Name: הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למד מעקב אחר תאים אנדוקרדיאליים בזברה דגים בעזרת פוטוקונברסיה של חלבון Kaede פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מחקר התפתחות לב ומבנים של שסתומים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות Duchemin הולץ, דניס Duchemin, נטלי Faggianelli, באזיל Gurchenkov שעזרת לתכנן ולבצע כייר שמתואר פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי עקרות (DEQ20140329553), את ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), התוכנית של חוקר צעיר EMBO, הקהילה האירופית, ERC קוג N ° 682938 Evalve ומנוהל על ידי המענק ANR-10-LABX-0030-INRT, קרן צרפתית המדינה על ידי סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש תחת d'Avenir Investissements תוכנית מסגרת בתווית ANR-10-IDEX-0002-02.

1. הכנת תבניות והרכבה agarose
<ol><li>צור תבנית עם מידות איור 1 באמצעות מדפסת תלת-ממד או כלים מסורתיים וטכני.</li>
	<li>פיפטה בערך 1.5 מ של agarose 1% מומסת לתוך תבשיל הרכבה פלסטיק 35 מ מ. מקום כייר פלסטיק agarose נוזלי, מקפיד להימנע השמנה אוויר בין כייר את agarose. מקם את המנה ב 4 ° C, חכה עד agarose מתקשה (זה לוקח בערך 5 דקות) ולאחר מכן להסיר את כייר פלסטיק.</li>
	<li>כדי לאחסן את המנה הרכבה לשימוש מאוחר יותר, מכסים את המכסה שלה, ואז לעטוף את המנה וגם את המכסה בצורה הדוקה עם מצלמות-מיקרוסקופים. לאחר מכן ניתן לאחסן את המנה הרכבה המכסה פונה כלפי מטה עד 5 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להכין מראש 1 מ"ל aliquots כ- 0.7% agarose נקודת התכה נמוכה ב- 1.5 mL גלאים צינורות לשימוש ביום של הרכבה. הערה: הבארות agarose של המנה הרכבה עיוות לאורך זמן כמו המים מתאדה אם מצלמות-מיקרוסקופים הוא לא מסובבת את הכלים בחוזקה.</li>
</ol>2. קבלת את העוברים על Photoconversion
<ol><li>Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) קו ולגדול כ 200 עוברי במדיום העובר בחושך-28.5 ° C. לפרטים נוספים על איך לחצות קווים דג זברה, נא עיין יופיטר מדעי החינוך מסד נתונים11.</li>
	<li>לאחר 5 שעות אך לפני 24 שעות, מתייחסים העוברים עם 1-phenyl-2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי למנוע היווצרות פיגמנט (0.003% פרופילתיואוראציל במדיום העובר).</li>
	<li>בערך 1 h לפני תחילת photoconversion, מסך העוברים תחת סטריאוסקופ פלורסנט, בחר 5 העוברים בריאים זה מופיעים לבטא את קרינה פלואורסצנטית ירוקים בהירים. השימוש של אור בעוצמה נמוכה כשמתכננים העוברים מומלץ להימנע מחשיפה של העוברים תאורת כדי להימנע photoconverting קאךה בתאים שאינם ספציפיים.</li>
</ol>3. הטמעה
<ol><li>הכינו 10 מ"ל של הרכבה מדיה: 0.02% tricaine ו-50 מ"מ BDM במדיום העובר.</li>
	<li>להוסיף 2 מ של הרכבה בינוני למנה גובר ולאפשר 15-30 דקות עבור הפתרון לנטרל את agarose.</li>
	<li>בינתיים, ממיסים את aliquot 1 מ"ל של 0.7% נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose על-ידי הצבת את הצינורית בתוך גוש חום 70 מעלות צלזיוס למשך כ- 5 דקות.<ol>
<li>מחכה agarose LMP להתקרר מעט, ואז להוסיף הצינורית של נקודת התכה נמוכה agarose 25 µL של פתרון tricaine 8 מ"ג/מ"ל, µL 40 של 1 מ' BDM פתרון. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז להעביר את הצינור גוש חום 38 ° C כדי לשמור את agarose LMP במצב נוזלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ב פטרי צלחת עם העובר בינוני, בזהירות dechorionate העוברים שנבחרו מראש תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים, דואגת שלא יגרמו נזק העוברים.</li>
	<li>העברת העוברים תבשיל נפרד המכיל 2 מ של הרכבה מדיה.<ol>
<li>מתי עצרו את ליבם של העוברים (לוקח בערך 5-10 דקות), העברת העוברים על הרכבה צלחת ומסדרים העוברים בתוך הבארות באמצעות מלקחיים, כך הם משקרים בזווית של 25 מעלות, זנבות והצביע לעבר החלק עמוק יותר של הבאר, חלמון פונה כלפי מעלה.</li>
		<li>כאשר עוברי הן בערך במקום, להסיר את המדיה, להטביע את העוברים ~ 200 µL כ- 0.7% LMP agarose המכיל tricaine BDM, להסתגל העמדות של העוברים, הטיית העוברים שמאלה או ימינה בהתאם לצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחכות עד ערכות agarose LMP (לוקח בערך 5 דקות), ולאחר מכן הוספת התגברות בינוני למנה. העוברים מוכנים עכשיו להיות photoconverted. הערה: את tricaine של BDM משמשים עזים ומתנגד העוברים וכדי לעצור את הלב של העוברים, בהתאמה. הרכבה מדיה ניתן להכין יום לפני הדמיה, אך הקפד על התקשורת מפני אור. הערה: המיקום הנכון של העוברים חשוב לאפשר נתיב לייזר נקה התאים אחד ורוצה photoconvert. מקם את הראש של העובר קרוב ההתחלה של הבאר כך אור לייזר לא צריך לנסוע רחוק כדי להגיע אל העובר, העוברים שניתן יהיה בקלות שטעינתו בוטלה לאחר photoconversion.</li>
