Name: השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: למדו לקבוע אינדקס טיפות שומן ב-Ustilago maydis באמצעות צביעה פלואורסצנטית BODIPY 493/503. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של דינמיקת צבירת שומנים בתנאי תזונה שונים ללא צורך במיקרוסקופיה מורכבת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוטו Politécnico Secretaria נאסיונאל דה Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Apoyo דה פרוגרמה e Proyectos דה Investigación Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(אוניברסיטת נאסיונאל Autónoma de México UNAM), ו- y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnología (CONACyT 254904-JPP ו- 256520-GGS). Fundação דה אמפרו Pesquisa לעשות את ריו דה ז'ניירו (FAPERJ-Cientistas לעשות Nosso Estado: E 26/103.353/2011). אנחנו הודות QFB. אוסקר Iván Luqueño Bocardo עבור סקירה סכמטי. אנו מודים ד ר מיגל Tapia רודריגס על העזרה יקר מיקרוסקופיה קונפוקלית של תעודות זהות. אנו מאחלים תודה ד ר ברונו Bozaquel Morais על עבודתו החלוצית בחקר פיתוח הטכניקה cerevisiae ס זה אנחנו מותאם זקן התירס בארצות הברית.

1. הכנת מאגרי ופתרונות
<ol><li>להכנת 1 ליטר של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7), לפזר 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 גר' נה2HPO4, 0.24 גר' ח'2PO4 ב- 800 מ ל מים distillated. להתאים את ה-pH אל 7.0 עם HCl, ולאחר מכן להוסיף מים עבור אמצעי אחסון הסופי של PBS ל' 1 ניתן בתפקיד 10 x פתרון מניות, בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כדי להכין 10 מ"ל של תיקון פתרון, להוסיף 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד 9 מ של PBS להגיע ריכוז סופי של 3.7%. להכין פתרון זה רק לפני השימוש. התראה: שימוש בכפפות כדי להתמודד עם הפתרון פורמלדהיד.</li>
	<li>כדי להכין את שכבתה-הפתרון (500 מ מ), לפזר 8.3 g של קי ב- 100 מ של מים מזוקקים. להכין את הפתרון הזה לפני השימוש ולאחסן אותה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כדי להכין פתרון מניות BODIPY 10 מ מ, לפזר 10 מ ג של BODIPY 493/503 ב מ 3.8 ל דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). להשאיר 100 µL aliquots באפלה ב-70 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי להכין BODIPY 5 מיקרומטר שכבתה פתרון, להוסיף 1 µL 10 מ מ BODIPY מ 493/503-2 ל 500 מ מ שכבתה פתרון. עבור LFR וזמינותו, נדרש ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר של BODIPY.</li>
	<li>כדי להכין את הפתרון מינרלי, להוסיף 0.06 גרם של H3בו3, 0.14 גר' MnCl2-4 H2O, 0.4 g של ZnCl2, g 0.04 של נה2MoO4-2 H2O, 0.1 g של FeCl3-6 H2O ו- 0.4 גר' CuSO 4-5 H2O ל- 1 ליטר של מים מזוקקים.</li>
	<li>כדי להכין את תמיסת מלח, להוסיף 16 גר'2פו ח'4, 4 g של Na2כדי4, 8 גרם של אשלגן כלורי, 2 גר' MgSO4, 1 גר' CaCl2ו- 8 מ של מינרלים לפתרון 1 ליטר של מים מזוקקים.</li>
	<li>כדי להכין את המדיום מינימלי ללא מקור חנקן עבור U. זקן התירס FB2 (a2b2), להוסיף 10 גרם של גלוקוז ושל 62.5 מ"ל של תמיסת מלח 1 ליטר של מים מזוקקים, על-פי הולידיי, et al. 31. להתאים את ה-pH אל 7.0 ואז לוותר על 100 מ של אמצעי התקשורת מבחנות 250 מ ל, לעקר אותם. אוטוקלב כעשרים דקות בבית 15 psi (1.05 ק ג/cm2) מחזור נוזלי או מסנן לחטא.</li>
	<li>כדי להכין המדיום דקסטרוז peptone שמרים (YPD), הוסף 5 גר' שמרים לחלץ, 2.5 גר' peptone, ו- 5 גר' גלוקוז כדי 1 ליטר של מים מזוקקים. לוותר על 100 מ של הפתרון ב- 250 מ ל מבחנות ולחטא אותם. אוטוקלב כעשרים דקות בבית 15 psi (1.05 ק ג/cm2) מחזור נוזלי או מסנן לחטא.</li>
</ol>2. תרבות מצבו ואת קיבוע תאים
הערה: לשמר את המבנה של תעודות זהות על ידי תיקון התאים בהקדם האפשרי. הקיבעון יכול להיעשות microcentrifuge צינורות. תאים קבוע ניתן לשמור ב 4 ° C עד לחודש אם התייבשות נמנעת להשאיר שכבה דקה של מים.
<ol><li>לגדל זקן התירס בארצות הברית תאים בתנאים תרבות הרלוונטיים לצורך המחקר. נתחיל את התרבות יתר ראשונית600 של 0.05 (1.15 × 106 תאים / mL). דגירה התאים ב 28 ° C, סל ד 180 במשך 24 שעות ביממה. יתר600 1 מקביל 2.3 × 107 תאים / מ ל.</li>
	<li>ב שנבחר פעמים, לסגת aliquot של התאים. עבור U. זקן התירס, לסגת מ ל כל 2 h במהלך הראשון 8 שעות. אחרי 8 שעות של צמיחה, aliquots של 2 מ ל הם מספיק.</li>
	<li>מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm של כל aliquot.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא-14,000 g x עבור 1 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה שולחן. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להשעות בגדר של התאים ב- 1 מ"ל PBS-פורמלדהיד 3.7% המאגר. דגירה התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר הדגירה, centrifuge התליה תא-14,000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשטוף את צניפה תאים פעמיים עם נפח דומה של מים מזוקקים (1 מ"ל). Centrifuge התליה תא-14,000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע לאחר כל שלב כביסה.</li>
	<li>להתאים בגדר תא כדי 5 OD600 (1.15 x 108 תאים / מ ל) עם מים (משוואה 1) מזוקקים. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq1.jpg">    משוואה 1.
</li>
	<li>לשמור את הדגימה ב 4 ° C עד השימוש.</li>
</ol>3. נוזלי פלורסצנטיות שחזור Assay (LFR)
<ol><li>להפעיל את ספקטרופוטומטרים ופתחו את תוכנת Skanlt. לחץ על חדש הפעלה, ובחרו ' התחל ולאחר מכן Varioskan Lux. בחר פרוטוקול מן העץ הפעלה, הזן את ההגדרות עבור אורכי הגל קרינה פלואורסצנטית (עירור 485 nm/פליטה 510 ננומטר; צפיפות אופטית 600 ננומטר) ובחר רווח אוטומטי האופטיקה. עירור רוחב פס, בחר 12 ננומטר. המערכת האופטית, בחר העליון (עירור של המדגם הוא מהחלק העליון של הבאר).</li>
	<li>הזן של עצבנות עדינה ורציפה (300 סל ד). לבחור להפעיל את הצלחת לצאת עד ה משתמש בפעולת השהיה (זמן המשמש עבור התוספת של המדגם לבארות). חזור על הפרוטוקול חמש פעמים. לחץ על שמור וכתוב שם עבור ההפעלה על השדה שם הפעלה. הפרוטוקול מוכן כעת עבור הניתוחים דגימות.</li>
	<li>להוסיף 200 µL מיקרומטר BODIPY 5-מתרצה לפתרון כל טוב של צלחת התחתון טוב שחור-נקי 96.</li>
