Name: בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למדו לבודד ולגדל מקרופאגים אלבאולריים מריאות עכברים ואנושיים במבחנה. שיטה זו מאפשרת אוכלוסייה מטוהרת לחקר אימונולוגיה ריאתית ותפקיד התאים בזיהומים נשימתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים קלייר פרנדרגסט לקבלת סיוע בעריכה את כתב היד. DKN נתמך על ידי מחקר מענק (#2095) של קרן Flinn, TM נתמכת על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01HL056643 ו- R01HL092514). DKN פיתחו את השיטות המחקר תוכנן, כתב היד; אום סייע עם מחקרים שנעשו בבעלי חיים והרכש הדגימה הקלינית; SB סייע עם זרימה cytometric ניתוח ומיון תא; TM ומפוקח המחקרים שנסקרו כתב היד.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה (IACUC), את המוסדיים סקירה לוח (IRB) בבית החולים סנט גוז'ף המרכז הרפואי.
1. בידוד של AMs של נוזל Bronchoalveolar מאתר שטיפה (BAL)
<ol><li>להרדים על העכבר C57BL/6 בת שבוע 8 עם קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (12.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) קוקטייל באמצעות הזרקה בקרום הבטן. המשך כאשר העכבר משיגה הרדמה כירורגית עם אובדן רפלקסים והרפיה של השרירים.</li>
	<li>הנח את העכבר על משטח חיתוך עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה. הוטרינר אופטלמולוגיות משחה למרוח את העיניים כדי למנוע התייבשות, לנגב את המשטח הגחון כל של העכבר עם רפידות ההכנה סטרילית אלכוהול רווי אלכוהול איזופרופיל 70% לחטא.</li>
	<li>הר העכבר כל ארבע רגליים מרוסנת.</li>
	<li>בעדינות פתח את חלל הבטן בעזרת כלי ניתוח מיקרו. חייבים להקפיד לפתוח כמה שטח ככל האפשר מבלי לפגוע בכל האיברים מהבטן או יצירת רקמות לראשיכם.</li>
	<li>בעדינות פתח בחלל בית-החזה על ידי לאט אם הצלעות דרך חלל החזה. באופן אידיאלי, הצלעות אפשר להוציא מצד לצד. קיצוני חייבים להקפיד שלא לפצוע את קרום הריאות של הריאות בעת פתיחת בחלל בית-החזה.</li>
	<li>אתר הכלילי התחתון ולאחר בחתך לדמם את העכבר. השתמש סופג כותנה רפידות לספוג את הדם.</li>
	<li>להזריק 10 מ ל תמיסת מלח קרה כקרח פוספט buffered (PBS) לתוך החדר הימני (באמצעות מזרק 10 מ"ל ואת המחט 25 גרם) ריקון כדוריות הדם במחזור. לספוג את זרימת הדם עם ריפוד סופג כותנה. ברגע לגמרי perfused, הריאות יופיעו blanched והם מוכנים ואז שטיפה.</li>
	<li>בעדינות לחתוך את העור, שריר בצוואר כדי לחשוף את דרכי הנשימה. בזהירות לסלק את השרירים סמוכים, הסחוסים, רקמות שומן ללא פגיעה קנה הנשימה.</li>
	<li>עושים חתך קטן (< 2 מ מ) על קנה הנשימה האחורי הגרון. החתך צריך להיות מספיק כדי להכניס צנתר אל תוך קנה הנשימה עדיין מחובר הגרון. נחדיר קטטר 22 גרם 1 אינץ בלי מחט לתוך קנה הנשימה אל הריאות. מאובטחים הצנתר בתפר קלועה משי (4-0; המוזרק) עם קשר מרובע. הערה: הצנתר צריך להיות מעוטרים בהתבסס על גודל העכבר. קטטרים מאוד קצרים או ארוכים נוטים לדלוף ו/או לקרוע את דרכי הנשימה במהלך שטיפה. קטטר אורך צריך להיות כזה כי כאשר מוכנס שרידי עצה טוב בתוך קנה הנשימה, לא להגיע הסמפונות העיקריים.</li>
	<li>לצרף מזרק 1-mL מלא קפואים BAL מאגר (Ca2 + ו מ ג2 + PBS חינם + 1 מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה, EDTA) את הקטטר, לאט לאט להחדיר את המאגר לריאות. זה מנפח הריאות. לשמור את המזרק מחובר הקטטר למשך חמש שניות, ואז האחות נוזל שטיפה על ידי משיכה עדינה הבוכנה. זה השטחת קצה הריאות. לאסוף את הנוזל 15 מ"ל צינור חרוטי המוטלות על קרח.</li>
	<li>חזור על שלב 1.10 9 פעמים יותר, בריכה נוזל שטיפה. לא יעלה על 1 מ"ל מאגר פלאש, זה עשוי לחרוג ריאות, להוביל את הקרע.</li>
	<li>המתת חסד את העכבר עם CO2 יתר על-ידי פרוטוקול IACUC אושרה.</li>
	<li>Centrifuge את הנוזל 10 מ ל BAL ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בגדר התא מכיל תאים BAL. התראה: בגדר עשוי להיות קטן מאוד, אז לנקוט זהירות בעת כ רפה בעברית את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend התאים BAL μL 100 של זרימה/מיון מאגר (PBS + 2% חום לא פעיל העובר שור סרום (FBS) + 1 מ"מ EDTA + 25 מ מ של חומצה N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)).</li>
