ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתפתחות הגנטית והנוירולוגית כגון במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בטכניקה פשוטה עם מכשיר תוצרת בית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שביצוע הזרקות ממוקדות למוח דורש תשומת לב מלאה לפרטים.

כדי להתחיל, הכינו מחזיק לשימוש בגורים יילודים במנגנון סטריאוטקסי. ראשית הכינו את מגש הראש. חתכו כ-1/5 מהחלק התחתון של צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר כדי ליצור פתח לראש של גור שזה עתה נולד.

לאחר מכן, בחר תיבת קצה פיפטה ריקה המתאימה לכן של המנגנון הסטריאוטקסי. לאחר מכן השתמש בדבק חם כדי להדק את מגש הראש לבסיס קופסת הקצה. לאחר מכן, הדביקו קלטת להטמעת רקמות על הקופסה שבה היא יכולה לתמוך בפלג הגוף העליון של הגור בזמן שראשו מקובע.

כעת הכינו מחטי נירוסטה בגודל 30 להזרקה. ראשית, נקו אותם מראש על ידי השרייתם בכלורופורם למשך שלושה ימים בבקבוקון זכוכית. שלושה ימים לאחר מכן, הסר בזהירות את המחטים ושטוף אותן באתנול מוחלט למשך 20 דקות ועם 50 סל"ד של תסיסה.

לאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים ב-70% אתנול למשך 10 דקות לכל שטיפה גם עם תסיסה. לאחר השטיפות, הניחו למחטים להתייבש באוויר ואחסנו אותן בקופסה נקייה בטמפרטורת החדר עד לשימוש. עבור מכלול המיקרו-הזרקה, השתמש בקטע של חמישה סנטימטרים של צינורות פוליאתילן PE20 כדי לגשר על צינור PE10 למזרק בגודל 26 של 10 מיקרוליטר.

אבטח את הצומת עם ציאנואקרילט. לאחר מכן, התקן את מחט ההזרקה החדשה בגודל 30 על הקצה השני של צינור PE10. כעת טען את מזרק המיקרו-הזרקה בנפח 10 מיקרוליטר.

הסר את הבוכנה והשתמש במזרק נוסף בגודל 25 כדי להעמיס בחזרה את המכלול במים מזוקקים אוטומטיים כדי להוציא אוויר מהצינור. לאחר מכן החזירו את הבוכנה למזרק המיקרוליטר ודחפו את הבוכנה עד שיישארו רק שני מיקרוליטרים של מים מזוקקים בחבית ולא פחות. לאחר מכן, הרכיב בזהירות את מזרק המיקרוליטר על משאבת המזרק של המיקרו-זרימה.

לאחר מכן פיפטה כמויות קטנות של צבע ירוק מהיר 0.1% מסונן בנוזלי הנגיף הניסיוני על פיסת פרפילם. כעת שאפו כמות קטנה של אוויר לתוך המזרק עד שנראית בועת אוויר בין מחט ההזרקה לצינור. לאחר מכן טען 0.7 מיקרוליטר של תמיסה ירוקה מהירה מסוננת כדי לבדוק את זרימת הנוזלים בצינורות המיקרו-הזרקה.

אם הזרימה טובה, שאפו עוד נפח קטן של אוויר כדי ליצור בועת אוויר שנייה ולאחר מכן העמיסו את תמיסת ההזרקה לתוך צינור המיקרו-הזרקה. חבר ואבטח את מחט המיקרו-הזרקה למנגנון הסטריאוטקסי והמשך בהזרקת המיקרו של העכברים היילודים. כהכנה לניתוח, נגב היטב את המכשיר הסטריאוטקסי עם 70% אתנול ועיקר את מכשירי הניתוח עם 70% אתנול.

לאחר מכן להרדים יילוד באמצעות היפותרמיה. הניחו את הגור בכפפת לטקס וטבלו אותו בקרח כתוש עד צווארו למשך חמש דקות. לאחר מכן צבטו את רגלי הגור במלקחיים כדי לוודא שאין רפלקס דוושה.

