Name: Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: למד שיטה לתרבית תאים בתלת מימד באמצעות פפטידים המתארגנים עצמאית לפיגומים. הטכניקה מחקה תנאים פיזיולוגיים ומאפשרת הבנה מעמיקה של התנהגות תאים והנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחקר שמתבצע על ידי המחברים נתמך בחלקה על ידי מענקים מן האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 229239 ומן קרן אאו, גישוש מחקר שיתופי מחקר תוכנית חריפה הסחוס פציעה/הנגע/פגם (ה-CRP ACI) תחת הפרויקט Bioactive, פיגומים ביונים עבור התחדשות הסחוס (BIOCART).

1. עצמי וההספק פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה
<ol><li>להכין פתרון 0.5% של פפטיד RAD16-אני ב- 20% (w/v) סוכרוז, צינור מיקרו-צנטריפוגה. Sonicate הפתרון פפטיד עבור 20 דקות באמבט אולטראסוני-כוח מרבי, בטמפרטורת החדר (RT) כדי להבטיח ערבוב הומוגנית. הערה: הנפח של פתרון להיות מוכן יהיה תלוי המספר של בסיס הרצוי. RAD16-אני פפטידים אינם סובלים השפלות בתנאים אלה sonication.</li>
	<li>לדלל את הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1.1 עם נפח נחוץ סוכרוז 10% (w/v) כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי. הערה: גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא ההתאמה של הריכוז ההתחלתי פפטיד מאז הקשיחות מטריקס הסופי יהיה תלוי בפרמטר זה. RAD16-אני פפטיד פתרון צריך להיות 2 x יותר מרוכז יותר הריכוז הסופי הרצוי של הבונה תלת-ממד. בדרך כלל, RAD16 האחרון-אני ריכוזים פפטיד המשמש הן בין 0.15 – 0.5% (w/v).</li>
	<li>מקם את הצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את הפתרון פפטיד לתוך באמבט אולטרא-RT במשך 20 דקות כדי להבטיח ערבוב הומוגנית. הערה: הפתרון פפטיד, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב 4 º C.</li>
</ol>2. התא ההשעיה הכנה
<ol><li>Centrifuge התליה תא (שהושג לאחר הטיפול טריפסין) 60 x g ו- RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של פסטר חיבור לקו ואקום והשהה בגדר תא ב- 3-5 מ של 10% (w/v) סוכרוז באמצעות של micropipette. להמשיך לספור תאים באמצעות מונה תא הידנית או האוטומטית. הערה: הפתרון סוכרוז 10% (w/v) היא מדיום מול, ללא יונית זה מאפשר תחזוקה התא ומונעת פפטיד gelation במהלך תהליך ערבוב.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא 60 x g ו- RT עבור 5 דק. הסר תגובת שיקוע והשהה בגדר תא שוב בהיקף הדרוש של 10% (w/v) סוכרוז להשיג להכפיל את הריכוז תא הסופי הרצוי (recommendable כ 4 x 106 תאים / mL).</li>
	<li>הכנס מספר הרצוי של תרביות רקמה מוסיף כל טוב של צלחת 6-טוב (אחד insert לכל כימוס).</li>
	<li>Sonicate הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1 כוח מרבי, RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה, המקום µL 40 של התליה תא (להשיג ב- 2.3) עבור כל כימוס הרצוי ובנוסף כ- 10 – 15% נפח נוסף לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה רגילה.</li>
</ol>3. תלת-ממד תא כימוס לתוך לטמבלים
<ol><li>לערבב של נפח שווה RAD16-אני הפתרון ב 10% סוכרוז (w/v) (40 µL לכל כימוס) עם אמצעי אחסון שווה של התליה תא (40 µL לכל כימוס) מוכן בשלב 2 כדי לקבל השעיה של תאים ירידה בריכוז פפטיד הרצוי (ב 10% סוכרוז). מערבבים על-ידי pipetting באיטיות לאורך כ 10 פעמים. למנוע היווצרות בועה במהלך ערבוב. הערה: שלב זה הוא קריטי, חייב להתבצע בזהירות רבה מאז התאים נמצאים בתנאים עוינים עקב פפטיד pH נמוך (כ 3.5-4.0).</li>
	<li>שימוש של micropipette, טען בקפידה µL 80 של ההשעיה כל הוספה.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ"ל של תרבות התקשורת לתחתית הבאר להרטיב את הכנס רפידה, המאפשר תקשורת דיפוזיה לקדם פפטיד הרכבה עצמית ויצירת הידרוג. תן את פפטיד ג'ל למשך כ 20 דקות בארון זרימה. הערה: המניפולציה של הדגימות במהלך הגדרת זמן יכול להסתיים שבירת ג'ל.</li>
	<li>לאט לאט להוסיף 40 µL בינוני הכנס ולתת לו להחליק החומה הפנימית לג'ל. הערה: בדרך כלל, הטעינה של אמצעי אחסון זה צריך לקחת בין 20 – 30 s.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) במשך 20 דקות. זה שלב ותוספות בינוני רצופים יעדיפו שטיפת של סוכרוז, equilibration של תאים עם תרבות בינוני.</li>
	<li>להוסיף µL 60 בינוני החומה הפנימית של הקדמי, ולאפשר לו לזרום מטה לאורך הקיר. האחות המדיום של הבאר, שהינו עשיר סוכרוז, ולהוסיף 0.5 מיליליטר בינוני טריים.</li>
