בידוד ואפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מדגימות Bioptic Endomyocardial של שריר הלב Arrhythmogenic חולים

המטרות הכוללות של פרוטוקול זה הן לבודד תאי סטרומה מזנכימליים לבביים מחולי קרדיומיופתיה הפרעת קצב, לבדוק את יכולת ההתמיינות האדיפוגנית שלהם ואת הפנוטיפ של סמני פני השטח שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקרדיומיופתיה הפרעת קצב, כגון מעורבות של תאי סטרומה לבביים בהחלפת אדיפו והדגשת מנגנונים מולקולריים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע בידוד של תאי סטומה עם מעט מעברים פשוטים מדגימות לב קטנות מאוד.

אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחקר קרדיומיופתיה הפרעות קצב. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון חקר מחלות לב וכלי דם שעבורן מסומנת ביופסיה אנדומיוקרדיאלית. לראשונה חקרנו את הרעיון לשיטה זו כאשר הבנו שאנו יכולים להקטין את הליך בידוד תאי הסטומה כדי ליישם אותו על ביופסיות לב והאלקטרופיזיולוגיה שהוא יכול לספק לנו.

לצורך פרוטוקול זה, אסוף ביופסיה אנדומיוקרדיאלית מהחדר הימני של חולה ACM באמצעות מיפוי אלקטרואנטומי משולב ופלואורוסקופיה לבבית. קח כחמישה גרם של רקמה ושלח אותה למעבדה במדיום TMES. במעבדה, הקימו את ארון הבטיחות הביולוגי לפי הצורך כדי לבצע את ההליך עד לעיכול האנסומטי.

לאחר מכן העבירו את הביופסיה לצלחת ושטפו אותה פעמיים עם PBS. בשלב זה, ניתן לתעד את הביופסיה במיקרוסקופ. לאחר מכן, העבירו את הביופסיה לשפופרת של שני מיליליטר המכילה מיליליטר אחד של תמיסת הקולגנאז.

שם, חותכים את הדגימה לשברים קטנים, ברוחב שבין 0.5 למילימטר אחד. לאחר מכן דגרו על הרקמה למשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסתובבת מתמשכת. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה המעוכלת, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS.

לאחר מכן צנטריפוגה שוב את הצינור, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של TMES. כעת צלחו את המתלה על צלחת של 60 מילימטר ומלאו את הצלחת עד שלושה מיליליטר באמצעות TMES, אך לא מעבר לכך. לאחר מכן תרבית והרחבת התאים על פי פרוטוקול הטקסט.

לפני שמתחילים, הכינו את מגיב הדיסוציאציה של התאים, את מאגר הכביסה ואת הנוגדנים הנדרשים לשימוש. כאשר מספר התאים המשוער של התרבית מגיע לשלושה מיליון, יש לשטוף את צלחת ה-100 מילימטר פעמיים עם 10 מיליליטר PBS סטרילי. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים לתאים ודגר את הצלחת למשך שבע עד 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק את התאים.

לאחר ניתוק התאים, הוסף 15 מיליליטר PBS לתאים והעביר את התרחיף לצינור של 50 מיליליטר. כעת, צנטריפוגה את התאים והשעיה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר כביסה. לאחר מכן ספרו את התאים והעבירו שלושה מיליון לצינור חדש בנפח סופי של 1.5 מיליליטר של מאגר כביסה.

לאחר מכן, פצל את המתלה ל-12 צינורות פקס. לכל שפופרת, הוסף נוגדנים המשמשים לאפיון CMSCs בריכוזים המומלצים. הקפד לכלול את בקרות האיזוטיפ.

לאחר ההכנה, דגרו את הצינורות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור. מאוחר יותר הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לכל צינור כדי לעצור את התגובות. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים, הסר את הסופרנטנט ותלה מחדש את הכדורים ב-250 מיקרוליטר של מאגר כביסה.

כעת המשך לאפיין את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר התמיינות אדיפוגנית של התאים, השתמש בצביעת ORO כדי לבדוק הצטברות שומנים. לפני שמתחילים, הקפד על פתרון עבודה של OR.

לפני צביעת התאים, הסר את המדיום ושטוף את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS. לאחר מכן מכסים את התאים ב-4% פרפורמלדהיד ונותנים להם להתייצב במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את הפרפורמלדהיד ושטפו את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS.

לאחר הכביסה השנייה הוסף מספיק תמיסת עבודה ORO כדי לכסות את התאים. ואז דגרו את הצלחת למשך שעה בטמפרטורת החדר. דגירה זו חייבת להתבצע בסביבה בה הפתרון האוטומטי לא יפעל, ולכן חדרים מלאים אינם מומלצים.

לאחר הדגירה יש לשאוב את תמיסת ה-ORO ולשטוף את התאים בשני מיליליטר PBS מספר פעמים עד שלא ניתן לראות את הכתם בשטיפת ה-PBS ועד שכאשר מסתכלים במיקרוסקופ לא מתגלה כתמים לא ספציפיים. כעת, באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות שלב תרבית רקמה הפוכה, צלם 20 תמונות של כל באר בהגדלה של פי 20. הפרטים מסופקים בפרוטוקול הטקסט.

CMSCs בודדו מביופסיות אנדומיוקרדיאליות כמתואר. כדי לאשר את השושלת המזנכימלית שלהם, התאים הודגרו עם נוגדנים מצומדים פלורופורים מתאימים ונותחו על ידי זרימה ציטומטרית. ה-CMSCs היו חיוביים לאנטיגנים המזנכימליים הספציפיים CD29, CD44 ו-CD105.

ידוע כי חלק התאים החיוביים ל-CD90 משתנה. הסמנים למורשת האנדותל, מורשת מונוציטים או מקרופאגים, מורשת אונומטופואטית ועבור קומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרי לא באו לידי ביטוי. לאחר מכן, ה-CMSCs תורבבו במדיום T.ADIPO להתמיינות אדיפוגנית ונצבעו ב-ORO כדי לחפש טיפות שומנים תוך תאיות.

CMSCs מחולים עם קרדיומיופתיה הפרעת קצב צברו יותר טיפות שומן מאשר תאים מבקרות בריאות. הבדלים אלה נמדדו בתנאי התמיינות לאחר 72 שעות ושבעה ימים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את רזולוציית התא תוך שלוש שעות, ניתן לבצע את הצביעה תוך שעתיים, וניתן להשלים את ניתוח הפקס תוך שלוש שעות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת תרופות על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם אנו יכולים להשתמש בתאי סטומה מאותם מטופלים להגיב לגירויים שונים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הקרדיומיופתיה הפרעת קצב לחקור את מעורבותם של תאי סטרומה של לב אנושי בפתוגנזה של מחלות.