	<li>לחסום את האיגוד לא ספציפית נוגדנים לקולטן Fc על-ידי הוספת בלוק Fc העכבר (לשבט 2.4G2, μg/מ"ל), המקננת במשך 20 דקות על קרח.</li>
	<li>לבצע נוגדן מכתים יחד עם פלורסצנטיות מינוס אחד (FMO) ושולט יחיד-כתם11,25. להעריך את הכדור התאים על ידי מנתח תא (ראה טבלה של חומרים) ואחריו ניתוח cytometry זרימה בתא יחיד על-ידי תוכנת ניתוח המתאים (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לבודד AMs על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית סדרן (ראה טבלה של חומרים) ישירות לתוך עכבר 1 מ"ל אני תרבות בינוני כאשר AMs מיועדות חוץ גופית בתוך התרבות או ויוו תא העברה. לחלופין, מיון AMs לתוך מאגר פירוק 1 מ"ל (ראה טבלה של חומרים) בתוספת 10 μL/mL β-Mercaptoethanol לחילוץ RNA.</li>
</ol>2. בידוד של AMs של העכבר הריאה, תא בודד השעיה
<ol><li>להרדים על העכבר C57BL/6 בת שבוע 8 עם קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (12.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) קוקטייל באמצעות הזרקה בקרום הבטן. המשך כאשר העכבר משיגה הרדמה כירורגית עם אובדן רפלקסים והרפיה של השרירים.</li>
	<li>הנח את העכבר על משטח חיתוך עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה. הוטרינר אופטלמולוגיות משחה למרוח את העיניים כדי למנוע התייבשות, לנגב את המשטח הגחון כל של העכבר עם רפידות סטרילית אלכוהול רווי אלכוהול איזופרופיל 70% לחטא.</li>
	<li>הר העכבר כל ארבע רגליים מרוסנת.</li>
	<li>בעדינות פתח את חלל הבטן בעזרת כלי ניתוח מיקרו. חייבים להקפיד לפתוח כמה שטח ככל האפשר מבלי לפגוע בכל האיברים מהבטן או יצירת רקמות לראשיכם.</li>
	<li>בעדינות פתח בחלל בית-החזה על ידי לאט אם הצלעות דרך חלל החזה. באופן אידיאלי, הצלעות אפשר להוציא מצד לצד. קיצוני חייבים להקפיד שלא לפצוע את קרום הריאות של הריאות בעת פתיחת בחלל בית-החזה.</li>
	<li>אתר הכלילי התחתון ולאחר בחתך לדמם את העכבר. השתמש סופג כותנה רפידות לספוג את הדם.</li>
	<li>להזריק PBS קר כקרח 10 מ"ל לתוך החדר הימני (באמצעות מזרק 10 מ"ל ואת המחט 25 גרם) ריקון כדוריות הדם במחזור. ברגע לגמרי perfused, הריאות יופיעו blanched והם מוכנים לקציר.</li>
	<li>שווייץ הריאות באמצעות ניתוק את קנה הנשימה, הדם והרצועות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ של קור בינונית ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM). לשמור את זה על הקרח עד השלב הבא.</li>
	<li>המתת חסד את העכבר עם CO2 יתר על-ידי פרוטוקול IACUC אושרה.</li>
	<li>להעביר את הריאות perfused לתוך תבשיל תרבות סטרילי ללא pyrogen 60 מ מ עם 3 מ ל DMEM. בעזרת מלקחיים לנתח להקניט את דרכי הנשימה וחומר קשה הרקמה הלא-ריאה אחרות, אם קיים. מינצ רקמת הריאה עם איזמל כדי < בגודל 1 מ מ.</li>
	<li>להוסיף 300 µg/mL Liberase TL ו- 5 U/mL DNase, לערבב על-ידי pipetting, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור במשך 25 דקות. בעדינות לערבב פעם אחת על-ידי pipetting אחרי 10 דקות.</li>
	<li>עוברים את הריאות dissociated דרך מסננת תא 100 מיקרומטר מותקן צינור חרוטי 50 מ. להשתמש בגב בוכנה של מזרק 1 מ"ל מחית את הגושים תא מסנן. שטוף את המסנן עם 20 מ ל שטיפת מאגר (PBS + 2% חום מוחלש FBS + 2 מ מ EDTA).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא במאגר שטיפת 20 מ.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.12 ו 2.13 פעמיים, שינוי מסנן ' ' הצינור בכל פעם. -השריה המסנן במאגר לשטוף יותר מ-5 דקות מגביר את התשואה AM. להכין התליה תא בודד על-ידי הוספת 100 μL זרימה/מיון המאגר כדי בגדר התא.</li>
	<li>לחסום את האיגוד לא ספציפית נוגדנים לקולטן Fc על-ידי הוספת בלוק Fc העכבר (לשבט 2.4G2, μg/מ"ל), המקננת במשך 20 דקות על קרח.</li>
	<li>לבצע נוגדן מכתים יחד עם FMO ויחיד-כתם פקדים11,25. להעריך את הריאה תאים על-ידי מנתח תא (ראה טבלה של חומרים) ואחריו cytometry זרימה בתא יחיד ניתוח על ידי ניתוח תוכנה.</li>