	<li>להוסיף µL 60 בינוני לאט הכנס ולמקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) למשך 10 דקות.</li>
	<li>האחות המדיום היטב ולהוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים לתוך הבאר. להוסיף 200 µL בינוני תותב. מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) כדי לשמור את התאים בתנאים המתאימים.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל יום. הסר את המדיום הישן מתחתית הבאר. להוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים µL טוב ל- 200 הכנס. הערה: אם תאית התמיינות נמשכת, התקשורת inducing ספציפיים יתווספו התרבויות, וכתוצאה מכך המחויבות סוג התא הרצוי (ראה להלן, תא בידול).</li>
</ol>4. תא הכדאיות ב- 3D-לטמבלים
<ol> <li>הערה: תא הכדאיות וזמינותו ידועה בשם המתים/Live — הכדאיות/Cytotoxicity assay גם כן.</li>
	<li>בשפופרת 15 מ"ל, להכין את אמצעי האחסון הדרושים של פתרון טריים של calcein מיקרומטר 2 בבוקר ו- 2 מיקרומטר של אתידיום homodimer-1 (EthD-1) ב- PBS מאת vortexing עבור 10 ס' לשמור בחושך. הערה: עוצמת הקול כדי לשמש עבור כל דגימה יהיה תלוי בגודל טוב על פי האפשרויות הבאות: mL 2 עבור כל טוב של צלחת 6-multiwell; 1 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 12-multiwell ו- 0.5 מ עבור כל טוב של צלחת 24-multiwell.</li>
	<li>שימוש של micropipette, לשטוף את הדגימות 3D-לטמבלים 3 פעמים עם 2 מ"ל ל- PBS, ואז, לכסות את זה עם הפתרון המוכן בשלב 4.1. תקופת דגירה זה ב RT של 40 דקות בחושך.</li>
	<li>שימוש של micropipette, יש לשטוף את בונה עם 2 מ של PBS 5 פעמים.</li>
	<li>דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות 10 X או 20 X הגדלה.</li>
</ol>5. תאית התמיינות
<ol><li>התרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) ב Chondrocyte הבזליים בינוני (CBM) עם צמיחה תוספי. הערה: הכנת המדיום מתואר בהוראות היצרנים (ראו טבלה חומרים).</li>
	<li>זירוז תאית התמיינות ביום 2 עם chondrogenic בינוני המכיל רקומביננטי האדם צורה של גורם גדילה-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), חומצה אסקורבית L 2-פוספט [AA2P] (25 µg/mL), דקסמתזון (100 ננומטר).</li>
	<li>לשמור על התרבות 4 שבועות באינקובטור עם אווירה humidified-CO 37 ° C ו-5%2. שינוי chondrogenic בינוני בכל יום אחר.</li>
</ol>6. טולדין כחול (TB) מכתים
<ol><li>לשטוף את התרבויות 3D-לטמבלים פעמיים על-ידי הוספה והסרה ואז 2 מ של PBS עם micropipette. לתקן אותם על-ידי הוספת 2 מ של 2% (w/v) p-פורמלדהיד ב- PBS עבור 2 h-RT.</li>
	<li>לשטוף פעמיים עם 2 מ של 0.1% X-100 Triton ב- PBS (PBST).</li>
	<li>דגירה 2 מ של טרה-בתים 0.05% במים למשך 20 דקות ב- RT.</li>
	<li>לשטוף מספר פעמים (לפחות 3 פעמים) עם 2 מ של PBS עד הפתרון PBS הוסר ברור.</li>
	<li>ניתוח דוגמאות על ידי בדיקה חזותית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי11,13,14. הערה: טרה-בתים יוצרת קומפלקסים עם glycoconjugates anionic-מטריצה חוץ-תאית, כגון proteoglycans (עמוד), glycosaminoglycans (איסור פרסום), אשר מופרשים בעיקר על ידי תאים, כמו chondrocyte. דוגמאות חיוביות הן מוכתם כחול.</li>
</ol>7. תספיג חלבון
הערה: ההליך בשימוש פרוטוקול זה תוארה בעבר התייחסות11.
<ol><li>Lyse 3D-בונה ב ריפה מאגר המכיל פרוטאז מעכב קוקטייל על-ידי pipetting.</li>
	<li>הכנת ג'ל אקרילאמיד בהתאם לדרישות של אמצעי אחסון ג'ל (של ציוד ריצה ג'ל ספציפי) ולהפעיל את lysates תא במשך 90 דקות ב 150 V16. הערה: ג'ל אקרילאמיד מוכן בדרך כלל בריכוז של 7.5-10% (w/v), תלוי משקל מולקולרי של החלבון.</li>
	<li>העברת החלבונים הכלול את הג'ל לתוך קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על-ידי החלת ארבעים V 2 h-RT.</li>
	<li>דגירה קרום PVDF-RT עבור 2 h במאגר חסימה (4% (w/v) ללא שומן אבקת חלב ב- PBST) במיכל נפרד עם נפח מספיק כדי לכסות את הקרום.</li>
	<li>דגירה הקרום-RT מאובטח עם נוגדנים ראשי-ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב- PBST. עיין בטבלה חומרים.</li>
	<li>להוסיף נוגדנים משניים ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. ראו טבלת חומרים.</li>
	<li>הכינו את הקרום לגילוי hP עם המצע Chemiluminescent16. עיין בטבלה חומרים.</li>
	<li>קח תמונות chemiluminescent16.</li>
</ol>

