Name: ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למד ניתוח סטריאוטקטי למניפולציה גנטית בתאי סטריאטום של עכברים נאונטליים באמצעות מכשיר ביתי. שיטה זו מאפשרת חקר מדויק של השפעות גנטיות על התפתחות עצבית מוקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע ולהעניק טכנולוגיה מעניקה MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, מכוני מחקר הבריאות הלאומי NHRI-EX106-10429NI, התוכנית מרכז מחקר אזורים נבחרים מענק משרד החינוך באמצעות מרכז מחקר המוח, האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג בטייוואן, ומענקים בתר MOST106-2811-B-010-031 (ס-ווי. סי), MOST105-2811-B-010-036, MOST106-2811-B-010-030 (ה-Y.K.).

הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של נבחרת יאנג מינג אוניברסיטת.
1. הכנה של בעל הגורים Neonatal במנגנון Stereotaxic
<ol><li>להפוך את המגש בראש: לחתוך התחתון של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL (15 מ מ אורך) לתוך הצורה שמתאימה לראש של הגורים neonatal על-ידי הסרת 1/5 של הקיר של הצינור.</li>
	<li>קח קופסא עצה פיפטה עם הגודל הנכון שמתאים בעזרת המעמד של המנגנון stereotaxic, להסיר את המכסה העליון. מוספית את מגש ראש המבושלות שלב 1.1 וקלטת ההטבעה רקמות על גבי הבסיס של עצה מגש עם דבק חם נמס. הגובה בקלטת ההטבעה הרקמה הוא 7 מ מ, אשר נמצא בשימוש כדי לתמוך הצוואר וגוף של הכלבלב בתפקיד ראש-קבוע.</li>
	<li>מקם את כל ההתארגנות מנגנון stereotaxic רגיל.</li>
</ol>2. הכנת 30G מחטים הזרקת פלדת אל-חלד
<ol><li>מחטים נקיות מראש של מזרק 30 G בהשריה ב כלורופורם 3 ימים.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים לסגת לאט ובזהירות את המחט מ שלה רכזת פוליפרופילן ברדס כימי.</li>
	<li>לשטוף את המחטים עם אתנול מוחלטת במשך 20 דקות ולאחריו שטיפות אתנול 70% 3 × 10 דקות על מטרף ב-50 סל ד. תנו לאוויר מחטים יבש, ולאחסן את המחטים נקי בתוך קופסה נקיים בטמפרטורת החדר (RT) עד השימוש.</li>
</ol>3. מכינים את מתאם עבור צינורות Microinjection
<ol><li>לחבר את המזרק microliter מחט ההזרקה 30G עם צינור פוליאתילן PE10 (PE10 tube). היכונו גישור המחט הזרקת ואת המזרק microliter מתאם אבובים (PE20 tube) PE20 פוליאתילן. השימוש המתאם הכרחי, מכיוון הקוטר של הצינור PE10 הוא קטן בהרבה מזה של המחט של המזרק microliter 26 גרם.</li>
	<li>להכין את הצנרור על המזרק microliter: לחבר את המחט הזרקת 30 G מראש נקי עם 5 ס מ PE20 צינור, ויסגור לצומת עם ודבק. מתאם אבובים הזה הוא לשימוש חוזר. הערה: אם המחט של מזרק microinjection 30 גרם, הכנה (שלב 3.1) והשימוש (שלב 3.3) מתאם זה אין צורך.</li>
	<li>םאתמה תא אבובים (להכין בשלב 3.1) בעזרת מזרק microliter (10 µL).</li>
	<li>חבר קצה אחד של הרכבת התחתית PE10 (לא יותר מ- 60 ס מ) על המחט 30 גרם של מתאם אבובים PE20. הר מחט ההזרקה 30G החדש אל הקצה השני של הצינור PE10.</li>
</ol>4. לטעון את הצינור Microinjection עם מים מזוקקים בלוק, צבען ווירוסים
<ol><li>הסר את הבוכנה של המזרק microliter. השתמש מזרק 25 גרם כדי לטעון את המזרק microliter ושפופרת שלה מחובר PE עם מים מזוקקים בלוק להסיר את האוויר הצנרת.</li>