	<li>AMs מיון לפי סדרן התא (ראה טבלה של חומרים) ישירות לתוך עכבר 1 מ"ל. אני בינוני תרבות AMs מיועדות חוץ גופית בתוך התרבות או ויוו תא העברה. לחלופין, למיין AMs לתוך 1 מ"ל מאגר פירוק בתוספת 10 μL/mL β-Mercaptoethanol לחילוץ RNA.</li>
</ol>3. בידוד של AMs של נוזל BAL אנושי
<ol><li>לארגן העברה של נוזל BAL האדם מהמרפאה למעבדה ב 4 º C.</li>
	<li>Centrifuge הנוזל BAL (10-50 מ"ל) ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בגדר התא מכיל תאים BAL11.</li>
	<li>לשטוף את גלולה עם 20 מ ל שטיפת מאגר (PBS + 2% חום מוחלש FBS + 2 מ מ EDTA), צנטריפוגה ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>Resuspend BAL התאים נמצאים μL 100 של זרימה/מיון מאגר (PBS + 2% חום מוחלש FBS + 1 מ"מ EDTA + 25 מ מ HEPES).</li>
	<li>לחסום את האיגוד נוגדן ספציפי לקולטן Fc על-ידי הוספת בלוק Fc אנושי (שיבוט Fc1.3070, 25 μg/mL) המקננת במשך 20 דקות על קרח.</li>
	<li>לבצע נוגדן מכתים יחד עם FMO, יחיד-כתם פקדים11,24. להעריך את הכדור התאים על ידי מנתח תא (ראה טבלה של חומרים) ואחריו cytometry זרימה בתא יחיד ניתוח על ידי ניתוח תוכנה.</li>
	<li>AMs מיון לפי סדרן התא (ראה טבלה של חומרים) ישירות לתוך 1 מ"ל AM האנושי תרבות בינוני או 1 מ"ל פירוק מאגר בתוספת 10 μL/mL β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>4. in vitro לקשרי תרבות של AMs
<ol><li>בעקבות תא המיון, לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו ב 250 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>Resuspend האנושי AMs 1 מ"ל אדם בינוני תרבות AM [רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) 1640 בתוספת 10% FBS, 20% L-929 התרבות supernatant (כמקור של המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), הריכוז הסופי של 100 U/mL). פירובט נתרן 1 מ מ, 10 מ מ N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic חומצה (HEPES) ו 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי)]. באופן דומה, resuspend העכבר AMs 1 מ"ל העכבר AM תרבות בינוני [DMEM בתוספת 10% FBS, 20% L-929 התרבות supernatant (כמקור של M-CSF, הריכוז הסופי של 100 U/mL), 1 מ"מ נתרן פירובט, 10 מ מ HEPES ו- 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי )].</li>
	<li>ספירת trypan blue-להוציא התאים קיימא מאת מונה תא ולהתאים את הריכוז תא קיימא-עונה 1 פרק 106/mL. הערה: באופן אידיאלי, עד כדי 5 x 105 AMs ניתן מבודד נוזל BAL שנאסף על העכבר זכר C57BL/6 בשבוע 8-10 הישן. התשואה AM מן התקציר הריאות העכבר משתנה וייתכן מעט פחות מזו של הנוזל העכבר BAL. התשואה AM נוזל BAL אנושי תלוי כמות הנוזל בל, הנפח הכולל של תמיסת מלח משמש את שטיפת, מצבו הקליני של החולה.</li>
	<li>בהתבסס על התשואה והצורך ניסיוני, זרע תאי קאמרית שקופיות, תרבות מנות או תרבות מבחנות. באופן אידיאלי, זרע את AMs-עונה 1 פרק 10 /mL5בינונית 10 מ ל בקבוקון T25 תרביות רקמה.</li>
	<li>דגירה התאים חממה humidified 37 ° C עם 5% CO2 אווירה. הערה: AMs יגדל כאשר תאים חסיד והם מאוד הגדלים לאט (הכפלת זמן > 7 ימים).</li>
	<li>ב- 24 שעות לאחר זריעה, AMs צריך להיות חסיד, לא להיות מנותק על-ידי שינוי עדין של תרבות בינוני. להסיר את המדיום על ידי השאיפה מקצה אחד, לחדש בינונית טרייה מראש התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. הערה: התאים כעת ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעות של גירויים לפיזיולוגיה AM. AMs גדל בשקופיות קאמרית יכול להיות מוכתם בנוחות עם נוגדנים המתאימים, והינם אידיאליים בעבור ויזואליזציה מיקרוסקופיים. להערכת cytometric זרימה, נקצרים AMs על ידי דגירה-אנזימטי תא בריא פתרון.</li>
	<li>האחות המדיום תרבות ולהוסיף בריא פתרון מספיק כדי לכסות את המשטח תרבות (כ 2 מ"ל לכל T25 הבקבוק), תקופת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס של 5-10 דקות. גירוד לא יהיה צורך, לא מומלץ לגרד את התאים באופן מכני. טפח בעדינות בצדדים, להוסיף 1-2 מ ל זרימה/מיון מאגר, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק את הרוב של תאים חסיד.</li>
	<li>ללימודים RNA, lyse התאים ישירות על המנה תרבות על-ידי הוספת המאגר פירוק.</li>
</ol>