<ol><li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9069283">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric β-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Can we build artificial stem cell compartments?</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li>
<li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization%3A+implications+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li>
<li>Genové, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li>
<li>Garreta, E., Genové, E., Borrós, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li>
<li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptides%3A+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li>
<li>Hernández Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li>
<li>Castells-Sala, C., Martínez-Ramos, C., Vallés-Lluch, A., Monleón Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li>
<li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile%2C+soft%2C+self-assembling%2C+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abellà, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+%28%CE%B5-Caprolactone%29%2FSelf-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (ε-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472(2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603(2016).</li>
<li>Aloy-Reverté, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+blotting+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבר, הקבוצה שלנו ואחרים תיארו את השימוש פלטפורמות תרבות תלת מימדי (3D) עם תא מגוון מערכות3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים שיטה קלה ומהימנה של קבלת התרבות 3D תאי גזע מערכות המתאימים לכל סוג של תאים בתרבית של כולל לכל סוג של תא פונקציונלי, עובריים או למבוגרים, או בסופו של דבר, תאים מתפקדות מבודד ביופסיות או גידולים, וכן הלאה. בנוסף, באופן עצמאי, אם בתאי גזע עובריים או מבוגר המקור יהיה להם קיבולת מחויבות שושלת היוחסין טוב יותר בסביבת 3D מאשר התרבות הקלאסית 2D מנות10,11,12, 13,14,15. לכן, התרבות תאים במערכת זו תוביל בידול לתוך מבנים דמויי רקמה תפקודית שיכול לשמש ביישומים שונים, מן וההתערבות תיקוני או משובי כדי רעילות פלטפורמות תרופתי.
הראו לנו רווח ברור בתפקוד התא. כי microenvironment תאית דומה לזה של רקמות טבעי מבחינת מבנה מטריצה של ביו-מכני, biophysical, ביולוגי פרמטרי. יחד עם זאת, המערכת הופך מורכב יותר, מספר הפרמטרים שצריכים להיות מוסדרים גם עליות, אשר כוללת את הצורך פלטפורמה התומכת חיצוניים (כגון מערכת זלוף פעיל כדי למנוע בעיות תופעות הקשורות בהעברת המוני ). תאים בתרבית three-dimensionally לבצע טוב יותר מבחינת וויסות פעולות חיוניות, כגון העברה, התפשטות, בידול. הם יכולים יוצרים רשתות מורכבות ומאפשר crosstalk הסלולר משופרת, וזה עד כה חיוניים תולדה של וגדל המבדילים ב- 3D. העובדה כי הורס יכול ליצור תנאים במבחנה דומה מייצג חלבונים אלה מטריצה חוץ-תאית יתרון שכן מחקר רציונלי של האפקט הפיק עבור כל רכיב המתווסף לגרדום (פקטורי גדילה, רב-סוכר או איתות פפטיד) יכולים להיות מועברים בקלות.
היתרונות ברורים של השימוש של אידיוטים בהשוואה פיגומים טבעיים אחרים, כגון קולגן מסוג I ו- Matrigel, הם הבאים: 1) לטמבלים הוא biomaterial סינתטי עם וריאציה מינימלי של אצוות ייצור אצווה; 2) לטמבלים יש את היכולת להיות functionalized עם מוטיבים פפטיד ספציפי; ו 3) מתנות לטמבלים נמוך biodegradability במבחנה, דבר המאפשר שמירה על הבונה 3D עם אותם מאפיינים biophysical, ביו-מכני, מבניים לאורך זמן. עם זאת, המגבלה של שימוש הורס לעומת אחרים פיגומים נמצאו במהלך השלב כימוס, שבו התאים נמצאים סביבה עוינת בשל ה-pH נמוך. לכן, זה צעד קריטי המתודולוגיה המתוארת. יתר על כן, חשוב לקבוע ריכוז לטמבלים עבור כל סוג תאים מסוים לפני התחלת כל ניסוי. זה חיוני, למעשה, כאשר תאים מתורבתים או לתוך אלה biomaterials, מאז כל סוג לתא מסוים יציגו תנאי הגידול biomechanical אופטימלית.
לבסוף, אנו מאמינים פבריקציה נוספת לסוג זה של biomaterial לגרדום ועיצוב לשפר את פיתוח מודלים 3D רקמות פיזיולוגיים ואמין יותר כדי לעזור תעשיית התרופות לפתח גישות טיפוליות טוב יותר עבור רפואה רגנרטיבית, סרטן או כל טיפול רפואי.