</ol>4. Photoconversion
<ol><li>על מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף (כמו Leica SP8) מצוידים עם 405 ננומטר, 488 ננומטר ומקור 561 ננומטר לייזר, לאתר את העובר של הלב באמצעות ששודרו אור לבן (brightfield), המטרה של העדשה (כמו לייקה HCX IRAPO L, 25 ×, נ. א. 0.95 המטרה). בדוק פלואורסצנטי אדום קאךה באמצעות הלייזר nm 561 (קרי, לייזר DPSS 561, בעוצמה ~ 5%, גלאי שוכן בגובה 589-728 ננומטר). אז דמיינו את endocardium באמצעות 488 ננומטר לייזר (קרי, 30 mW מרובת שורות ללייזר בעוצמה ~ 5%, גלאי להגדיר ב- 502-556 ננומטר).</li>
	<li>להיכנס למצב "FRAP" על התוכנה רכישת מיקרוסקופ. בחר ~ 1% עוצמת הלייזר עבור שניהם 488 ננומטר, 561 ננומטר לייזר.</li>
	<li>להתמקד המטוס עניין, בחר אזור בעל עניין (ROI), ולאחר מכן photoconvert תאים באמצעות את 405 ננומטר דיודת לייזר בעוצמה לייזר 25%, סריקה על רועי שלוש פעמים. קאךה לא מספיק צריך להיות photoconverted של רועי, לסרוק את 405 ננומטר לייזר מעל האזור שלוש פעמים שוב. חזור על שלב זה עבור כל ROIs.</li>
	<li>להחזיר מצב "TCS SP8" על התוכנה ולרכוש z-מחסנית, שימוש של 561 nm ו 488 ננומטר לייזרים ברצף. הקפד לבחור באפשרות 'דו-כיווני' כדי להגדיל את מהירות הדמיה. הערה: כמה זמן לוקח photoconvert, התמונה שמשתנה כל העובר. לבי הלם ידוע להיות חשוב להתפתחות שסתום הלב רגיל, כדי להימנע שמירה על הלב הפסיק במשך יותר מ 30 דקות, אפילו אם זה אומר שאין לך זמן photoconvert כל העוברים 5. הערה: במהלך תהליך photoconversion, שימוש PMT גלאי, לאחר photoconversion, מומלץ להשתמש גלאי היברידית מוגדר 'ספירה' מצב. זה כי גלאי היברידית רגישים יותר, הם מסוגלים לייצר תמונות באיכות טובה יותר, אבל נפגמים בקלות חשיפת יתר.</li>
</ol>5. ביטול הטעינה photoconverted עוברי
<ol><li>לאחר photoconversion, להשתמש פיפטה מזכוכית כדי לחץ כלפי מטה מעט מעל ראשו של העובר כדי לשבור את agarose LMP ולאחר מכן למצוץ בעדינות את העובר.<ol>
<li>הוצא את העובר מן פיפטה מזכוכית לתוך צלחת פטרי 35 מ מ המכיל העובר בינוני עם פרופילתיואוראציל (לשטוף BDM המכילות בינוני).</li>
		<li>להעביר את העובר באר צלחת 6-ובכן המכיל העובר בינוני עם פרופילתיואוראציל. במהלך שלב זה, הקפד לשמור על הערה של העובר אשר נכנס בו טוב, כמו זה חיוני כדי להתאים את המיקום של תאים photoconverted בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שעכשיו העוברים יוסרו מן המדיום המכיל BDM, ליבם כדאי שנתחיל להכות שוב בבערך 5 דק העוברים המוחזר בחשיכה-28.5 ° C כדי לאפשר עוברי להמשיך לפתח בדרך כלל.</li>
</ol>6. בהדמיית photoconverted התאים העובריים מאוחר יותר
<ol><li>בשלב הרצוי, לעצור את הלב ולהכניס מחדש את העוברים כמו תחת שלב 3 של פרוטוקול זה, עם הבדל חשוב כי חייבים להיות מטופלים העוברים עם BDM במנות נפרדים, מסומן, כדי לעקוב אחר עוברי.</li>
	<li>עבור עוברי עד 62 hpf, לרכוש z-ערימות endocardium באמצעות 561 nm ו 488 ננומטר עבור פלורסנט אדום וירוק אותות, בהתאמה. עבור עוברי בשלבים שגילן עולה על 62 hpf, להשתמש multiphoton לייזר מוגדר כ- 940 nm לשיקוף קאךה ירוק במקום 488 ננומטר לייזר.</li>
</ol>7. תמונה ןועברל העוברים מתחת לגיל 48 hpf
הערה: תנועות רקמת AVC יכול להיות קשה לנתח עקב המבנה תלת מימדי המורכב שלו. כדי לכמת את האורך של אזור photoconverted AVC בין שני אזורים שאינם photoconverted או האורך של אזור אי-photoconverted AVC בין שני אזורים photoconverted, זה יכול להיות רצוי למפות את מבנה תלת-ממדי על גבי מפה דו-ממדית. תמונות של photoconverted עוברי שהושגו לפני 48 hpf ניתן לנתח באמצעות השיטה שלהלן.
<ol><li>ייבוא תמונות שנרכשו ב- Matlab או כל תוכנה דומה.</li>
	<li>Delimitate באופן ידני את רועי, כלומר endocardium, ולהחיל מסכה כדי להסיר את האות מחוץ לאזור זה.</li>
	<li>להחיל על הסף בעוצמה על התמונה כדי לזהות את הנקודות על endocardium ותכין אותם 3-ממדים. לבודד את הנקודות התואם לחלק הצר וישר ביותר AVC, על ידי מחיקת באופן ידני את הנקודות של עניין האטריום ואת הנוזלים באמצעות הפקודה מחק בתוכנה.</li>