<ol><li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li>
<li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140(2017).</li>
<li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li>
<li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053(2014).</li>
<li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li>
<li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li>
<li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li>
<li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection%3A+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha%2C+T+helper+1%2FT+helper+2+cytokines%2C+IgG+subclasses%2C+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li>
<li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li>
<li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%3A+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113(2014).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li>
<li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li>
<li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li>
<li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li>
<li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li>
<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

AMs הם חיים ארוך ריאות תושב מקרופאגים that לאכלס את הריאות החל בלידה, ומתמשך לאורך כל תוחלת החיים26. תפקידיהם פיזיולוגיה ריאתי7 ופתולוגיה12 ו את הפוטנציאל שלהם כדי לנבא מחלת חיסון עצמי ריאתי24 זוהו. כי AMs יש נוכחות ארוכת טווח הריאות11,27 , כי הם מעורבים ההפעלה והתקדמות של11,תגובות חיסוניות24, שלהם תפקידים ב אח...

Microenvironment ריאות הוא מערכת אקולוגית מורכבת באופן ייחודי עם צינור אוויר משוכללים, להערכת. האוויר הנשאף נוסע דרך קנה הנשימה ודרך אינספור ענפי הסמפונות bronchioles לפני שהגיע alveoli, שבו מתרחשת ההחלפה גז דם-אייר. עקב אינטראקציה ישירה עם האווירה, השטח הנשימה מחייבת הגנה מפני השפעות מזיקות של חלקיקים מוטס מזהמים. מספר המחסומים פיזי, כימי, אוטואימונית להגן על הריאות. ראוי לציין, פריסה של phagocytes על פני הנשימה מגישה מערכת ההגנה קו ראשון חשוב. מכתשי מקרופאגים (AMs) הן סוג אחד של phagocytes ריאות תושב, הם מהווים את הרוב המכריע של הבריכה מקרופאג ריאות. כפי שמרמז שמם, AMs המותאמות לשפה בעיקר לומן מכתשי, להתרחש כמו תאים sessile כל הזמן לטעום את האווירה הסביבתית ולתקשר עם האפיתל מכתשי1. מצב יציב בריאות יותר מ 95% של phagocytes בחלל מכתשי הם AMs2, של מי הרכב עשוי לשנות עקב דלקת, זיהום או חשיפה כרונית לחומרים מזהמים.
AMs להשתתף במגוון רחב של פונקציות שעשויות להיות מקומי אל הריאות ו/או חשיבות מערכתית. לדוגמה, AMs חיוניים להתפתחות ולתפקוד מיטבי של הריאות; מעקב המערכת החיסונית; סיווג של פסולת הסלולר, פתוגנים פולשים, בשאיפה חלקיקים3,4,5,6,7. דלדול יישוב של AMs ידוע לפגום סיווג של הנשימה וירוסים, חיידקים4,8. מלבד להיותם phagocytes ולוחמים השורה הראשונה של הומאוסטזיס ריאתי, AMs ידועים לתפקד כתא תאים אנטיגן הצליחו יותר במשיכת T חסינות9, potentiating את היעילות של החיסון תוך-אפי10 ו המשפיעים על מחלת חיסון עצמי בעל הגבלת הריאות אחרי11,השתלת ריאות12. ליקוי בתפקוד AM נקשר proteinosis מכתשי ריאתי (PAP), מצב הנובע מוטציה גנטית, ממאירות או זיהום זה פוגע סיווג פיתחה ריאתי13,14. עכשיו הוא להיות חקר השתלת של AMs כמו גישה טיפולית לטיפול של PAP 15,16.
AMs ידועים מקורם במהלך מופרה, מתעקש הריאות לאורך החיים מבלי להיות מוחלף על ידי במחזור לויקוציטים2,17. אמנם, מחזור AM לגילוי homeostatic בריאות, רמות משתנות של מחזור AM דווחו בתנאים מסוימים קליני כולל זיהום על ידי וירוס שפעת4, הקרנה myeloablative18, חשיפה אנדוטוקסין 19, לגיל20. AMs האמינו לחדש עצמי באמצעות התפשטות בדרגה נמוכה17,21, אך מחקרים אחרונים טוענים כי ומונוציטים יכולים להצמיח אוכלוסיה של הריאה קרישה תוך-כלית מקרופאגים22,23 תחת תנאים ניסיוני, אבל הפונקציונליות של מקרופאגים ריאתי שהומר לאחרונה אלה טרם יוגדר על מחלות ריאה. יתר על כן, הבנת את סף הגירוי בהקשר של הפעלת AM היא אזור שעשוי להיות מעניין, כפי הריאה מנסה לשמור על איזון בין אותות דלקתיים המכונות immunoregulatory.
התיקונים הפיזיולוגיות או פיפטות להוביל לאובדן של ויסות מערכת החיסון חשובים להערכה במסגרות קליניות שונות (למשל, זיהומים בדרכי הנשימה, מחלות ריאה דלקתיות, מחלות ריאה שהותירה). למרות זאת, AMs מזוהים יותר ויותר מחוונים או אפילו גורמים של בריאות ריאתי11,24. כיום, ישנם פרוטוקולים מאוחד לא זמינה עבור קציר, אפיון, ו/או AMs לשמירה על בני אדם, במודלים מאתר פרה. היעדר קונצנזוס על סימנים מקדימים AM ו פנוטיפים ולאחר היעדרות של מתודולוגיה מפורט היה המחסום העיקרי בפיענוח תפקידים בבוקר על ריאות בריאות ומחלה. להלן כללי התנהגות מציע לנו זיהוי ודאי, בידוד, במבחנה אסטרטגיה תרבות מאוד לקדם את ההבנה של התנהגות AM, להקל על מחקרים האבחון והטיפול, ממוקדות AM.