במשך עשורים רבים, תרבית תאים בתרבית של בוצעה בתנאים ניסיוני באמצעות מערכות התרבות הקלאסית דו-ממדית (2D) עקב בעיות מעשיות וכלכליים בין ההיבטים הלא-פיזיולוגיים. למרות מערכת תרבות זו מסייעת ללמוד ולהבין מנגנונים מולקולריים וסלולריות ביותר, אנו יודעים היום פרדיגמות חדשות של התרבות תאים נדרשים ללמוד מערכות סלולריות מורכבים יותר. לכן, מערכות תלת מימד (3D) התרבות הן במקרה הצורך, כדי לשחזר את microenvironment biophysically, biomechanically וביולוגית דומה יותר לזה של רקמות טבעי. בשנים האחרונות, מערכות התרבות תלת-ממד, באופן כללי, הפכו להיות נפוץ יותר בקרב חוקרים והתעשייה מאז שהם מייצגים, מודל חדש של מחקר או הקרנה אילו תאים יכולים לגדול בחלל, ליצור לתא או תא-כדי-מטריקס אינטראקציות, העברה, בסופו של דבר להבדיל לתוך שושלות תאים מסוים.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לשחזר במבחנה הסלולר microenvironment כי הוא קרוב יותר microenvironment ויוו . בפרט, לגרדום פפטיד עצמית וההספק סינתטי (לטמבלים) הוא סוג של biomaterial עם מאפיינים ייחודיים; היא יוצרת רשת של נקבוביות בגודל ננומטר עשוי חלש אינטראקציות בין פפטידים בעלי תכונות מכניות ומבניים דומים לאלה של מטריצה חוץ-תאית טבעיים. במילים אחרות, הרציונליות מאחורי השימוש בחומר זה הוא שיוצר באמת 3D-סביבה זה הינו אידיאלי עבור קבלת מדומה 3D הרקמות או האיברים יחידות. עם זאת, והכי חשוב, ההקשר 3D מאפשר את מבנה תלת-ממד להשיג תפקודים ביולוגיים חדשים שאינם בדרך כלל נוכח התרבות 2D פלטפורמות, כגון מאפיינים הקשורים רקמות אדריכלות, תופעות העברה המונית, תא המתבנת ובסופו של דבר מורפוגנזה רקמות, אשר הם גורמי מפתח להמשך המחקר ופיתוח של רקמות פונקציונלי ואת האיברים1,2. יתר על כן, היתרון לטמבלים מעל עמיתיהם טבעי (קולגן, Matrigel) הוא שהם יציבים מאד בטמפרטורת החדר ו אינם דורשים תנאים מיוחדים עבור פוסט-פרודקשן, הפצה או אחסון3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. לטמבלים קל לטפל, בעת הצורך; ג'לים 3D ניתן להשיג בפשטות על ידי הגדלת כוח יונית, או על-ידי התאמת רמת ה-pH נייטרליות1,2. לבסוף, המתודולוגיה המתוארת כאן כבר בשימוש נרחב במבחנה לקידום וצמיחה, תחזוקה, של בידול של מספר סוגי תאים, כולל chondrocytes, hepatocytes, תאי אנדותל, תאי העצם, כמו גם תאים עצביים תאי גזע עובריים וגופניות3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים את השימוש של מערכת תלת-ממד-תרבות להבדיל בין האדם chondrocytes במפרק המורחב (הע ח) לתוך רקמות הסחוס דמוי כפי שתואר לעיל11.
כאן, מתוארת שיטה התרבות תאים במערכת תלת-ממד באמצעות אידיוטים. ב הזה biomaterial סינתטי, התאים מעורבבים קודם עם פתרון פפטיד, אשר כתוצאה מכך מושרה להרכיב עצמית, יצירת רשת של מידות nanometric מסביב לתאים, ולכן יצירת סביבת 3D באמת (איור 1). חשוב לקחת בחשבון כי התנהגות הסלולר מושפע ערכים נוקשות מטריקס (קרי, הפצה, העברה ובידול). לכן, פקד מתודולוגי נפוצה היא התרבות תאים מעל לגרדום פפטיד עם אותם ערכי נוקשות (תרבות על שני ממדים).

