לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד לימפוציטים מאתרים אינדוקטיביים במעי כולל מדבקות פייר ובלוטות לימפה מזנטריות ואתרי אפקטור כולל למינה פרופריה ואפיתל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה הרירית כגון הבנת התגובות החיסוניות לזיהומים במערכת העיכול, סרטן ומחלות דלקתיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מבטיחה בידוד של לימפוציטים מטוהרים וברי-קיימא מתאים נפרדים של המעי הדק עם זיהום חוצה תאים מינימלי.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שזה מאתגר לזהות ולבודד בלוטות לימפה מזנטריות ומדבקות פייר ולאזן מהירות ודיוק לתשואות אופטימליות. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הניחו עכבר שהורדם בעבר על גבו ורססו אותו באתנול 70%. השתמש במספריים כדי לבצע חתך בקו האמצע ולפתוח את העור ואת דופן הבטן כדי לחשוף את חלל הצפק.

לאחר מכן, אתר את הצקום והשתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את הצקום. השתמש במלקחיים כדי להזיז בזהירות את המעי הדק ימינה ולחשוף את כל בלוטות הלימפה המזנטריות או שרשרת ה-MLN המיושרת עם המעי הגס. זהה את הצומת התחתון בשרשרת הממוקם הכי קרוב לצקום.

השתמש בסט אחד של מלקחיים כדי לתפוס את שומן המזנטריה סביבו ולהזיז בעדינות את שרשרת ה-MLN מלמטה למעלה על ידי פינצטה של השומן סביב בלוטת הלימפה עם סט נוסף של מלקחיים. לאחר מכן הרטיבו מגבת באמצעי קציר והניחו את שרשרת ה- MLN על מגבת הנייר. הסר שומן מזנטרי על ידי גלגול השרשרת על מגבת הנייר ומשיכת השומן בעזרת שני סטים של מלקחיים.

הנח את ה-MLN באמצעי קציר קר לשלבי בידוד מאוחרים יותר. בעזרת מספריים חותכים את המעי הדק מתחת לסוגר הפילורי ומעל הצקום. משוך את המעי החוצה לאט מהאילאום לתריסריון באמצעות סט אחד של מלקחיים תוך הסרת שומן המזנטריה המצורף באמצעות סט נוסף של מלקחיים.

הניחו את המעי על מגבת נייר לחה במצע קציר והקניטו את כל שומן המזנטריה שנותר בשני סטים של מלקחיים. שמור על המעי לח לאורך כל השלבים הללו על ידי מריחת אמצעי קציר מעת לעת. אסוף את המדבקות של פייר על ידי הסרתן מהמעי בעזרת מספריים מעוקלות.

יש לאסוף 5-11 מדבקות פייר מהמעי הדק. הנח את מדבקות הפייר באמצעי קציר קר לשלבי בידוד מאוחרים יותר. השתמש בצד השטוח של המלקחיים והחלק בעדינות מהתריסריון לכיוון האילאום כדי להוציא תוכן צואה וריר.

חזור על שלב זה פעם אחת כדי להסיר את רוב הריר. השתמש במספריים עדינים עם קצה קהה בנקודה אחת, הכנס את הקצה הבוטה למעי וחתך את המעי פתוח לאורך מהתריסריון לאילאום. חותכים לרוחב את המעי הפתוח לחתיכות של שני סנטימטרים.

הנח את חלקי המעי בצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם אמצעי קציר קר של 25 מיליליטר לשלבי בידוד מאוחרים יותר. בודד לימפוציטים מה-MLN על ידי ניתוקם בעדינות דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר באמצעות בוכנה של מזרק של שלושה מיליליטר. שוטפים את מסננת התאים עם חמישה מיליליטר של אמצעי קציר קר.

גלולה את תאי ה-MLN על ידי צנטריפוגה שלהם בכוח הכבידה פי 400 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא במדיית קציר קר של מיליליטר אחד. שטפו את חתיכות המעי הדק שלוש פעמים עם 25 מיליליטר של חומר קציר קר על ידי היפוך הצינור 10 פעמים.

הניחו לחתיכות המעיים להתייצב ושפכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר של תמיסת דיתיואריתריטול או DTE שחוממה מראש לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל חתיכות מעיים והעביר את התכולה לבקבוק ארלנמאייר סיליקון של 50 מיליליטר עם מוט ערבוב. השתמש במגנט גדול בחלק החיצוני של הבקבוק כדי להחזיק את מוט הערבוב ולהעביר את הרקמה והתמיסה בחזרה לצינור החרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן מערבל את הצינור בהגדרה המקסימלית למשך 10 שניות. העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, תוך הקפדה לשמור את חלקי הרקמה בצינור המקורי. גלולה את התאים.