<table><tbody><tr><td>תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet</td><td>Ointment Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G קטטר&nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 תפר קלוע משי שאינו נספג&nbsp;</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s פוספט חוצץ מלח&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Fc בלוק&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה (ערכת RNA PureLink)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>ב-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סדרן תאים FACSAria II&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>קטמין&nbsp; (קטתזיה)</td><td>הנרי שיין</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין&nbsp; (אנאסד)</td><td>אקורן</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>קורנינג</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>קורנינג</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>ליבראז TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; מסננת תאים M&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>בלוק Fc אנושי</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>קורנינג</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים L-929</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי</td><td>ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 בקבוק תרבית רקמות</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>156367 צלחת תרבית 60 מ"מ&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 50 מ"ל&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa מנתח תאי</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>תוכנת ניתוח</td></tr><tr><td>אנטי-CD45 (עכבר)</td> <td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC מצומד</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (עכבר)</td> <td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 מצומד</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (עכבר)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>שיבוט N418, BV 421 מצומד</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (עכבר)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>שיבוט AF6-120.1, PE/Cy7 מצומד</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (עכבר)BD</td> <td>Biosciences</td><td>562757</td><td>שיבוט E50-2440, PE-CF594 מצומד</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (עכבר)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>שיבוט 551, מצומד</td></tr><tr><td>PE אנטי-F4/80 (עכבר)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>שיבוט BM8, APC/Cy7 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-Ly-6C (עכבר)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>שיבוט HK1.4, BV605 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD64 (עכבר)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>שיבוט X54-5/7.1, BV711 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD24 (עכבר)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>שיבוט M1/69, BV510 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD103 (עכבר)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>שיבוט OX-62, BV650 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD317 (עכבר)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>שיבוט 927, מצומד</td></tr><tr><td>APC אנטי-CXCR1 (עכבר)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>שיבוט SA011F11, BV785 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD45 (אנושי)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>שיבוט HI30, AF488 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD11b (אנושי)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>שיבוט M1/70, PE/Cy7 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-HLA-DR (אנושי)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>שיבוט L243, APC/Cy7 מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD169 (אנושי)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>שיבוט 7-239, APC מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD206 (אנושי)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>שיבוט 15-2, PE מצומד</td></tr><tr><td>אנטי-CD163 (אנושי)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>שיבוט GHI/61, BV421 מצומד</td></tr></tbody></table>