	<li>למקם את הצלחת בתוך החדר ספקטרופוטומטרים, דגירה 5 דקות ב 30 º C. מנקודה זו, להגן על צלחת מאור במידת האפשר.</li>
	<li>לחץ על הלחצן התחל , לקרוא את קרינה פלואורסצנטית (עירור 485/פליטה 510) ואת ה OD600 התואם החסר.</li>
	<li>להוסיף 5 µL של התליה תא פורמלדהיד-קבוע הבארות במהלך זמן השהיה. מערבבים את הדוגמאות בזהירות עם פיפטה. לשים את הצלחת בתוך ספקטרופוטומטרים ' ולחץ על ' המשך'. לאחר מכן, הדגימות יעובדו לפי הפרוטוקול תוכנן לעיל.</li>
	<li>חזור על שלוש תוספות רצופים של 5 µL תא השעיה. ודא כי התאים לא לזרז. (איור 1).</li>
</ol>4. חישובים של מדד LD
<ol><li>כל מדגם microplate, מגרש גרף של זריחה, ספיגת כנגד הנפח של כל הוספה רצופים (5 נקודות כולל הריק). במחקר זה, השתמש בתוכנת Microsoft Excel עבור החישובים. כדי להתוות את הנתונים, הזן את עוצמת הקול, קרינה פלואורסצנטית ונתונים ספיגת הראשון, השני והשלישי עמודה בגליון הנתונים, בהתאמה. לאחר מכן, בחר את הנתונים כולה עם הסמן, לחץ על הוסף ובחר פיזור (XY).</li>
	<li>בחר את הנקודות עבור כל קו הגרף ולהוסיף בהתאמה קו המגמה כאשר התיבה הצג משוואה מסומנת. תכתוב את הערכים של המדרונות של שני הקווים ישרים, על פי משוואה 2: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq2.jpg">    משוואה 2 איפה y = זריחה או צפיפות אופטית, x = נפח דגימה (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = שיפוע של זריחה או קו צפיפות אופטית, b = חיתוך-y.</li>
	<li>לחלק את השיפוע של קו זריחה מאת השיפוע של קו צפיפות אופטית כדי לקבל מדד LD, משוואה 3. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq3.jpg">    משוואה 3 מדד LD מקביל המנה של קרינה פלואורסצנטית ומדרונות צפיפות אופטית.</li>
</ol>5. נתונים ותמרוקים
<ol><li>חשב את מקדם המתאם של כל קו ישר: לחץ על אשף פונקציה (fx) ובחרו CORREL. אם r &lt; 0.9, למחוק את הנתונים וחזור על הקריאות. אם r ≥ 0.9, קריאות אמינים.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+roles+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li>
<li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li>
<li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+lipids+from+glycerol%3A+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83(2014).</li>
<li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164(2014).</li>
<li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li>
<li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids%2C+carotenoids%2C+and+enzymes+for+use+in+industries%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li>
<li>Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+using+industrial+by-products+under+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li>
<li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li>
<li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast%3A+current+status+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605(2013).</li>
<li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li>
<li>Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and lipid droplets.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li>
<li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+neutral+lipids%3A+synthesis%2C+storage+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li>
<li>Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lipid+droplet+accumulation+associated+with+a+peripheral+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy.</a> Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).</li>
<li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets%3A+finding+a+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li>
<li>Greenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+droplets+in+metabolic+disease+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).</li>
<li>Aguilar, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+accumulation+and+other+biochemical+changes+induced+in+the+fungal+pathogen+Ustilago+maydis+under+nitrogen-starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation.</a> Archives of Microbiology. , (2017).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PLoS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Madeira, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC1+Inhibition+Induces+Lipid+Droplet+Replenishment+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).</li>
<li>Maya-Monteiro, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+induces+macrophage+lipid+body+formation+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+and+mammalian+target+of+rapamycin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).</li>
<li>Listenberger, L. L., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aListenberger%2C+LL+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soraphen+A%2C+an+inhibitor+of+acetyl+CoA+carboxylase+activity%2C+interferes+with+fatty+acid+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation.</a> Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924203116302995">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+spectroscopic+property+of+Bodipy+derivates+through+tuning+the+molecular+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).</li>
<li>Pagac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEIPIN+Regulates+Lipid+Droplet+Expansion+and+Adipocyte+Development+by+Modulating+the+Activity+of+Glycerol-3-phosphate+Acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase.</a> Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Holliday, R. Ustilago maydis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Handbook+of+genetics%22">Handbook of genetics</a>. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).</li>
</ol>