השעו מחדש את גלולת התא במדיית קציר קר של 10 מיליליטר ואחסנו על קרח. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת DTE מחוממת מראש לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל חתיכות מעיים והעביר בחזרה לבקבוק ארלנמאייר 50 מיליליטר סיליקון המכיל מוט ערבוב. השתמש במגנט גדול בחלק החיצוני של הבקבוק כדי להחזיק את מוט הערבוב ולהעביר את הרקמה והתמיסה בחזרה לצינור החרוטי של 50 מיליליטר.

מערבולת את הצינור בהגדרה המקסימלית למשך 10 שניות. העבירו את הסופרנטנט דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך הצינור שמכיל תאים מהסופרנטנט של טיפול ה-DTE הראשון וצנטריפוגה של התאים. השעו מחדש את גלולת התא בשמונה מיליליטר של 44% שיפוע צפיפות או תמיסת DG בטמפרטורת החדר.

העבירו את תמיסת שמונה מיליליטר 44% DG ואת תרחיף התאים לצינור תחתון עגול של 17 מילימטר על 100 מילימטר 14 מיליליטר פוליפרופילן. שכב את התאים בחמישה מיליליטר של תמיסת RT 67% DG. צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 1,600 למשך 25 דקות ב-RT ללא שימוש בבלם.

תאים ברי קיימא יוצרים מעיל באפי בממשק של 44% ו-67%. הסר את שכבת השומן מלמעלה על ידי שאיבת ואקום. השתמש בפיפטה של פסטר כדי לקצור את מעיל הבאפי בממשק ולהעביר לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר מדיה לקציר קר.

תאי גלולה על ידי צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 400 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשעיה מחדש של כדור התא במדיית קציר קר של מיליליטר אחד. הסר תאי אפיתל מחתיכות רקמת המעי על ידי הוספת 25 מיליליטר של תמיסת EDTA מחוממת מראש לחלקי המעיים הנותרים והעביר את התוכן לבקבוק ארלנמאייר סיליקון של 50 מיליליטר עם מוט ערבוב וערבב. החזיקו את מוט הערבוב והשליכו בזהירות את הסופרנטנט תוך שמירה על חתיכות המעיים בבקבוק.

חזור על שלב הסרת תאי האפיתל פעם נוספת. לאחר מכן, הוסף 50 מיליליטר של חומרי קציר בטמפרטורת החדר וערבב את התוכן בקצרה בעזרת מגנט. לאחר מכן הניחו לחתיכות המעיים להתייצב והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.

מוסיפים 30 מיליליטר תמיסת קולגנאז שחוממה מראש ומערבבים את חתיכות המעי. לאחר ערבוב, העבירו את הרקמה המעוכלת והסופרנטנט לצינור חרוטי של 50 מיליליטר דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. נתק בעדינות את חלקי הרקמה הנותרים על ידי שימוש בבוכנה של מזרק של שלושה מיליליטר כדי לרסק את המסנן.

שטפו את המסנן עם 10 מיליליטר של אמצעי קציר קר וגלו את התאים. לאחר הסיבוב, השעו מחדש את גלולת התא בשמונה מיליליטר של תמיסת טמפרטורת סביבה 44% DG. העבירו את שמונת המיליליטר של מתלה תא תמיסת 44% DG לצינור תחתון עגול טרי בגודל 70 מילימטר על 100 מילימטר מפוליפרופילן.

שכב תחתון עם חמישה מיליליטר טמפרטורת סביבה 67% DG ואז צנטריפוגה את השיפועים. הסר את שכבת השומן מלמעלה על ידי שאיבת ואקום. השתמש בפיפטה של פסטר כדי לקצור את מעיל הבאפי בממשק ולהעביר לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר מדיה לקציר קר.

לבסוף, השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של אמצעי קציר קר. כל תא חיסון במעי מאופיין בהרכב ייחודי של תת-קבוצות לימפוציטים. ה-MLN מורכב בעיקר מתאי אלפא בטא T בעוד שלימפוציטים PP הם בעיקר תאי B.

הרכב לימפוציטים LP מורכב בעיקר מתאי אלפא בטא T ותאי B. IEL הם בעיקר תאי T גמא דלתא ותאי T אלפא בטא ללא תאי B. תאי T אלפא בטא חיוביים CD8 בתוך תאי LP ו-IEL ביטאו את הומודימר אלפא CD8 או הטרודימר אלפא בטא CD8 בעוד שתאי T אלפא בטא חיוביים CD8 באתר אינדוקטיבי ביטאו בעיקר את ההטרודימר אלפא בטא CD8

רוב תאי הגמא דלתא T בתא IEL ביטאו CD8 אלפא בעוד שתאי T גמא דלתא שנמצאו ב-MLN חסרים CD8 אלפא. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להקדיש מספיק זמן וטיפול במהלך שלבי בידוד הרקמות כדי להגביל את הזיהום בין תאי המעיים. לאחר הליך זה, לימפוציטים מבודדים יכולים להיות נתונים לגירוי ex vivo, ציטומטריית זרימה וטכניקות אחרות לניתוח פנוטיפי ותפקודי נוסף.