שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדה פקקת ו hemostasis זיהוי נושאים רגישים יותר לתהליכים טרת עורקים בפרט חולים בסיכון גבוה שטופלו אספירין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה זול, פשוט לשימוש, נוח, יש יעילות גבוהה ומאפשר זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך שדה טרת עורקים, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות כגון פולימורפיזם מעורבים רפואה מותאמת אישית או תרופות ספציפיות על מנת להבין את התגובה הפרט תרופתי.

הדגמת ההליך תהיה ד"ר סבסטיאנו אורסי, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להכין את חיץ טריס EDTA ב pH 8.0, להוסיף 200 microliters של 0.5 EDTA טוחן אחד מיליליטר של אחד טריז כלוריד טוחן בבקבוק, ולאחר מכן להתאים את עוצמת הקול ל 100 מיליליטר עם מים סטריליים ולאחסן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להכין ליטר אחד של פתרון מלאי 10X של מאגר אלקטרופורזה על ידי הוספת כל reagents, ולאחר מכן לאחסן את המאגר בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, להכין את הג'ל טעינת צבע על ידי הוספת כל reagents ואז להביא את הנפח ל 100 מיליליטר עם מים סטריליים. לאחר הכנה, לאחסן את הצבע בארבע מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. הוסף 450 מיליליטר מים ל-50 מיליליטר של מאגר TBE 10X כדי להכין פתרון של מאגר TBE 1X.

הוסף ארבעה גרם של אגרוז ב 200 מיליליטר של חיץ TBE 1X יחד ב beaker 600 מיליליטר להכין 200 מיליליטר של 2% ג'ל agarose. ג'ל אגרוז מוצק המאוחסן בטמפרטורת החדר ניתן להפצה מחדש מעל אמבט מים רותחים ב 60 מעלות במשך 15 עד 20 דקות או במיקרוגל במשך 35 דקות על ידי הוספת נפח קטן של מים כדי לפצות על הגידול בריכוז התעוררות. ממשיכים לבחוש את הסקילר על מערבל מגנטי במשך כחמש דקות עד שהאגוז מושעה ואז מחממים את האגרוז על צלחת חמה במשך כ -10 דקות או במיקרוגל במשך שלוש דקות כדי שהוא יתמוסס לחלוטין.

לאחר טיהור הדנ"א, מערבבים בעדינות את דגימות הדנ"א הטריות על ידי צינורות צינורות מספר פעמים. חובה להשיג 10 עד 50 ננוגרם של דנ"א תבנית באיכות טובה המופק מדגימות אנושיות. מסיבה זו, אנו מעדיפים להשתמש טיהור DNA אוטומטי ולא אחד אוטומטי למחצה או ידני.

כדי להתחיל טיהור, תחילה לכמת ולחשב את טוהר ה-DNA על ידי מדידת סופגים ב 260, 280 ו 320 ננומטר, ולאחר מכן לדלל את הדגימות באמצעות מים סטריליים. לאחר מכן, כייל את הספקטרופוטומטר. כדי להוות את תגובת PCR, להוסיף את כל ריאגנטים להכין 25 microliters של PCR מאסטר לערבב בצינור מיקרו-מאכל 0.2 מיליליטר.

לאחר מכן מניחים את צינורות PCR בתרמוציקלר אוטומטי ומגדילים את דגימות הדנ"א המטוהרות. ברגע שהתוכנית מסתיימת, לעצור את התגובה על ידי השארת הצינורות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף מאגר אנזימים פי 10 חמש יחידות לכל אנזים הגבלת מיקרוליטר במים החופשיים של הדנ"א לנפח של 22.5 מיקרוליטר.

לאחר מכן, הוסף 2.5 מיקרוליטרים של מוצר PCR לצינור PCR חדש ולאחר מכן הוסף את 22.5 microliters של תערובת עיכול הגבלה למוצר PCR. הדגירה של מוצר PCR הגבלת עיכול לערבב ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד כדי להכתים את הג'ל במשך 10 דקות. יוצקים את הג'ל על מגש הג'ל עם מסרק היטב במקום עבור הג'ל כדי לחזק.

עכשיו לשפוך את קופסת הג'ל עם חיץ TBE 1X עד הג'ל מכוסה. השתמשו בטיפים עדינים כדי לטעון שישה מיקרוליטרים של הדנ"א המתעכל המוגבר בארות שנוצרו בג'ל, ולאחר מכן הוסיפו גם סמן DNA בנוסף מקביל לדגימה. לאחר מכן, הפעל את יחידת האלקטרופורזה.

על מנת לזהות את פולימורפיזם גנטי C924T בגן TBXA2R, ניתוח RFLP נעשה. בג'ל, הוא מציג שתי להקות ב 395 ו 144 זוגות בסיס עבור גרסה מסוג פראי של אלל הגדול, ואילו להקה אחת ב 539 זוגות בסיס עבור הגרסה המוטנטית של אלל קטין נראה המציין לא לחתוך על ידי אנזים ההגבלה. באופן מעניין, שלוש להקות ב-395, 144 ו-539 זוגות בסיסים נמצאות עבור אלל ההטרוזיגי.

לאחר מכן, פולימורפיזם C924T מאושר באמצעות ניתוח רצף. הרצף המודגש מייצג את הפולימורפיזם. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בערך שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי שיטה זו יכולה לשמש רק עבור מספר קטן של חיתוך ואת עבור כמה דוגמאות בהפעלת עבודה. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו ניתוח Snip יכול להתבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו החשיבות של מסלולים אחרים מעורבים תהליכים טרותרומבוטיים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה לחוקרים בתחום הביולוגיה המולקולרית לחקור וריאציות גנטיות הבולטות בהתפתחות והתקדמות זו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להעריך את גנוטיפ קולטן Thromboxane A2 לגבי פולימורפיזם C924T באמצעות ניתוח אלקטרופורזה ג'ל של דגימות PCR-RFLP. אל תשכח כי עבודה עם אתידיום ברומיד ומקורות אור UV יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון כפפות, משקפי בטיחות, או מסכת פנים והתקני מגן אחרים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.