המחברים אין שום גילוי

LFR היא שיטה שהוחל בפעם הראשונה ללמוד מטבוליזם השומנים ב cerevisiae ס ומעלה זה היה בהצלחה מיושמת ב- U. זקן התירס20,21. למרות מדד LD אינו נותן בערכו המוחלט של תגי שהצטברו בתאים, הוא מספק רעיון מהיר של התוכן השומנים של תאים, הפרשנות של הנתונים היא פשוטה כאשר אינדקס LD מתנאי הניסוי שניים או יותר מושווים. BODIPY 493/503 הוא מאוד ספציפי שומנים נייטרלי, המרכיב העיקרי של תעודות זהות, ויש בו ספקטרום פליטה צר הקלת הגילוי סימולטני של אותות אחרים מגיעים צב...

השומנים טיפות (LDs) הינם גופים שומן תאיים בכל מקום מורכב גרעין של שומנים נייטרלי, בעיקר תגיות, סטרול אסטרים (SE). הליבה מוקף טפט של פוספוליפידים המקיימת אינטראקציה עם חלבונים כמו perilipin ואנזימים המעורבים הסינתזה של שומנים נייטרלי, כגון diacylglycerol ליפיד-טרנספראז, אצטיל קואנזים a קרבוקסילאז ו ליפיד-CoA סינתאז1. בשל התנהגות דינמית שלה, טפט פוספוליפיד מכיל גם lipases triacylglycerol זה hydrolyze תגיות ו- SE2. בהתאם לסוג התא באורגניזם, ליפידים נייטרלי מאוחסנות יכול לשמש כדי לייצר אנרגיה, או לסנתז phospholipids ו מולקולות איתות. שמרים ופטריות אחרים, התוכן של LDs משתנה בתגובה בווריאציות יחס פחמן/חנקן בתקשורת תרבות, המציין כי חנקן ירידה בזמינות עשוי להיות המפתח כדי להגדיל את השומנים נייטרלי ייצור3,4 ,5. הייצור של כמויות גבוהות של תגים בשמרים יש שימוש פוטנציאלי בביוטכנולוגיה כמקור של דלק ביולוגי, בתעשיית המזון. כמה שומנים מאוחסנות מכילים הפרופורציות גבוהה של חומצות שומן רב בלתי רווי, כמו אומגה 3 ואומגה 6, עם חשיבות התזונתיים וההתפתחותיים 6,7,8,9,10 , 11. LDs בתרבית של תאים, כולל תאים אנושיים, גם להכיל תגי ואסטרים כולסטרול. טפט פוספוליפיד אינטראקציה עם מידע יונקים הומולוגיים של החלבונים שמתואר שמרים LDs, ועם חלבון נוסף, perilipin, אשר נעדר cerevisiae ס12. אחד הציע תפקיד עבור טפט פוספוליפיד וחלבונים הקשורים שלה הוא לייצב את המבנה LDs ולאפשר את האינטראקציה של תעודות זהות עם organelles כמו המיטוכונדריה, רשתית תוך-פלזמית, peroxisomes וקואלות, בעיקר עבור exchange השומנים 13,14. מעניין, בבני אדם, LDs מופיעים להיות מעורב פתולוגיות כמו סוכרת מסוג 2, טרשת עורקים, steatohepatitis מחלת לב כלילית, בהם יש גידול שלהם מספר 15,16,17 . כמה סוגים של וירוסים להשתמש LDs פלטפורמות להרכיב את18, 2,virions19.
בשל ההשלכות של זיהוי פתולוגיות האנושי ולהשתמש ביוטכנולוגי הפוטנציאלי שלהם, בקביעה ניסויית המדויק של היווצרות LDs היא משימה חשובה. מאמר זה מתאר וזמינותו אמין המבוסס על החזרתה של זריחה (LFR) של BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-בורה-3a, 4a-diaza-s-indacene), כדי לקבל ערך היחסי של התוכן של ליפידים נייטרלי בתאים. עם זה assay, זה אפשרי לעקוב אחר הדינמיקה של ההצטברות של שומנים נייטרלי בפטריות כמו זקן התירס בארצות הברית ו cerevisiae ס, וגם בתרבית של תאים, ללא הצורך של השומנים החילוץ 20. השיטה הוחל לראשונה ב cerevisiae ס כדי לזהות את חלבון phosphatases, kinases מעורב ברגולציה של חילוף החומרים של השומנים. זה היה אפשרי ללא שאיבת שומנים בדם או חלבון טיהור21,22. LFR גם שימש כדי לבסס את הדינמיקה של היווצרות LDs מקרופאגים הצפק23. השימוש של BODIPY 493/503 יש כמה יתרונות לעומת אחרים צבעים ניטרליים השומנים כמו הנילוס אדום. BODIPY 493/503 הוא מאוד ספציפי ליפידים נייטרליים ויש ספקטרום פליטה צר, הקלת הגילוי סימולטני של אותות צבע כמו חלבון פלואורסצנטי אדום או Mito-גשש, כאשר הדגימות מנותחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. למרבה הצער, רגיש/ה photobleaching BODIPY 493/503, אך תהליך זה ניתן למנוע על-ידי שימוש של ריאגנט antiquenching במהלך חשיפה אור24.
כדי לבצע את הבדיקה LFR בתאים שמרים, הם בתרבית בתנאים תזונתי הרצוי, aliquots הם מסוגר בזמנים שונים. בשלב הבא, תאים קבועים עם פורמלין, השומרת על היושרה של LDs חודשים כאשר תאים מאוחסנים ב 4 º C. טכניקות קיבוע אחרות יש להימנע, במיוחד אלה באמצעות מתנול או אצטון קר, שכן הן יובילו ההשפלה של LDs בתוך תאים24. כדי למדוד את האינדקס LD, תאים פורמלדהיד-קבוע מושעים במים בריכוז מוגדרים. לאחר מכן, הם מתווספים פתרון המכיל את fluorophore BODIPY 493/503 מתרצה מאת KI, כאשר fluorophore חודרים לתא ומשייך תעודות זהות, יש החלמה של זריחה שלה. במקביל למדידה קרינה פלואורסצנטית (485 nm/510 ננומטר), הריכוז של תאים הוא לכמת על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 ננומטר. כל מדגם נקראים ארבע פעמים על-ידי הוספת אותו aliquots µL 5 עוקבות של השעיה תא פורמלדהיד-קבוע טוב. כדורי סרק של זריחה, ספיגת נרכש לפני התוספת של תאים. האיכות של זריחה ואת הנתונים ספיגת יוערכו על-ידי קביעת על ליניאריות של המדידות: אם r < 0.9, הנתונים יימחקו. הערך חשוב כי בעיקרון עוצמת קרינה פלואורסצנטית צריך לייצר תגובה לינארית הגדלת ריכוזים התא. אם התא ריכוז גבוה מדי, ליניאריות אובד. וזמינותו LFR מספק שיטה מהירה, פשוטה וכלכלית כדי לבחור את פנוטיפ LD הרצוי בניסויים תפוקה גבוהה. לאחר בחירת התנאים הרצויים, LD התוכן של תאים בודדים ניתן יהיה ללמוד על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, באמצעות פורמלין-קבוע לאותם תאים מוכתם BODIPY, מתן תמונה של LDs בתא. שלהם תגים ותוכן SE יכול עכשיו להיות בהמשך נותחו על ידי שכבה דקה כרומטוגרפיה.