	<li>מקם את הבוכנה בחזרה אל המזרק microliter ולאחר ללחוץ על הבוכנה עד µL 2 שרידי מים מזוקקים בקנה. אל תתנו הנפח של מים מזוקקים הפך נמוך יותר 2 µL.</li>
	<li>הר בקפידה את המזרק microliter אל משאבת מזרק קצב זרימת מיקרו.</li>
	<li>פיפטה כמויות קטנות של צבען 0.1% ירוק (מוכן ב- saline 0.9% וסינון במסנן מיקרומטר 0.22) ונוזלים וירוס בחתיכת עץ על מצלמות-מיקרוסקופים.</li>
	<li>תיסוג כמות קטנה של אוויר לחשיפה בועת אוויר בצומת בין מחט הזריקה 30 גרם שפופרת PE10 ואחריה טעינה 0.7 µL של ירוק מהיר המסונן לאמבטיה כדי לבדוק את זרימת הנוזלים על הצנרת microinjection.</li>
	<li>לסגת עוד כמות קטנה של אוויר כדי להפוך את בועת האוויר השני ואחריו העמסת נוזלים וירוס לתוך הצנרת microinjection.</li>
	<li>לצרף ולאבטח את המחט microinjection 30G את הזרוע של המנגנון stereotaxic.</li>
</ol>5. הרדמה של עכברים Neonatal מאת היפותרמיה
<ol><li>למקם את הכלבלב בשרוול כפפת לייטקס, לטבול אותו בקרח כתוש עד הצוואר למשך 5 דקות.</li>
	<li>לצבוט הרגליים של הכלבלב עם מלקחיים כדי לוודא כי אין תגובה משיכה של הרגליים.</li>
	<li>למקם את הגור עם כפפת לייטקס שרוול במגש הראשי, לשים קרח כתוש סביב שרוול גומי כדי לשמור אותה בקירור של היפותרמיה הרדמה.</li>
	<li>הוטרינר משחה למרוח את העיניים של גור למניעת יובש תוך בהרדמה במידת האפשר.</li>
</ol>6. microinjection
<ol><li>הכן ניתוח סטרילי על ידי ניגוב המכשיר stereotaxic ביסודיות עם 70% אתנול. לחטא את כלי כירורגי במועט אותם 70% אתנול.</li>
	<li>לנקות את הראש של הכלבלב עם 70% אתנול. לאתר של למדא ציון על הגולגולת ולסמן את למבדה עם עט מרקר. לכוון את מחט למדא, והגדר את הקדמי-אחוריים (AP) והקואורדינטות המדיאלי-לרוחב (ML) כאפס.</li>
	<li>להזיז את היד הזרקת לאתר היעד על פי הקואורדינטות X ו- Y של אתר היעד. עבור סטריאטום יום לאחר הלידה (P) 2 גורים, הקואורדינטות הן: AP, +2.4 מ מ, והשתרשה עמוק בלבה למדא; מל ', ±1.0 מ מ לרוחב מן האמצע; הגבי-הגחוני / (DV), −1.7 מ מ הגולגולת. לסמן את המיקום של צבע ירוק PE10 צינור עם עט.</li>
	<li>להפיל את המחט הזרקת 30G לאט לחדור דרך העור הגולגולת ולאחר מכן להעלות קצה המחט עד לעצירתו על פני השטח של הגולגולת. הגדר הקואורדינטה DV כאפס.</li>
	<li>להפיל את המחט הזרקת 30G באיטיות עד שהוא מגיע הקואורדינטה DV אתר היעד. המתן 1 דקות לאפשר parenchyma חידוש צורתו נורמלי. הפעל את התוכנית microinjection (nL 100 לדקה).</li>
	<li>ודא כי הסימן של צבע ירוק הוא נע צינור PE כדי להבטיח שהנוזל הוירוס מוזרק לתוך המוח.</li>
	<li>המתן 1 דקות םכסהה microinjection, ולאחר מכן לאט, בהדרגה להעלות את המחט לגובה 1/2 של DV עומק בתוך 30 s. לאחר 30 s, לאט לאט למשוך את המחט מהראש של הגורים.</li>
	<li>חזור על שלב 6.2 ל 6.7 עד השלמת את microinjections של כל אתרי יישוב.</li>
</ol>7. ההחלמה שלאחר הניתוח של הכלבלב
<ol><li>לחמם הגורים למשך 20 דקות בחממה 33 מעלות. בדוק את ההתאוששות של הכלבלב מהרדמה היפותרמיה כל 5 דקות עד הכלבלב שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.</li>
	<li>להחזיר את הכלבלב בחזרה אל הסכר אחרי הכלבלב הוא התאושש לחלוטין.</li>
</ol>