	<li>להשתמש גליל כדי להתאים את הנקודות המייצג את AVC השיג.</li>
	<li>הגדרת מערכת הפניה כדי להשוות בין מספר דגימות. לדוגמה, לאמץ אל מרכז המסה של AVC נקודות המקור של מערכת הייחוס, הציר של הגליל מצויד כמו ציר z.<ol>
<li>ודא כי z חיובי-תנוחות מתאימות תמיד באותו הצד של הלב (חדרית או פרפור).</li>
		<li>פרויקט הנקודות AVC במישור x-y ולהשתמש אליפסה שתתאים להם.</li>
		<li>לסובב את הנקודות endocardial סביב ציר z כך את ציר מרכזי של האליפסה ואת ציר y של מערכת הייחוס מקבילים ותואמים ערכי-y חיובי בצד הפנימי AVC ביחס העובר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לחלק את AVC, לחתוך את ערכת הנתונים תלת מימדי עם מטוסים מתקבל על ידי סיבוב המישור החצי {y = 0, x > 0} z-כיוון.<ol>
<li>פרויקט האינטנסיביות של הפיקסלים הסמוכים במטוסים אלה ולהגדיר את אנדותל באופן עקבי. לדוגמה, צייר באופן ידני קו מ פרפור לצד חדרית AVC-חצי עובי אנדותל.</li>
		<li>אינטרפולציה הנקודות של הקווים המייצג את אנדותל עם בליטת חיבור תלת ממדי באמצעות הכלים בליטת חיבור כדי לייצג את AVC עם משטח. הערה: מספר המטוסים חיתוך קובע גם את הדיוק של פילוח וגם צריכת זמן שלב זה. בדרך כלל, שמונה מטוסים הם מספיק כדי להשיג תוצאות טובות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להגדיר את המיקום azimuthal של כל נקודה על פני השטח AVC באמצעות קואורדינטות גליליות.<ol>
<li>במיקום azimuthal כל להגדיר עקומה פרמטרית לאורך פני השטח של AVC על-ידי חישוב אורך הקשת על פני השטח בין נקודות רצופות.</li>
		<li>עבור כל עקומה פרמטרית, מגדירים את הנקודה בעקומה הקרוב ביותר למרכז AVC לאפס. הנקודות של AVC ובכך באופן מלא מתוארים על ידי העמדה azimuthal שלהם ומיקומם על העקומה פרמטרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לגולל את AVC לתמונה דו-ממדית באמצעות המיקום פרמטרית של הנקודות.</li>
	<li>למצוא את הקצוות של האזור לכמת כמו הקצוות של סף תמונה בינארי היחס בין עוצמות photoconverted הערוצים הלא-photoconverted. ידנית לתקן את התוצאה במידת הצורך.</li>
	<li>לחשב את אורך הקשת בין הקצוות כדי לחשב את האורך של הרקמה כפונקציה של העמדה azimuthal.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo%3A+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li>
<li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li>
<li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+development+of+the+atrioventricular+canal+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+mechanics+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood flow mechanics in cardiovascular development.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).</li>
<li>Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+driven+cardiac+valve+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+modeling+for+shear+stress+quantification+in+the+embryonic+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Steed, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((klf2a+couples+mechanotransduction+and+zebrafish+valve+morphogenesis+through+fibronectin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis.</a> Nat Commun. 7, 11646(2016).</li>
<li>Herwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+mechanisms+of+blood+vessel+fusion+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo.</a> Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+shear+stress+patterns+predict+the+orientation+of+convergent+tissue+movements+in+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart.</a> Development. , (2017).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="NULL">Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005(2015).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li>
<li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li>
<li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li>
<li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhOTO+zebrafish%3A+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888(2012).</li>
<li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li>
</ol>

אין ניגוד אינטרסים הכריז.