<table><tbody><tr><td>כונדרוציטים מפרקיים אנושיים (Ach)</td>תמיסת פפטיד <td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I (PuraMatrix)</td><td>קורנינג</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז (דרגת תרבית רקמה)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף תרבית תאים (0.4 ומיקרו; נקבוביות, קוטר 12 מ"מ)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>כונדרוציטים בזאליים בינוניים (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth</td><td>Supplements Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>חי/מת חיות/ערכת ציטוטוקסיות</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה אסקורבית 2-פוספט (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה טרנספורמטיבי אנושי-ובטא; 1 (TGF-ובטא; 1)</td> <td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז ממברנת</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF)</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>אנטי קולגן I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>אנטי קולגן II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>אנטי קולגן X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>אנטי עז IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

טכניקה שימושית עבור culturing תאים עצמית וההספק nanofiber תלת מימד (3D) לפיגום מתואר. מערכת זו תרבות משחזר סביבה מקרוב מחקה את התכונות מבנית של הרקמה הלא מקוטב. יתר על כן, מבנה מסוים nanofiber מהותי לגרדום הופך שקוף לאור ויזואלי, המאפשר ויזואליזציה קל של הדגימה תחת מיקרוסקופ. יתרון זה שימש בעיקר ללמוד נדידת תאים, הארגון, התפשטות, ואת בידול ולכן כל התפתחות תפקוד התאים מסוים שלהם על ידי צביעת עם צבע מסוים או הגששים. יתר על כן, בעבודה זו, אנו מתארים את ביצועים טובים של מערכת זו ללמוד בקלות את redifferentiation של chondrocytes במפרק האנושי המורחב לתוך רקמות הסחוס. התאים היו מקופל לתוך עצמי בהרכבת פיגומים פפטיד, תרבותי בתנאים מסוימים כדי לקדם את chondrogenesis. תרבויות תלת מימדי הראו הכדאיות טוב במהלך 4 השבועות של הניסוי. כצפוי, דגימות תרבותי עם inducers chondrogenic (לעומת פקדים שאינם-induced) צבעונית מאוד חיובית טולדין כחול (אשר כתמים glycosaminoglycans (GAGs) כי הם מאוד נוכח מטריצה חוץ-תאית סחוס) והביע סמנים מולקולריים ספציפיים, לרבות קולגן סוג אני, II ו- X, על פי ניתוח המערבי כתם. פרוטוקול זה קל לבצע והוא יכול לשמש במעבדות מחקר, תעשיות, למטרות חינוכיות בקורסים מעבדה.