<ol><li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li>
<li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+of+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li>
<li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+neurodevelopmental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li>
<li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+circuits%2C+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li>
<li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Bull%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatal+mosaic%3A+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuit%22%5BJournal%5D)">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר הנוכחי, נדגים שיטה פשוטה ואמינה stereotaxic עבור הזרקת AAV וירוסים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. אנחנו microinjected AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים כתב Ai14-P2 ולאחר מכן נותחו בביטוי הגן כתב ב P14. מצאנו ש-AAV transduced תאים GFP-חיובית לאורך כל סטריאטום ברמות rostrocaudal. יתר על כן, כמעט כל התאים GFP-חיובית משותפת הביע הגן כתב tdTomato בתאים striatal, רומז על רקומבינציה Cre-loxP DNA מוצלחת המושרה על ידי ביטוי בתיווך AAV Cre פעילות. אנחנו עוד יותר לאשר את היעילות של גישה זו microinjections של ...

מחקרים מודרניים של המבנה והתפקוד של המוח בדרך כלל דורשים מניפולציה גנטית של גנים ספציפיים בתוך תאים עצביים. כדי לחקור את הפונקציות של גנים שונים, העכברים הטרנסגניים נושאת אללים mutant, כולל נוק אאוט, טוק-in אללים באופן שגרתי נוצרו. ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים היא שיטה סטנדרטית מקומית לספק סמים, וירוסים, המשדרים, אחרים אזורים ספציפיים של המוח מכרסמים1,2. החלת ניתוח מוח stereotaxic את העכברים הטרנסגניים מתיר אחד גנטית לתפעל את תפקוד הגן ואת פעילות. עצבית באוכלוסיות ספציפיות עצביים במוח העכבר. המניפולציה ייחודיים לסוג התא מספקת גישה רב-עוצמה לפענח עצביים פונקציות מורכבות את המעגלים העצביים של המוח3,4,5.
התפתחות עצבית של מערכת העצבים מתחילה אצל בשלבים עובריים מוקדמים ולהמשיך התהליכים התפתחותית לאחר הלידה עד תקופת ילדותי. כמחנכת ההבשלה של מערכת העצבים כולל את החיווט סינפטית מדויק של המעגלים העצביים, שהוא חיוני עבור פונקציות פיזיולוגיים, קוגניטיביים של המוח6. לכן, לימוד התפתחותית אירועים שמתרחשים בחלונות זמן neonatal חשוב לא רק להבנת התפתחות עצבית רגילה, אך זה עשויים גם כן לספק תובנות בפתוגנזה של התפתחותיות והפרעות מנוטלי7 ,8. למרות שיטות ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים הם זמינים2,9, כמה פרוטוקולים זמינים באינטרנט עבור ניתוח מוח stereotaxic עכברים neonatal10,11. למעשה, microinjections stereotaxic של ריאגנטים לתוך מוחותיהם של העכבר neonatal הגורים קשים, כי ראשו של הגור neonatal חלש מכדי להיות קבוע במנגנון stereotaxic רגיל. עם זאת, היישום של ניתוח מוח stereotaxic העכברים הטרנסגניים הוא ריאלי עבור עכברים neonatal12. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עם מלכודת תוצרת בית כדי לבצע ניתוח מוח stereotaxic ב העכבר היילוד הגורים. נדגים כי טכניקה זו מאפשרת למחיקת מותנית גנים floxed על ידי microinjecting recombinase לבטא AAV Cre DNA לתוך סטריאטום של הכתב ג'ין עכברים, מותנה העכברים הטרנסגניים floxed. טכניקה זו ישימה גם כדי לספק ריאגנטים לתוך סטריאטום neonatal של פראי-סוג עכברים.