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

עיצור מכתשי, מקרופאגים הם מקרופאגים סופני הבדיל, ריאות-תושב ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים מכתשי הייחודיות שלהם חיים ארוכים, שלהם תפקיד חשוב פיתוח ריאות ו פונקציה, וכן מותאם לשפות אחרות ריאות התגובות שלהם זיהום ודלקת. נכון להיום, אין שיטה אחידה זיהוי, בידוד של טיפול של מקרופאגים מכתשי מן בני אדם ועכברים קיימת. השיטה יש צורך במחקרים על אלה תאים חיסוניים מולדת חשוב במסגרות שונות ניסיוני. השיטה המתוארת כאן, אשר יכולים לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה, היא גישה מפושטת קציר מקרופאגים מכתשי נוזל שטיפה bronchoalveolar או רקמת הריאה, שמירה על אותם בתוך חוץ גופית. מאחר מקרופאגים מכתשי מתרחשים בעיקר בתור תאים חסיד של alveoli, המיקוד של שיטה זו הוא על הם מוציאים אותם לפני הקציר וזיהוי. הריאה הוא איבר מאוד vascularized, סוגי תאים שונים של תאים מיאלואידים ומקור הלימפה המאכלסים, אינטראקציה, והם מושפעים microenvironment הריאה. באמצעות הסט של סמני פני השטח המתואר כאן, חוקרים יכולים בקלות באופן חד משמעי להבדיל מקרופאגים מכתשי לבין אחרים לויקוציטים, לטהר אותם ליישומים במורד הזרם. שיטת תרבות פיתח בזאת תומך אנושיים והן העכבר מקרופאגים מכתשי לצמיחה בתוך חוץ גופית ו תואמת ללימודי תאית ומולקולרית.

הגישה cytometric זרימה כדי לזהות העכבר AMs מוצג באיור1. זה כולל ניתוח של ערכה מינימלית של הצורך בהבחנה AMs של אחרים phagocytes ריאות-תושב או ריאות הסתננות משטח סמנים. ניתוח דיפרנציאלית נדרש כדי לזהות באופן חיובי AMs של מקרופאגים אינטרסטיציאליות, תאים דנדריטים, נויטרופילים, ומונוציטים ו מקרופאגים ריאתי נגזר מונוציט להתרחש בתוך הריאות. התוכנית הבאה של סמני פני השטח יכול להיות מועסק להבחין בקלות מסוגי התאים אחד מהשני איפה AMs CD45+, C...

תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מקרופאגים מכתשית אנושית ועכברים מהריאות ומנוזל שטיפת הסימפונות ולפתח את השיטה לתרבית במבחנה שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה הפולמונו, כגון תפקידם של מקרופאגים מכתשית בזיהום בדרכי הנשימה, דלקת ואוטואימוניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להבחין בין המקרופאגים המכתשית לבין לויקוציטים אחרים של הריאות ולהשיג אוכלוסייה של מקרופאגים מכתשית מטוהרים מאוד למטרות ניסוי.הנח עכבר מורדם על משטח דיסקציה כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה. מרחו משחה וטרינרית עיניים על העיניים למניעת התייבשות. נגב את כל משטח הגחון של העכבר עם רפידות הכנה לאלכוהול סטריליות, רוויות ב-70% איזופרופנול, כדי לחטא.התקן את העכבר כשכל ארבע הרגליים נשמרות. פתח בעדינות את חלל הבטן בעזרת כלי מיקרו דיסקציה. יש להקפיד על פתיחת שטח רב ככל האפשר מבלי לפגוע באיברים קרביים או ליצור רקמה תלויה.פתח בעדינות את חלל בית החזה על ידי חתך איטי של כלוב הצלעות דרך המדיאסטינום. באופן אידיאלי, ניתן לכרות את כלוב הצלעות מצד לצד. יש להקפיד מאוד שלא לפגוע בצדר הריאות בעת פתיחת חלל בית החזה.אתר את הווריד הנבוב התחתון ובצע חתך כדי לדמם את העכבר. השתמש ברפידות כותנה סופגות כדי לספוג דם. הזריק 10 מיליליטר של מי מלח פוספט קר כקרח לחדר הימני כדי לשטוף את תאי הדם במחזור הדם.לספוג את זרימת הדם בעזרת רפידות כותנה סופגות. לאחר החדרה מלאה, הריאות ייראו מולבנות ואז יהיו מוכנות לשטיפה. חתכו בעדינות את העור והשריר בצוואר כדי לחשוף את דרכי הנשימה.כרתו בזהירות את השרירים, הסחוסים ורקמות השומן הסמוכים, מבלי לפגוע בקנה הנשימה. לאחר מכן, בצע חתך קטן בקנה הנשימה, אחורי לגרון. חתך זה אמור להספיק בדיוק כדי להכניס קטטר לתוכו בזמן שקנה הנשימה עדיין מחובר לגרון.השלב הקריטי ביותר באיסוף נוזל BAL הוא חיבור מאובטח של קטטר לקנה הנשימה שימזער דליפות במהלך שטיפה. הכנס קטטר בגודל 22 אינץ' ללא מחט לקנה הנשימה לכיוון הריאות. אבטח את הקטטר עם תפר קלוע משי וקשר מרובע.בעל ידיים חסונות ולביצוע שלב זה, מונע לאט ובעדינות קרע של קנה הנשימה והריאות. חבר מזרק מיליליטר אחד, מלא במאגר BAL קר כקרח לצנתר והחדיר לאט את המאגר לריאות. זה ינפח את הריאות.השאר את המזרק מחובר לקטטר למשך חמש שניות, ולאחר מכן שאב את נוזל השטיפה על ידי משיכה עדינה של הבוכנה. זה ירוקן את הריאות. אוספים את הנוזל בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, המונח על קרח.חזור על הניפוח והדפלציה תשע פעמים נוספות, ואגד את נוזל השטיפה. אין לחרוג ממיליליטר אחד של חיץ לכל שטיפה, מכיוון שהדבר עלול לחרוג מקיבולת הריאות ולהוביל לקרע שלה. צנטריפוגה של 10 מיליליטר נוזל BAL ב -250 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.כדורית התא מכילה תאי BAL. השעו מחדש את תאי ה-BAL ב-100 מיקרוליטר של מאגר מיון זרימה. המשך לצבוע ולמיין את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.הכן עכבר מורדם לדיסקציה, בצע חתכים ודימם את העכבר כמו קודם. הזריק 10 מיליליטר PBS קר כקרח לחדר הימני כדי לשטוף את תאי הדם במחזור הדם. לאחר החדרה מלאה, הריאות ייראו מולבנות ומוכנות לקציר.נתח את הריאות על ידי ניתוק קנה הנשימה, כלי הדם והרצועות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, עם חמישה מיליליטר DMEM קר. שמור אותו על קרח עד השלב הבא. העבירו את הריאות המוחדרות לכלי תרבית סטרילי ונטול פירוגן של 60 מילימטר עם שלושה מיליליטר DMEM.בעזרת ניתוח מלקחיים, הקניטו את דרכי הנשימה וחומר רקמה קשה אחר שאינו ריאה, אם קיים. טוחנים את רקמת הריאה בעזרת אזמל לגודל של פחות ממילימטר אחד. הוסף 300 מיקרוגרם למיליליטר של Liberase TL, וחמש יחידות למיליליטר של DNAse אחד.מערבבים על ידי פיפטינג ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה למשך 25 דקות. לאחר 10 דקות, ערבבו בעדינות פעם אחת על ידי פיפטינג. העבירו את הריאות המנותקות דרך מסננת תאים של 100 מיקרון המותקנת על צינור חרוטי של 50 מיליליטר.השתמש בחלק האחורי של בוכנה ממזרק מיליליטר אחד כדי לרסק גושי תאים על המסנן. שטפו את המסנן עם 20 מיליליטר מאגר כביסה. צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-20 מיליליטר של מאגר כביסה. חזור על שלבי המאמץ והצנטריפוגה פעמיים, והחלף את המסנן והצינור בכל פעם. לבסוף, הכן את תרחיף התא הבודד על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר מיון זרימה לגלולת התא.בצע צביעת נוגדנים ומיון תאים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מיון התאים, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 250 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השעו מחדש את AMs של העכבר במיליליטר אחד של מדיום תרבית AM של עכבר.בהתבסס על היבול והצורך הניסיוני, זרעו את התאים בשקופיות תא, צלחות תרבית או צלוחיות תרבית. באופן אידיאלי, זרעו את ה-AMs ב-100,000 למיליליטר עם 10 מיליליטר של מדיום בבקבוק תרבית רקמה T 25. דגרו את התאים בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני.24 שעות לאחר הזריעה, AMs צריכים להיות דבקים ולא ינותקו על ידי שינוי עדין של מדיום התרבית. הסר את המדיום על ידי שאיפה מקצה אחד, וחידש במדיום טרי שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. לבסוף, התבונן בבקבוק תחת מיקרוסקופ הפוך.מוצגת הערכה ציטומטרית של זרימה ציטומטרית של מקרופאגים מכתשית בנוזל שטיפת סימפונות עכבר. המקרופאגים המכתשית הם חיוביים המזוהים כחיוביים ל-CD45, חיוביים ל-CD11c ותאים חיוביים ל-Siglec-F. מוצגת כאן תוצאה מייצגת של מקרופאגים מכתשית של עכברים שגודלו במבחנה במשך 24 שעות.התאים הפכו נדבקים ושינוי עדין של מדיום התרבות לא ינתק אותם. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבחין בין מקרופאגים עכבריים ואנושיים מתאי ריאה אחרים.כמו כן, כמו הנהלים להשגת אוכלוסייה יפה של מקרופאגים מכתשית לניסויים במורד הזרם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלא כל המקרופאגים או הפגוציטים השוכנים בריאה הם מקרופאגים מכתשית. המקרופאגים המכתשית הם סוג של תאים מיוחדים הנמצאים בריאות מאז הלידה.לבידוד של מקרופאגים מכתשית, ההתמקדות צריכה להיות בשיטות מיצוי ברות קיימא מסביבת המיקרו המכתשית. שיטת התרבית במבחנה שפותחה כאן תומכת בצמיחה של מקרופאגים מכתשית בתנאי מעבדה שניתן להשתמש בהם במבחנים מולקולריים ותאיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו העברת תאים מאמצים, הצגת אנטיגן והערכת תגובה לגירויים דלקתיים על מנת לענות על שאלות נוספות על הביולוגיה של מקרופאגים מכתשית.

