רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בפלטפורמה מיקרופלואידית כדי לבנות רשת כלי דם ניתנת להפרדה באגרגט רב-תאי, או ספרואיד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בצורה החלופית של תחומי הרפואה הרגנרטיבית, כגון כיצד רשת כלי דם חשובה במודלים של רקמות in vivo ו-in vitro. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמות את מסלול מתן התרופות והתוספים במבחנה באמצעות מסירת אזורי עניין ישירות לספרואידים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הקושי בהחדרת התאים לאזור המטרה במכשיר המיקרופלואידי. לאחר יציקת הקדם-פולימר PDMS, יש לפרק את החומר בתא ואקום למשך שעתיים, ולאחר מכן ריפוי לילה ב-80 מעלות צלזיוס בתנור מאוורר. למחרת בבוקר, קלף את ה-PDMS מפרוסת הסיליקון, והשתמש באגרוף חור בקוטר שני מילימטר כדי ליצור חורים בחומר במיקומים שצוינו.

השתמש באגרוף בקוטר מילימטר אחד כדי ליצור את באר הספרואיד, והשתמש בנייר דבק כדי לנקות את לוח ה-PDMS וכיסוי זכוכית בגודל 24 על 24 מילימטר. טפל בלוח הנקי עם פלזמת אוויר למשך 40 שניות, והצמד את לוח ה-PDMS על החלקת הכיסוי. לאחר מכן, רפאו את ה-PDMS ב-80 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפחות.

יומיים-שלושה לפני זריעת המכשיר המיקרופלואידי, הוסף שלוש פעמים 10 ל-hLF החמישי המופשר טרי, RFP-HUVECs ו-GFP-HUVECs ל-10 מיליליטר של מדיום אנדותל טרי בצלחת של 10 מילימטר. כאשר ה-hLFs וה-RFP-HUVECs מגיעים לתת-מפגש, השעו את ה-hLFs וה-RFP-HUVECs במדיום האנדותל לריכוזים הסופיים ב-1.0 כפול 10 לתאים החמישיים ו-2.5 כפול 10 לתאים הרביעיים למילימטר, בהתאמה. לאחר יומיים בתרבית מתלים, בארון בטיחות ביולוגית, הוסף טיפה של 99 מיקרוליטר של תמיסת תערובת מאסטר שהוכנה טרייה למרכז צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר על קרח.

כדי לטעון את המכשיר המיקרופלואידי, השתמש בקצה מיקרופיפטה שונה של 100 מיקרוליטר כדי להעביר כדור ו-100 מיקרוליטר של מדיום לצלחת פטרי שנייה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את הכדור בכמות מינימלית של מדיום, וסובבו את הפיפטה זקופה כך שהכדור ינוע לתחתית קצה הפיפטה על ידי כוח הכבידה. גע בקצה הפיפטה במניסקוס של טיפת התערובת הראשית כדי להוציא את הכדור לתוך התמיסה מבלי ללחוץ על בוכנת הפיפטה.

לאחר מכן, הוסיפו במהירות מיקרוליטר אחד של תרומבין טרי שהוכן לטיפה, וערבבו בעדינות את התרומבין לתמיסה. כשהפיפטה מוגדרת לשבעה מיקרוליטר, העבירו לאט את הכדור לבאר הכדורית של לוח ה-PDMS. השלב הקריטי ביותר בהליך הוא הזרקת הספרואיד עם מספיק ג'ל כדי לאפשר לספרואיד להתיישב בתחתית המכשיר.

לאחר הטעינה, הסר את קצה הפיפטה בעדינות כדי למנוע דליפה בין המיקרו-עמודים. דגרו את הכדור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כאשר הפיברין התמצק, הזריק לאט 20 עד 30 מיקרוליטר של מדיום אנדותל לחורים A ושלושה A כדי לטעון תעלות 1 ו-3, בהתאמה.

לאחר מכן, העבירו את המכשיר למגבון מעבדה רטוב בצלחת של 100 מילימטר, ודגרו את המכשיר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות כדי להקל על הסרת בועות בממשק בין המדיום לפיברין. למחרת, הוסיפו שני מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ל-GFP-HUVECs התת-מתכנסים, והפסיקו את תגובת הטריפסין עם ארבעה מיליליטר של תווך שלם כאשר התאים התנתקו לחלוטין. אסוף את תאי האנדותל על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בתווך אנדותל טרי בריכוז של חמישה פעמים 10 עד שישי תאים למיליליטר.

לאחר מכן, הזרקו 20 מיקרוליטר של HUVECs לתוך חור אחד B כדי לטעון את הערוץ הראשון, והניחו את המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כשהוא מוטה בזווית של 90 מעלות כדי להבטיח שה-HUVECs נדבקים לפיברין בערוץ השני. לאחר טעינת ערוץ שלוש באותו אופן, הנח את המכשיר בצלחת חדשה של 100 מילימטר המכילה מגבון מעבדה לח בחממת תרבית התאים למשך שבעה עד 14 ימים, והחלף מחצית מהמדיום בערוצים 1 ו-3 מדי יום. תמונות מייצגות אלה שצולמו ביום האפס של העמסת HUVEC, מראות ג'ל פיברין מועמס לערוץ שתיים בלבד, ללא כל דליפה לערוץ אחד או שלישי וכאשר ה-HUVECs מחוברים בהצלחה לדופן של ג'ל הפיברין.

ניתן גם לראות את הכדור מיושב כראוי בתחתית המכשיר. נבטים אנגיוגניים נצפים החל מהיום הראשון, כאשר הנבט הארוך ביותר מגיע לכדור ביום השלישי בניסוי זה, וכאשר רוב הנבטים האנגיוגניים מגיעים לספרואיד ביום השביעי. באופן אופטימלי, לאחר ארבעה ימים במכשיר, ניתן לצפות בזרימה דרך לומן כלי הדם כאשר זווית כלי הדם מוגדרת ככיוון קצה כלי הדם ומרכז הכדור משורש כלי הדם.

זוויות כלי הדם יורדות באופן תלוי זמן המעיד על נדידה של הנבטים האנגיוגניים לכיוון הספרואיד. RFP ו-GFP-HUVECs יכולים ליצור בתיאום לומן כלי דם יחיד, מה שמצביע בבירור על אופן האופן שבו אנגיוגני נובט מתעלות אחת ושלוש אנסטומוזה ל-RFP-HUVECs בספרואיד ליצירת רשת כלי דם רציפה. יתר על כן, FITC-דקסטרן המוזרק לתעלה הראשונה זורם לרשת כלי הדם הבנויה ולחלק הפנימי של הספרואיד, ובסופו של דבר מגיע לערוץ שלוש, מה שמרמז על כך שרשת כלי הדם המשולבת יכולה לספק חומרים מזינים ולהסיר פסולת מהספרואיד.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום החשמלי האורגני לחקור את יעילותם של תרופות או תוספי מזון מעניינים במודלים של רקמות במבחנה.