<table><tbody><tr><td>30G מחט PrecisionGlide</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>המילטון מזרק מיקרוליטר</td><td>המילטון&nbsp;</td><td>80300</td><td>30G מחט מתאימה לצינור PE10; מחט 26G זקוקה למתאם PE20</td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק מיקרו קצב זרימה</td><td>ארוך יותר דיוק משאבת ושות'.</td><td>TJ-2A (בקר) ו-L0107-2A (יחידת כונן)</td><td></td></tr> <tr><td>מזרק 25G</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>ירוק מהיר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F-7252</td><td>0.1%</td></tr> <tr><td>מכשירים סטריאוטקסיים סטנדרטיים</td><td>RWD מדעי החיים</td><td>68037</td><td>ללא שימוש ב-68030 מתאם עכבר/חולדה יילודים</td></tr><tr><td>אנטי-FOXP2 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>ארנב פוליקלונלי ל-FOXP2, 1:4,000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד RFP</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>עכבר חד שבטי ל-RFP, מיקרוסקופ 1:1,000</td></tr><tr><td>BX63</td><td>אולימפוס</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב מצומד Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>פן וקטור ליבת</td><td>AV-9-PV1848</td><td>לוט # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken actin-eGFP</td><td>AAV core, המכון למדעים ביו-רפואיים, אקדמיה סיניקה, טייוואן</td><td>N/A</td><td>1x1014 (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>מעבדת ג'קסון&nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>מעבדת ג'קסון&nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2fl/fl</td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ</td><td>מלח קורנינג&nbsp; סלגרו</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים striatal של מוח העכבר neonatal

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

גנים רבים באים לידי ביטוי מוח עובריים, חלק מהם מתבטאים באופן רציף במוח לאחר הלידה. עבור גנים ביטוי בהתמדה כאלה, הם עשויים לפעול כדי לווסת את תהליך התפתחותי ו/או תפקיד פיזיולוגי במוח neonatal. לחקור פונקציות הנוירוביולוגי של גנים ספציפיים במוח, זה חיוני כדי להשבית את הגנים במוח. כאן, אנו מתארים שיטה stereotaxic פשוטה כדי להשבית ביטוי גנים ב סטריאטום של העכברים הטרנסגניים ב windows בפעם neonatal. וירוסים AAV-eGFP-Cre היו microinjected לתוך סטריאטום Ai14 כתב ג'ין עכברים ביום כמחנכת (P) 2 באמצעות ניתוח מוח stereotaxic. בביטוי הגן כתב tdTomato זוהה סטריאטום P14, רומז ש-cre-loxP מוצלח מתווכת רקומבינציה DNA בתאים AAV transduced striatal. אנחנו עוד יותר תוקף טכניקה זו על-ידי microinjecting וירוסים AAV-eGFP-Cre לתוך P2Foxp2חליל/חליל עכברים. תיוג הכפול של ה-GFP, Foxp2 הראה כי תאים GFP-חיוביות חסרה Foxp2 immunoreactivity ב סטריאטום P9, רומז על אובדן Foxp2 החלבון בתאים striatal AAV-eGFP-Cre transduced. יחדיו, תוצאות אלו מדגימות של מחיקה גנטי אפקטיבי על ידי וירוסים stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre באוכלוסיות עצביים מסוימים במוחם neonatal של העכברים הטרנסגניים floxed. לסיכום, הטכניקה stereotaxic שלנו מספק פלטפורמה פשוטה וקלה עבור הנדסה גנטית במוח העכבר neonatal. הטכניקה לא ניתן להשתמש רק כדי למחוק גנים באזורים ספציפיים של המוח neonatal, אבל זה גם יכול לשמש כדי להזריק סמים תרופתי, המשדרים עצביים, optogenetics מהונדסים, chemogenetics חלבונים, אינדיקטורים פעילות. עצבית ו ריאגנטים אחרים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal.