<table><tbody><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Varioskan Lux multimode microplate reade</td><td>D5879</td><td>מסנן 493/503 או גלאי מונוכרומטור</td></tr><tr><td>צלחת costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3615</td><td>96 באר קיר שחור/תחתון שקוף</td></tr><tr><td>צלחת</td><td>כוכב קורנינג בע"מ</td><td>3598</td><td>96 באר צלחת תרבית תאים כוכב</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen / Thermofisher</td><td>D3922</td><td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>252549</td><td>מגיב ACS, 37% wt % ב-H2O, מכיל 10-15% מתנול למניעת פילמור</td></tr><tr><td>אשלגן יודיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>60399</td><td>BioUltra, &ge; 99.5% (AT)</td></tr><tr><td>FB2 Ustilago maydis</td><td>ATCC</td><td>201384</td><td>שמרים בסיסיומיצטים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>746398</td><td>מגיב ACS, מלח אנאורגני</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0662</td><td>מגיב ACS</td></tr><tr><td>תמצית שמרים נבחרת</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Y100</td><td>תערובת של חומצות מיני, פפטידים, מסיסים במים, ויטמינים ופחמימות למצע תרבית</td></tr><tr><td>מארז NZ בתוספת</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N4642</td><td>קזאין הידרוליזט אנזימטי מחלב בקר</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G-8270</td><td>D (+) גלוקוז</td></tr><tr><td>בקבוק סקייקר</td><td>Pirex</td><td>CLS4450250-6EA</td><td>Borosiicate זכוכית</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>SEV M&eacute; xico</td><td>INO650V-7</td><td>שייקר אורביטלי</td></tr><tr><td>שולחן צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>מיקרו-צינורות</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Z606340</td><td>טיפים לפיפט אפנדורף</td></tr><tr><td></td><td>Axygen scientific</td><td>T-200-Y</td><td>טיפים פיפט אוניברסלי עם קצה משופע, 200 מיקרוליטר, פיפטה mLine לא סטרילית</td></tr><tr><td></td><td>Biohit</td><td>725130</td><td>8 ערוצים, טווח עוצמת קול 5-100 uL</td></tr></tbody></table>

השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

המאמר מראה כיצד ליישם את הבדיקה אינדקס LD, אשר הוא רגיש microplate assay כדי לקבוע את הצטברות triacylglycerols (TAGs) בטיפות השומנים (LDs). אינדקס LD מתקבל ללא חילוץ השומנים. היא מאפשרת מדידה התוכן LDs בניסויים תפוקה גבוהה בתנאים שונים כגון צמיחה עשיר או חנקן דלה מדיה. אף על פי השיטה שתוארה לראשונה לחקור את חילוף החומרים של השומנים droplet של האפייה, הוחל בהצלחה אל basidiomycete פחמון זקן התירס. מעניין לציין, כי LDs organelles phylogenetically שמור ב התאים האיקריוטים, השיטה וניתן להחילם למגוון גדול של תאים, מ שמרים בתרבית של תאים. מדד LD מבוססת על וזמינותו שחזור פלורסצנטיות נוזלי (LFR) של BODIPY 493/503 בתנאים שכבתה, על ידי התוספת של תאים קבוע עם פורמלין. יוד האשלגן משמש כ'חטיף זריחה. היחס בין זריחה על המדרונות צפיפות אופטית נקרא מדד LD. מדרונות מחושבים מתוך הקווים ישרים מתקבל כאשר BODIPY פלורסצנטיות, צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) מותוות נגד מדגם תוספת. איכות הנתונים אופטימלית משתקף על ידי מקדמי המתאם שווה או מעל 0.9 (r ≥ 0.9). מספר דוגמאות ניתן לקרוא בו זמנית כמו זה ניתן להטמיע את microplate. מאחר BODIPY 493/503 פלורסנט lipophilic לצבוע את המחיצות לתוך טיפות השומנים, ניתן להשתמש בסוגים רבים של תאים שנצברים LDs.

LFR, עם BODIPY 493/503 כמו החללית פלורסנט היא שיטה אמין וקל ללמוד הצטברות דינמי של זיהוי זקן התירס בארצות הברית, ללא קשר לתנאי הגידול. כאשר התאים היו תרבותי YPD-בינוני, חלה עלייה במדד LD במהלך שלב מעריכית, ולאחריו ירידה בשלב נייח (איור 2 א). לעומת זאת, בתאי גדל תחת חנקן הרעבה, הייתה עלייה קבועה באינדקס LD בשלבים שני מעריכי, נייח (איור 2B). כי שתי תרבויות הופעלו עם הצפיפות האופטית אותו (דומה מספר תאים), התוצאות מציגות את ...

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להשיג את השומנים droplet אינדקס (אינדקס LD) ללמוד את הדינמיקה של triacylglycerols בתאים בתרבית בניסויים תפוקה גבוהה. LD אינדקס וזמינותו היא שיטה קלה ומהימנה של המשתמשת BODIPY 493/503. Assay הזה אינו צריך שאיבת השומנים dispendious או ניתוח מיקרוסקופ.