בשנת העבודה הנוכחית, פרוטוקול פשוט ומהיר לתאים תרבות תלת-ממד באמצעות לטמבלים מתואר כדי לקבל נתונים כמותיים אמינים. לטמבלים יוצר microenvironment תלת-ממד עם מאפיינים ייחודיים המאפשרים תאים בתרבית בתנאים הרצויים כדי להמשיך תחזוקה התא, הפצה ו/או בידול3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. בקבוצה שלנו, מספר מחקרים בוצעו באמצעות רקמת שומן אנושי הנגזר ובתאים (hAPC), chondrocytes במפרק האנושי המורחב (הע ח) ואנושי נורמלי עורי fibroblasts (hNDF) לתרבות, להרחיב, להבדיל אותם לתוך רקמת הסחוס כמו10,11,12. כאן, אנו מתארים את תרבות תלת-ממד, הבידול מחדש של האץ המורחב לתוך רקמות כמו סחוס, כפי שתואר לעיל11. לפיכך, אנו לתמצת התאים ב- 3D-לטמבלים, תרבות אותם במדיום אינדוקציה chondrogenic, כמתואר באיור 1 (ו בפרוטוקול). לאחר 24 שעות, הדגימות היו שקובעת הכדאיות עם וזמינותו הכדאיות/Cytotoxicity חי/מת. התוצאות מצביעות על אחוזים בודדים של תאים מתים (אדום) לאחר 5 ימים של כימוס, כמעט אין תאים מתים נצפו לאחר 4 שבועות של תרבות (איור 2). בשלב הבא, אנחנו מוכתם אותם גליקוזאמינוגליקן (איסור פרסום) להפקדה ב מטריצה חוץ-תאית באמצעות את טולדין כחול מכתימה את השיטה. כצפוי, הקבוצה אינדוקציה הגיב כראוי לטיפול, מראה חזק מכתים (איור 2).
לבסוף, סמנים מולקולריים של סמנים chondrogenesis ואת יתר, כולל קולגן מסוג I, II ו- X, נותחו על ידי תספיג חלבון (איור 3). סוג הקולגן שאני (COL1) נצפתה ב המערכות 2D and 3D אבל להקה התחתון של kDa ~ 130 (ייצוג החלבון COL1 בוגרת מעובד הניתנים להרכבה על מטריצות) נצפתה רק ב- 3D. תוצאה זו עולה בבירור כי תאים שעברו התמיינות בשלושה ממדים להמשיך בדרך יותר פיזיולוגית. למרבה הפלא, קולגן מסוג II (COL2) זוהה - כלהקה יחיד של מולקולרית המשקל הצפוי הנוכחי-מטריצה חוץ-תאית - רק ב מבנים תלת-ממד תרבותי בתנאים chondrogenic. לבסוף, קולגן מסוג X (COL10) התגלה ב- 2D ו- 3D בונה תרבותי בתנאים chondrogenic, המציינת מידה מסוימת של היפרטרופיה לאחר 4 שבועות של תרבות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של כימוס תא לתוך 3D-לטמבלים. ייצוג סכמטי העטיפה הע ח מתואר להשיג התאים התפזרו באופן אקראי בתוך 3D-הטיפשים. 1. הרכבה עצמית פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה; 2. התא הכנה ההשעיה; 3- 3D-תא כימוס לתוך אידיוטים. שימו לב כי התרשים מראה רק צעדים 3.1 ל 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> איור 2: תא chondrogenic וביצועים בידול בתרבויות 3D-לטמבלים. תא מכתים הכדאיות בנטילת 5 ימים ו- 4 שבועות של תרבות זוהה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (תאים חיים תאים מתים וירוק באדום). גודל ברים = 200 מיקרומטר. גנרל chondrogenesis מחויבות לאומדן טולדין כחולים מוכתמים (sulfated glycosaminoglycans בכחול) של מבנים תלת-ממד-לטמבלים בתרבית בתקשורת ובקרה chondrogenic. גודל ברים = 500 מיקרומטר. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> איור 3: קולגן, ביטוי II ו- X של האץ שעברו chondrogenesis. הע ח תרבותי של טפט-2D, 3D-לטמבלים לאחר 4 שבועות ב chondrogenic מדיה ופקדים היו שקובעת את הביטוי של קולגן מסוג I (COL1), קולגן מסוג II (COL2) ו קולגן מסוג X (COL10). הביטוי אקטין שימש של בקרה פנימית. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח, כגון כיצד תאים מתנהגים במיקרו-סביבה תלת מימדית, אינטראקציה בין תא לתא, כיצד הם מתרבים, נודדים, מתמיינים ויוצרים רקמות פונקציונליות. טכניקה זו היא יתרון, מכיוון שהיא יוצרת מיקרו-סביבה תאית קרובה יותר לתנאים פיזיולוגיים. מי שתדגים את ההליך תהיה נאוסיקה בטריו, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.ההשלכות של השיטה משתרעות על טיפול ברקמות פגועות, שכן ניתן להשתמש בה כדי להשיג מקבילות רקמות לרפואה מתקנת או רגנרטיבית. ניתן ליישם את השיטה גם על מערכות אחרות, כגון מודלים של גידולים, סוכרת או מחלות ניווניות. כדי להתחיל, הכינו 500 מיקרוליטר של תמיסה של 0.5% של פפטיד RAD16-I בסוכרוז של 20% משקל בנפח בצינור מיקרוצנטריפוגה.סוניקציה של התמיסה באמבטיה אולטרסאונד בעוצמה מקסימלית למשך 20 דקות. לאחר מכן, יש לדלל 300 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד שהוכנה בעבר עם 200 מיקרוליטר של 10% סוכרוז כדי לקבל 500 מיקרוליטר של 0.3% תמיסה של פפטיד RAD16-I. לאחר מכן, הנח את צינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל את תמיסת הפפטיד לאמבטיה אולטראסונית בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.