על הסט הראשון של הניסוי, אנחנו microinjected 200 nL של וירוסים AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, 1/10 דילול בתוך תמיסת מלח של Dulbecco פוספט buffered) המבטאים את recombinase Cre DNA התמזגו עם GFP לתוך סטריאטום P2 של עכברים Ai14. העכברים Ai14 אקספרס tdTomato מדווח על בתיווך Cre מחיקה של מלון loxP (floxed) עצור קלטת (איור 2F). המוח נבצרו ב P14 עבור immunostaining של ה-GFP, tdTomato. AAV רבים transduced תאים GFP-חיוביות היו המתנה לאורך סטריאטום...

אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתפתחות הגנטית והנוירולוגית כגון במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בטכניקה פשוטה עם מכשיר תוצרת בית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שביצוע הזרקות ממוקדות למוח דורש תשומת לב מלאה לפרטים.כדי להתחיל, הכינו מחזיק לשימוש בגורים יילודים במנגנון סטריאוטקסי. ראשית הכינו את מגש הראש. חתכו כ-1/5 מהחלק התחתון של צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר כדי ליצור פתח לראש של גור שזה עתה נולד.לאחר מכן, בחר תיבת קצה פיפטה ריקה המתאימה לכן של המנגנון הסטריאוטקסי. לאחר מכן השתמש בדבק חם כדי להדק את מגש הראש לבסיס קופסת הקצה. לאחר מכן, הדביקו קלטת להטמעת רקמות על הקופסה שבה היא יכולה לתמוך בפלג הגוף העליון של הגור בזמן שראשו מקובע.כעת הכינו מחטי נירוסטה בגודל 30 להזרקה. ראשית, נקו אותם מראש על ידי השרייתם בכלורופורם למשך שלושה ימים בבקבוקון זכוכית. שלושה ימים לאחר מכן, הסר בזהירות את המחטים ושטוף אותן באתנול מוחלט למשך 20 דקות ועם 50 סל"ד של תסיסה.לאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים ב-70% אתנול למשך 10 דקות לכל שטיפה גם עם תסיסה. לאחר השטיפות, הניחו למחטים להתייבש באוויר ואחסנו אותן בקופסה נקייה בטמפרטורת החדר עד לשימוש. עבור מכלול המיקרו-הזרקה, השתמש בקטע של חמישה סנטימטרים של צינורות פוליאתילן PE20 כדי לגשר על צינור PE10 למזרק בגודל 26 של 10 מיקרוליטר.אבטח את הצומת עם ציאנואקרילט. לאחר מכן, התקן את מחט ההזרקה החדשה בגודל 30 על הקצה השני של צינור PE10. כעת טען את מזרק המיקרו-הזרקה בנפח 10 מיקרוליטר.הסר את הבוכנה והשתמש במזרק נוסף בגודל 25 כדי להעמיס בחזרה את המכלול במים מזוקקים אוטומטיים כדי להוציא אוויר מהצינור. לאחר מכן החזירו את הבוכנה למזרק המיקרוליטר ודחפו את הבוכנה עד שיישארו רק שני מיקרוליטרים של מים מזוקקים בחבית ולא פחות. לאחר מכן, הרכיב בזהירות את מזרק המיקרוליטר על משאבת המזרק של המיקרו-זרימה.לאחר מכן פיפטה כמויות קטנות של צבע ירוק מהיר 0.1% מסונן בנוזלי הנגיף הניסיוני על פיסת פרפילם. כעת שאפו כמות קטנה של אוויר לתוך המזרק עד שנראית בועת אוויר בין מחט ההזרקה לצינור. לאחר מכן טען 0.7 מיקרוליטר של תמיסה ירוקה מהירה מסוננת כדי לבדוק את זרימת הנוזלים בצינורות המיקרו-הזרקה.אם הזרימה טובה, שאפו עוד נפח קטן של אוויר כדי ליצור בועת אוויר שנייה ולאחר מכן העמיסו את תמיסת ההזרקה לתוך צינור המיקרו-הזרקה. חבר ואבטח את מחט המיקרו-הזרקה למנגנון הסטריאוטקסי והמשך בהזרקת המיקרו של העכברים היילודים. כהכנה לניתוח, נגב היטב את המכשיר הסטריאוטקסי עם 70% אתנול ועיקר את מכשירי הניתוח עם 70% אתנול.