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את אינדקס טיפות השומנים של תאים שגודלו בתנאים תזונתיים שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדה טיפות השומנים והשומנים, כגון הדינמיקה של הצטברות ותנאי התזונה השונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקרוא מספר דגימות בו זמנית, מכיוון שניתן ליישם אותה במיקרופלייט.עם תחילת השיטה הזו כאשר אנו צופים בשבירה של תאי Ustilago maydis שגודלו תחת רעב חנקן ואז מבינים שזה עשוי להיות שהמדריכים האלה עשויים להיות טיפות שומנים. לכן יצרנו קשר עם מוניקה מונטרו מהאוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו בברזיל שהטמיעה את בדיקת התאוששות הפלורסנט הנוזלי של טיפות שומנים ב-Saccharomyces cerevisiae כדי להתחיל שיתוף פעולה להתאמת ההליך עבור Ustilago maydis. השלב הראשון בפרוטוקול זה הוא הכנת המאגרים והפתרונות הנדרשים.להכנת תמיסת מלאי BO-DP של 10 מילי-מולאר, ממיסים 10 מיליגרם של BO-DP 493-503 ו -3.8 מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד. מחלקים ל -100 מיקרוליטר אליקוטים. לאחר מכן שמור בחושך מינוס 70 מעלות צלזיוס.הכן תמיסת מרווה BO-DP של חמישה מיקרו-מולרים להתאוששות התפרחת הנוזלית, או בדיקת LFR-על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 10 מילי-מולרי BO-DP 493-503 לשני מיליליטר של תמיסת מרווה של 500 מילי-מולרי. גדל את תאי האומדה למחקר זה על ידי התחלת תרבית עם צפיפות אופטית ראשונית של 600 ננומטר של 05. דגרו על התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך 24 שעות.בזמנים נבחרים, משוך חלק מהתאים. במהלך שמונה השעות הראשונות, משוך חמישה מיליליטר כל שעתיים. לאחר שמונה שעות של צמיחה מספיקים אליקוטים של שני מיליליטר.מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של כל קצוב. צנטריפוגה את תרחיף התא ב -14, 000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. והשליכו את הסופרנטנט.השעו את גלולת התא במיליליטר אחד של תמיסת קיבוע המכילה 3.7% פורמלדהיד ב-PBS. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה את תרחיף התאים ב 14, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.השליכו את הסופרנטנט. שוטפים את כדור התא במיליליטר מים מזוקקים. צנטריפוגה את מתלה התאים למשך דקה אחת.השליכו את הסופרנטנט והוסיפו מיליליטר מים מזוקקים לשטיפה שנייה. שוב צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט מהכביסה השנייה.בעזרת מים מזוקקים, התאם את הצפיפות האופטית של כדור התא ב-600 ננומטר לחמישה, השווה ל-1.5 כפול 10 לתאים השמינית למיליליטר. שמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. התחל הליך זה על ידי הפעלת הספקטרופוטומטר.פתח את תוכנת SkanIt. לחץ על הפעלה חדשה. מעץ ההפעלה בחר פרוטוקול, הזן את ההגדרות עבור אורך גל התפרחת ובחר רווח אוטומטי מרובה משתתפים בתמונות.עבור רוחב הפס של העירור בחר 12 ננומטר. באופטיקה, בחר למעלה לעירור הדגימה מראש הבאר. הזן 300 סל"ד ונמוך לתסיסה עדינה ומתמשכת.בחר לוח ריצה, השהה, ועד לפעולת המשתמש, חזור על הפרוטוקול חמש פעמים. לחץ על שמור ובשדה שם ההפעלה, כתוב שם עבור ההפעלה. הפרוטוקול מוכן כעת לניתוח דגימה.הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת המרווה BO-DP 5 מיקרו-טוחנת לכל באר של צלחת שחורה עם תחתית שקופה 96. הנח את הצלחת בתוך תא הספקטרופוטומטר ודגירה בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מכאן והלאה, הגן על הצלחת מפני אור ככל האפשר.לחץ על כפתור ההתחלה וקרא את התפרחת ואת הצפיפות האופטית ב -600 ננומטר, המתאימה לחסר. במהלך זמן ההפסקה, הוסף לבארות חמישה מיקרוליטרים של תרחיף התאים הקבועים של פורמלדהיד וערבב את הדגימות בזהירות עם פיפטה. החזר את הצלחת לתוך הספקטרופוטומטר ולחץ על המשך.חזור על שלוש תוספות רצופות של חמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים. מערבבים עם פיפטה כדי לוודא שהתאים לא משקעים לפני שתמשיך בקריאה. בהדגמה זו, תוכנת אקסל משמשת לחישוב ושרטוט גרף של תפרחת וספיגה כנגד נפח כל תוספת עוקבת עבור כל דגימה במיקרו-לוחית.הזן את נתוני הנפח, התפרחת והספיגה בגיליון הנתונים. לאחר מכן בחר את כל הנתונים עם הסמן, לחץ על הוספה ופיזור X Y. בחר את הנקודות עבור כל קו בגרף והוסף את קו המגמה המתאים כאשר התיבה הצג משוואה נבחרה.רשום את ערכי השיפועים של שני הקווים הישרים לפי המשוואה. כדי לקבל את טיפת השומנים, או אינדקס LD, חלקו את שיפוע קו הקרינה בשיפוע קו הצפיפות האופטית. כדי לנתח את איכות הנתונים, חשב את מקדם המתאם של כל קו ישר.לחץ על אשף הפונקציות ובחר אלמוג. הקריאות אמינות אם R שווה או גדול מ-0.9. חשוב לאמת את הרגישות של שיטה זו במיקרוסקופ קונפוקלי.כאשר תאים תורבבו במדיום YPD, חלה עלייה במדד ה-LD במהלך השלב האקספוננציאלי ואחריו ירידה בשלב הנייח. לעומת זאת, תאים שגדלו תחת רעב חנקן הראו עלייה מתמדת באינדקס LD הן בשלב האקספוננציאלי והן בשלב הנייח. תחת רעב חנקן, העלייה במדד ה-LD עוכבה על ידי סוראפן A, מעכב ספציפי של האנזים אצטיל-CoA קרבוקסילאז, החיוני לסינתזה של חומצות שומן, הכלול בטריאציל גליצרולים המאוחסנים בטיפות שומנים.מכיוון ששתי התרביות התחילו באותה צפיפות אופטית, התוצאות מראות את יכולת הבדיקה לזהות שינויים קטנים בתכולת השומנים. הרגישות של שיטה זו אוששה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. תאי YPD מכילים הרבה LDs קטנים בכל התא, בעוד שרעב חנקן ייצר LDs גדולים, בדרך כלל ארבעה עד חמישה לכל תא.כדי לחקור עוד יותר את ההתגייסות של LDs ב-U.Maydis, תאים שגודלו תחת רעב חנקן במשך 72 שעות הועברו למדיום YPD. כפי שהוצג, מדד ה-LD ירד בעקבות פונקציה מעריכית. מכיוון שהתאים הצליחו לגייס את ה-LDs שהצטברו במהלך רעב חנקן, התוצאה מצביעה על ירידה בתכולת הטריאציל גליצרול.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור להגן על התאים מפני אור ולערבב בין תוספות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון טריאציל גליצרול או קביעת תכולת השומנים הכוללת כדי לענות על שאלות נוספות, כמו תכולת השומנים המדויקת בתאים.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוטכנולוגיה של השומנים לחקור אורגניזמים חדשים או לכאורה על מנת להגביר את הייצור של דלקים ביולוגיים או שומנים ביישומים פרמצבטיים. ניתן לחקור אפילו תאי סרטן ממאירים בטכניקה זו כדי לחקור את ההשתתפות של חילוף החומרים של השומנים בהתפתחות המחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, גם לך יש הבנה טובה כיצד לקבוע את אינדקס טיפות השומנים של תאים אלה.אל תשכח שעבודה עם פורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.