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט לבידוד מקרופאגים צפקיים של עכברים. לאחר הליך זה מיצוי RNA לביצוע ניתוח ביטוי גנים על גירוי קולטנים דמויי טול.

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

תאי מח עצם שגודלו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים גרנולוציטים (GM-CSF) מייצרים תרבית הטרוגנית המכילה מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs). שיטה זו מדגישה שימוש בקשירת MHCII והיאלורונן (HA) כדי להבדיל בין מקרופאגים ל-DCs בתרבית GM-CSF. למקרופאגים בתרבות זו יש קווי דמיון רבים למקרופאגים המכתשית.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). הפרוטוקול משתמש בשימור בהקפאה של מונוציטים יחד עם התמיינות בתפזורת שלהם למקרופאגים. לאחר מכן ניתן לזרוע מקרופאגים שנקטפו לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

אנו מתארים שיטה לעיבוד מכתשיים נוזל ששטיפה בהתאמה דם היקפי מאנשים כרוניים הנגועים באיידס על טיפול תרופתי להערכת מאגרי HIV ריאתי. שיטות אלה תוצאה של רכישת תאים CD4 T טהור מאוד מכתשי מקרופאגים שעשויים להיגרם לאחר מכן עבור immunophenotyping קלדה ו-DNA האיידס/RNA כימות על ידי תגובת שרשרת באולטרסאונד.

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

מוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד, culturing, העברה, וההבחנה העיקרי האנושי מונוציטים מאנשים נגועים בריאים ושליטה בריאה.

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד מונוציט דם אנושי ראשי, כמו גם ההבידול שלהם לתוך מקרופאגים ותאים דנדריטיים והרכבה עם תאים אפיתל לתוך מודל ריאות אנושי רב תאי. תגובות ביולוגיות של cocultures המורכבים תאים חיסוניים מובדלים או חדוציטים מבודדים טריים או מופשרים, עם חשיפה לגירוייםדלקתיים, מושווים.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

למדו לבודד ולגדל מקרופאגים אלבאולריים מריאות עכברים ואנושיים במבחנה. שיטה זו מאפשרת אוכלוסייה מטוהרת לחקר אימונולוגיה ריאתית ותפקיד התאים בזיהומים נשימתיים.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

גלה סרטונים נוספים