לאחר מכן, מקם את הגור עם הכפפה במגש הראש והניח מעט קרח כתוש סביב שרוול הלטקס כדי לשמור על הרדמת ההיפותרמיה. לאחר מכן שפשפו את ראשו של הגור באתנול 70% ואתרו את ציון הדרך של הלמבדה. סמן אותו בטוש.

לאחר מכן כוון את קצה המחט אל הלמבדה והגדר את הקואורדינטות הקדמיות/אחוריות והמדיאליות/רוחביות לאפס. לאחר מכן, בהתייעצות עם אטלס מוח, העבר את זרוע ההזרקה לאתר המטרה. לדוגמה, הסטריאטום של גורי P2 הוא 2.4 מילימטרים קדמיים ללמבדה, 1.0 מילימטרים משני צידי קו האמצע ו-1.7 מילימטרים גחוניים.

לאחר מכן, סמן את המיקום של צבע ירוק מהיר על צינור PE10 באמצעות עט. לאחר מכן התחל לאט לאט לחדור למחט דרך העור והגולגולת עד שקצה המחט נוגע במשטח הגולגולת. הגדר את הקואורדינטות הגביות/גחוניות כאפס.

לאחר מכן הורד את המחט לאט לאתר היעד. לאחר המיקום, המתן דקה אחת כדי לאפשר לפרנכימה לחזור לצורתה הרגילה. לאחר מכן הפעל את תוכנית המיקרו-הזרקה במהירות של 100 ננוליטר לדקה.

במהלך ההזרקה, צפו בצבע הירוק המהיר נע בצינור ה-PE. זה קריטי לחדור לאט למחט דרך העור והגולגולת עד שקצה המחט נוגע במשטח הגולגולת. במהלך ההזרקה, חובה לצפות בצבע הירוק המהיר נע בצינור ה-PE.

לאחר השלמת ההזרקה, המתן דקה אחת ולאחר מכן העלה לאט את המחט ל-1/2 מעומק ה-DV שחדר. לאחר מכן המתן עוד 30 שניות לפני שתמשיך במשיכה האיטית של המחט מראשו של הגור. לאחר השלמת ההזרקה, חשוב להמתין דקה אחת לפני העלאת המחט לאט לאט ל-1/2 מעומק ה-DV החודר.

לאחר מכן המתן עוד 30 שניות לפני שתמשוך לאט את המחט מראשו של הגור. לאחר הזרקת כל האתרים הממוקדים, חממו את הגור למשך 20 דקות באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס. בדקו את הגור כל חמש דקות עד שהוא חזר לשכיבה על עצם החזה.

לאחר מכן החזירו את הגור לסכר שלו. 200 ננוליטר של וירוס המבטאים רקומבינאז Cre DNA שהתמזג עם GFP הוזרקו לסטריאטום P2 של עכברי Ai14. עכברים אלה ביטאו את גן הדיווח tdTomato עם מחיקה בתיווך Cre של קלטת עצירה מאגפת loxP.

המוחות נאספו ב-P14 לצביעה חיסונית של GFP ו-tdTomato. תאים חיוביים רבים של GFP שהועברו AAV היו נוכחים בכל הסטריאטום, מה שמעיד על זיהום נרחב של תאים סטריאטליים על ידי נגיפי AAV EGFP Cre. ביטוי נרחב דומה של tdTomato נמצא גם בסטריאטום.

בבדיקה מיקרוסקופית בהגדלה גבוהה, נמצא בבירור שכל התאים הסטריאטליים החיוביים ל-GFP מבטאים במשותף את הגן המדווח tdTomato. יתר על כן, אותות tdTomato זוהו ככל הנראה במסופי אקסון בגלובוס פלידוס, ב-substantia nigra pars reticulata, אזורי המטרה של נוירוני הקרנה סטריאטוניגרליים וסטריאטופלידליים. יחד, תוצאות אלה מצביעות על רקומבינציה מוצלחת של DNA בתיווך Cre loxP המושרה על ידי ביטוי בתיווך AAV של פעילות Cre בנוירונים סטריאטליים בילודים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות להזרקת סטריאטל דו צדדית אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמדובר בניתוח מוח ילודים עדין הדורש סבלנות וזהירות. מהליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אופטוגנטיקה וכימוגנטיקה על מנת לנתח את ההתבגרות של במהלך ההתפתחות שלאחר הלידה.