לאחר מכן להרדים יילוד באמצעות היפותרמיה. הניחו את הגור בכפפת לטקס וטבלו אותו בקרח כתוש עד צווארו למשך חמש דקות. לאחר מכן צבטו את רגלי הגור במלקחיים כדי לוודא שאין רפלקס דוושה.לאחר מכן, מקם את הגור עם הכפפה במגש הראש והניח מעט קרח כתוש סביב שרוול הלטקס כדי לשמור על הרדמת ההיפותרמיה. לאחר מכן שפשפו את ראשו של הגור באתנול 70% ואתרו את ציון הדרך של הלמבדה. סמן אותו בטוש.לאחר מכן כוון את קצה המחט אל הלמבדה והגדר את הקואורדינטות הקדמיות/אחוריות והמדיאליות/רוחביות לאפס. לאחר מכן, בהתייעצות עם אטלס מוח, העבר את זרוע ההזרקה לאתר המטרה. לדוגמה, הסטריאטום של גורי P2 הוא 2.4 מילימטרים קדמיים ללמבדה, 1.0 מילימטרים משני צידי קו האמצע ו-1.7 מילימטרים גחוניים.לאחר מכן, סמן את המיקום של צבע ירוק מהיר על צינור PE10 באמצעות עט. לאחר מכן התחל לאט לאט לחדור למחט דרך העור והגולגולת עד שקצה המחט נוגע במשטח הגולגולת. הגדר את הקואורדינטות הגביות/גחוניות כאפס.לאחר מכן הורד את המחט לאט לאתר היעד. לאחר המיקום, המתן דקה אחת כדי לאפשר לפרנכימה לחזור לצורתה הרגילה. לאחר מכן הפעל את תוכנית המיקרו-הזרקה במהירות של 100 ננוליטר לדקה.במהלך ההזרקה, צפו בצבע הירוק המהיר נע בצינור ה-PE. זה קריטי לחדור לאט למחט דרך העור והגולגולת עד שקצה המחט נוגע במשטח הגולגולת. במהלך ההזרקה, חובה לצפות בצבע הירוק המהיר נע בצינור ה-PE.לאחר השלמת ההזרקה, המתן דקה אחת ולאחר מכן העלה לאט את המחט ל-1/2 מעומק ה-DV שחדר. לאחר מכן המתן עוד 30 שניות לפני שתמשיך במשיכה האיטית של המחט מראשו של הגור. לאחר השלמת ההזרקה, חשוב להמתין דקה אחת לפני העלאת המחט לאט לאט ל-1/2 מעומק ה-DV החודר.לאחר מכן המתן עוד 30 שניות לפני שתמשוך לאט את המחט מראשו של הגור. לאחר הזרקת כל האתרים הממוקדים, חממו את הגור למשך 20 דקות באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס. בדקו את הגור כל חמש דקות עד שהוא חזר לשכיבה על עצם החזה.לאחר מכן החזירו את הגור לסכר שלו. 200 ננוליטר של וירוס המבטאים רקומבינאז Cre DNA שהתמזג עם GFP הוזרקו לסטריאטום P2 של עכברי Ai14. עכברים אלה ביטאו את גן הדיווח tdTomato עם מחיקה בתיווך Cre של קלטת עצירה מאגפת loxP.המוחות נאספו ב-P14 לצביעה חיסונית של GFP ו-tdTomato. תאים חיוביים רבים של GFP שהועברו AAV היו נוכחים בכל הסטריאטום, מה שמעיד על זיהום נרחב של תאים סטריאטליים על ידי נגיפי AAV EGFP Cre. ביטוי נרחב דומה של tdTomato נמצא גם בסטריאטום.בבדיקה מיקרוסקופית בהגדלה גבוהה, נמצא בבירור שכל התאים הסטריאטליים החיוביים ל-GFP מבטאים במשותף את הגן המדווח tdTomato. יתר על כן, אותות tdTomato זוהו ככל הנראה במסופי אקסון בגלובוס פלידוס, ב-substantia nigra pars reticulata, אזורי המטרה של נוירוני הקרנה סטריאטוניגרליים וסטריאטופלידליים. יחד, תוצאות אלה מצביעות על רקומבינציה מוצלחת של DNA בתיווך Cre loxP המושרה על ידי ביטוי בתיווך AAV של פעילות Cre בנוירונים סטריאטליים בילודים.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות להזרקת סטריאטל דו צדדית אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמדובר בניתוח מוח ילודים עדין הדורש סבלנות וזהירות. מהליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אופטוגנטיקה וכימוגנטיקה על מנת לנתח את ההתבגרות של במהלך ההתפתחות שלאחר הלידה.