לאחר מכן, צנטריפוגה את מתלה התאים שהוכן בעבר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה פסטר המחוברת לקו הוואקום, הסר את הסופרנטנט. הוסף שני מיליליטר של 10% סוכרוז לגלולת התא.לאחר מכן, השתמש במונה תאים ידני כדי לספור את התאים. לאחר השעיית התאים, צנטריפוגה את תרחיף התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט, והשהה את כדור התא בנפח הדרוש של 10% סוכרוז כדי להשיג את הריכוז הרצוי של ארבעה מיליון תאים למיליליטר.לאחר מכן, סוניקציה של תמיסת הפפטיד שהוכנה בעבר באמבטיה האולטרסאונד בעוצמה מקסימלית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים תוספת תרבית רקמות בכל באר של צלחת שש בארות. לאחר מכן, מערבבים 120 מיקרוליטר של תמיסת RAD16-I עם נפח שווה של תרחיף תאים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה.מערבבים לאט, הימנעות מהיווצרות בועות, על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא ערבוב תאים עם תמיסת פפטיד. חשוב להיות עדין במהלך הערבוב, לאט, כדי למנוע היווצרות בועות, על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפטה, טען 80 מיקרוליטר של ה-RAD16-I ותערובת תרחיף התאים לכל תוספת. העמסת 80 מיקרוליטר של ה-RAD16-I ותערובת תרחיף התאים לכל תוספת צריכה להתבצע במהירות. הוסף 500 מיקרוליטר מדיה לתחתית כל באר כדי להרטיב את קרום ההכנסה.הניחו לפפטיד לצבוע ג'ל במשך 20 דקות בארון הזרימה הלמינרית. הוספת 500 מיקרוליטר מדיה לתחתית כל באר כדי להרטיב את קרום ההכנסה תקדם היווצרות ג'ל ואיזון תרבית תלת מימד עם מדיה. לאחר 20 דקות, הוסיפו 40 מיקרוליטר של מדיום לתוספת לאט מאוד, ותנו לו להחליק במורד הקיר הפנימי אל הג'ל.לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר השלמת הדגירה, הוסף 60 מיקרוליטר של מדיום לקיר הפנימי של התוסף, ואפשר לו לזרום במורד הקיר. לאחר מכן, שאפו את המדיום העשיר בסוכרוז מהבאר, והוסיפו 500 מיקרוליטר מדיום טרי.לאחר מכן, הוסף 60 מיקרוליטר של מדיום לתוספת. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו את המדיום מהבאר.הוסף 2.5 מיליליטר מדיום טרי לבאר ו -200 מיקרוליטר מדיום לתוספת. דגרו את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את בדיקת כדאיות התא, הכינו תמיסה של שני קלצאין מיקרו-מולרי AM ושני מיקרו-מולרי אתידיום הומודימר-1 ב-PBS בצינור של 15 מיליליטר.מערבולת למשך 10 שניות, ומכסים את הצינור בנייר אלומיניום. לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפטה, שטפו את דגימות ה-3D-SAPS בשני מיליליטר PBS שלוש פעמים. הוסף את תמיסת ההומודימר של סידן/אתידיום מעל הדגימות.לאחר מכן, מכסים את הדגימות בנייר אלומיניום, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. לאחר השלמת הדגירה יש לשטוף את המבנים בשני מיליליטר PBS חמש פעמים. לבסוף, דמיין את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הגדלה של פי 20.בפרוטוקול זה מתוארת שיטה פשוטה ומהירה לתרבית תאים בתלת מימד באמצעות SAPS. בדיקת כדאיות התא לאחר היווצרות מבנה תלת מימד מתארת מעט תאים מתים, כפי שמודגם על ידי תאים שנצבעו באדום לאחר חמישה ימים של אנקפסולציה. לאחר ארבעה שבועות של תרבית, כמעט ולא נצפים תאים מתים.סמנים מולקולריים לכונדרוגנזה והיפרטרופיה מנותחים על ידי כתם מערבי. פס הקולגן מסוג 1 נצפה במערכות דו-ממדיות ותלת-ממדיות כאחד. עם זאת, הרצועה התחתונה המייצגת את חלבון הקולגן המעובד והבוגר נצפית רק במערכת התלת מימדית, מה שמעיד על התמיינות בתלת מימד מתקדמת בצורה פיזיולוגית יותר.נוסף על כך, קולגן מסוג 2 מזוהה רק במבנים תלת-ממדיים. קולגן מסוג 10 מזוהה הן במבנים דו-ממדיים והן בתלת-ממדיים, מה שמעיד על מידה מסוימת של היפרטרופיה לאחר ארבעה שבועות של תרבית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עטיפת תאים תלת מימדית מסוג קולגן מסוג 1 על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו התנהגות תאים בפיגום מתכלה טבעי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג את התרבית התלת מימדית שלך של סוג התא הרצוי. אל תשכח שעבודה עם תאי סרטן אנושיים עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש במתקנים מסוג בטיחות ביולוגית וידע בעבודה בתנאים סטריליים, בעת ביצוע הליך זה.

