיקרוביאליים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת זיהוי של סממני סינרגיה המונחה על ידי היפותזה באמצעות פרופילים של רגישות מוטנטית.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הדירות של עיכוב צמיחה מיקרוביאלית לצורך הערכה איתנה של סינרגיה.
- אנליטיקה: מספקת פלטים מבוססי Z score ו-FICI להשוואת אינטראקציות בין זוגות תרופות ותיעדוף מועמדים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי הצבעה על שילובים בעלי פוטנציאל להתגברות על עמידות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה שאינו תלוי פלטפורמה וניתן להתאמה לאורגניזמים שונים ולספריות תרכובות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי טיפולים משולבים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של סריקה בתפוקה גבוהה וניתוח נתונים לזיהוי סינרגיה הניתן להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) וקידום יעיל מבחינת הון של שילובים מבטיחים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים לשילובים אנטימיקרוביאליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של מיקרואורגניזמים, סריקה בשthroughput גבוה וניתוח נתונים כמותי.
- נדרשת גישה למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים, קוראי לוחות וכלים חישוביים לחישובי Z score ו-FICI.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי הבדיקה ושל קריטריונים לפרשנות הנתונים.
- ניתן להתאמה למיני מיקרואורגניזמים שונים ולספריות תרכובות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר במולקולות קטנות מסוכנות והקפדה על פרוטוקולי בטיחות הם חיוניים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Identifying Synergy Prediction Mutants from Chemical-genetics Dataset by the Overlap2 Method
1:17
Validation of Predicted Synergistic Interactions
4:52
High-throughput Screen with Synergy Prediction Mutants to Identify the Novel Synergistic Pairs
5:21
Results: Use of Checkerboard Assay to Identify and Validate Synergistic Drug Molecules
7:05
Conclusion