lipid-index-determination-liquid-fluorescence-recovery-fungal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

פרוטוקול פשוט כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי של תאי אצות באמצעות הליך מכתים הנילוס אדום מתואר. טכניקה לחיסכון בזמן זה מציעה אלטרנטיבה לפרוטוקולי כימות מסורתיים מבוסס gravimetric שומנים בדם. זה תוכנן עבור היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור.

פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה

המאמר מתאר שיטה מגדילה את התפוקה תוך איזון המאמץ והדיוק של מיצוי שומנים מתוך קרום התא של מיקרואורגניזמים לשימוש באפיון שתי ליפידים סה"כ ואת השפע היחסי של שומנים מחוון כדי לקבוע מבנה הקהילה מיקרוביאלית הקרקע במחקרים עם דוגמאות רבות.

ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות כדי ללכוד תמונות, לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של הפטרייה חוטית A. nidulans הן בתרבויות שקועות ומדיה מוצקה. פרוטוקול זה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

למדו לקבוע אינדקס טיפות שומן ב-Ustilago maydis באמצעות צביעה פלואורסצנטית BODIPY 493/503. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של דינמיקת צבירת שומנים בתנאי תזונה שונים ללא צורך במיקרוסקופיה מורכבת.

השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון

גלה סרטונים נוספים