stereotaxic-surgery-for-genetic-manipulation-striatal-cells-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אבלציה ממוקד באזור ספציפי במוח (ים) על ידי עירוי של excitotoxin באמצעות קואורדינטות stereotaxic מתואר. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאם עבור עירוי של כימיקלים אחרים במוח חולדה.

ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

מקור: Porlan, E., et al. שינוי גנטי יציב ויעיל של תאים בעכבר הבוגר V-SVZ לניתוח השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאי גזע עצביים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שינוי גנטי יציב של תאי גזע עצביים (NSCs) באזור הגחון-תת-חדרי (V-SVZ) באמצעות הזרקה סטריאוטקסית של גן טיפולי נושא וירוס במודל עכבר. הנגיף חודר לתאי גזע, עובר שעתוק הפוך, משתלב בגנום ומאפשר שינוי גנטי יציב ויעיל ליישומים נוירותרפיים.

הזרקה סטריאוטקסית של וירוסים לשינוי גנטי יציב במודל עכבר

סרטון זה מתאר טכניקה יעילה לגרימת גליובלסטומות (GBM) באמצעות דנ"א טרנספוזוני המוזרק לחדרים של עכברים ילודים. תאים של האזור התת חדרי, אשר לוקחים את פלסמיד, לשנות, להתרבות וליצור גידולים עם מאפיינים היסטופתולוגיים של GBM אנושי.

השראת גליובלסטומה באמצעות טרנספוזיציה בתיווך SB: טכניקה ליצירת מודל עכבר חדשני באמצעות שילוב מתווך טרנספוזון של פלסמיד SB במוח עכבר יילודים

מקור: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Newborn Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של וקטור ויראלי המקודד Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לתוך הסטריאטום של גור עכבר מהונדס גנטית כדי להשיג מניפולציה גנטית על ידי כריתת קלטת STOP עם אגף loxP, הפעלת חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP כמדווח.

מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

מקור: Gonzalez-Ramos, A., et. al., השתלת נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכבר המוקדם לאחר הלידה כדי להפחית הפרעות נוירו-התפתחותיות. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של תאי מבשר אינטרנוירונים שמקורם באדם לתוך ההיפוקמפוס של גור עכבר מהונדס גנטית עם אינטרנוירונים מעכבים מופחתים, במטרה להחזיר את האיזון המעורר-מעכב.

השתלת תאי מבשר בין-עצביים שמקורם באדם בהיפוקמפוס גור העכבר

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף...

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

ניתוח Stereotaxic על מכרסמים מאפשר ניהול ממוקד של תרופות או גירוי חשמלי והקלטות ב ער, התנהגות בעלי חיים. במצגת וידאו זה נדגים חידודים פרוצדורליים האחרונות להליך ארוכת זה כי שיעור ההישרדות משופרת בהצלחה ואובדן מופחת לאחר הניתוח המשקל.

מכרסמים כירורגיה Stereotaxic ועל צער בעלי חיים שיפורים תוצאה של ההתנהגות Neuroscience

למד ניתוח סטריאוטקטי למניפולציה גנטית בתאי סטריאטום של עכברים נאונטליים באמצעות מכשיר ביתי. שיטה זו מאפשרת חקר מדויק של השפעות גנטיות על התפתחות עצבית מוקדמת.

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

גלה סרטונים נוספים