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים מיקרו bioreactors. אחת שבב יכול בית עד 10 Mio. תאים שיכולים להיות מעובדים בתנאים מוגדרים במדויק לגבי זרימת נוזלים, מתח וכו 'חמצן בלולאה, סטרילי במחזור סגור.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

כאן אנו מתארים את השימוש של הרכבה עצמית 3 ממדי הפיגום לתרבות תאים אנושיים אבי עצביים. אנו מציגים פרוטוקול לשחרר את התאים מן הפיגומים כדי להיות מנותח למשל לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. פרוטוקול זה עשוי להתאים סוגי תאים אחרים לבצע מחקרים מפורטים באופן מכניסטי.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

סרטון זה מציג את יצירתו של מודל רקמה עצבית מקוטבת תלת-ממדית באמצעות פיגומים משי-קולגן. הוא מפרט את תהליך זריעת התאים העצביים על פיגומי משי נקבוביים, דגירה לחיבור תאים, הטבעה של הפיגום בקולגן, ומדגיש את חשיבותה של מטריצת הקולגן התומכת ביצירת מודל רקמה עצבית מקוטבת תלת-ממדית.

פיתוח מודל תלת-ממדי מבוסס משי מבוסס קולגן של רקמה עצבית מקוטבת

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

תובנה לגבי הפעולות המורכבות של המוח דורשת כלי מחקר מתקדמים. כאן אנו מדגימים מודל תלת מימדי חדש מבוסס משי-קולגן של רקמה עצבית הדומה לארכיטקטורה דמוית מוח. המודל יכול לשמש לחקר הרכבת רשת עצבית, הנחיה אקסונלית, אינטראקציות תא-תא ופעילות חשמלית.

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D

תרבית תלת מימדית בחרוזי אלגינט, בשל פשטותה ויכולת השחזור שלה, נבחרה כדי לשמור על תאי אדנומה של יותרת המוח. ההליכים כללו עיכול אנזימטי ראשוני ודיסוציאציה מכנית של רקמת הגידול, והשעיית התאים שלאחר מכן נעטפה בחרוזי אלגינט.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

מזעור השונות בשבר החלקיקים בתוך פיגומים גרעיניים מקל על ניסויים הניתנים לשחזור. עבודה זו מתארת שיטות ליצירת פיגומים גרעיניים עם שברי חלקיקים מבוקרים עבור יישומים של הנדסת רקמות במבחנה .

שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית

במאמר זה אנו מדגימים כיצד תאי אפיתל שגודלו בתרבית עם פיברובלסטים במערכת הדו-שכבתית המבוססת על קרום ננו-סיבי יכולים להיצמד ביציבות לקרום ולגדול עליו.

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

למד שיטה לתרבית תאים בתלת מימד באמצעות פפטידים המתארגנים עצמאית לפיגומים. הטכניקה מחקה תנאים פיזיולוגיים ומאפשרת הבנה מעמיקה של התנהגות תאים והנדסת רקמות.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

גלה סרטונים נוספים