העיתוי של photoconversion: קאךה למרות נשאר במאור פנים מתבטאות והריון אפילו ב 96 hpf, יצוין כי ככל שהעובר גדל, אור לייזר מפזרת עוד לפני שהוא מגיע את AVC, יצירת photoconversion מוגבלת של קאךה קשה יותר. At עובריים שלבים מאוחר יותר 55 hpf, שהתנפח של הנוזלים, האטריום גם אומר כי קרן לייזר סגול משמש photoconversion לא יכול להגיע AVC תאים ללא הראשון העוברים דרך אטריום או החדר. משמעות הדבר מעבר 55 hpf, על מנת photoconvert והריון של AVC, אדם חייב גם photoconvert והריון נוסף אטריום, החדר.
BD...

דג זברה נחשב כיום לאחד הדגמים חוליות החשוב ביותר ללמוד הסלולר תהליכים התפתחותיים ויוו. זה נובע במידה רבה שקיפות אופטית של דג זברה ולקודדו amenability על גנטיקה, מה שהופך אותו במודל רב עוצמה על יישום טכניקות אופטי מעורבים גנטית photoresponsive חלבון טכנולוגיות1. ספציפיים בחקר התפתחות הלב, דג זברה מקבלים מספיק חמצן באמצעות דיפוזיה כזה כי מוטציות אפילו ללא דופק יכולים לשרוד עד השבוע הראשון של פיתוח, התרת ניתוחים על ההשפעות של גנים התפתחותית, מודאג זרימת הדם על הלב מורפוגנזה לא אפשרי חולייתנים רוב2.
הצינור הלב דג זברה נוצר על ידי הפריה פוסט 24 שעות (hpf). זמן קצר לאחר הקמתו, הצינור הלב מתחיל לפעום באופן פעיל. על ידי 36 hpf, כיווץ ברור שמפריד האטריום מן החדר. אזור זה של הכיווץ נקראת התעלה atrioventricular (AVC), ועל תאים שינוי אזור זה של מורפולוגיה קשקשיים מורפולוגיה cuboidal3. דג זברה שסתום atrioventricular מורפוגנזה מתחיל בסביבות 48 שעות פוסט הפריה. על ידי 5 ימים פוסט הפריה, משני עלעלים שסתום להרחיב AVC, למנוע את זרימת הדם מן הנוזלים לאטריום גב במהלך מחזור לב4. מעקב אחר תאים במהלך היווצרות AVC שסתום הוא מאתגר כמו המכות מהיר של הלב ומקשה לעקוב אחר תאים באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות המסורתית5,6. פרוטוקול זה, משנת סטיד. et al., 20167, מתאר שיטה המשתמשת Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 דג זברה מהונדס הקו, שבו מתבטאת החלבון photoconvertible קאךה תאי אנדותל, כולל את endocardium. התרופה 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM) משמש כדי לעצור באופן זמני את פעימות לבי ומאפשר photoconversion מדויק של והריון בין 36 ל 55 hpf, דימות ברזולוציה של photoconverted והריון בנקודות זמן התפתחותית מסוימת. בעבר הוכח כי photoconverted והריון בשיטה זו יכול להישאר להבדיל מהשכנים אשר במשך חמישה ימים או יותר אחרי שעת photoconversion7. פרוטוקול זה מפרט גם שיטה לניתוח תמונה של photoconverted והריון ב עוברי צעיר יותר 48 hpf, אשר שימש בהצלחה כדי לעקוב אחר תנועות רקמות במהלך AVC פיתוח (בוזלי. et al., בעיתונות)9. אנו מקווים כי הקוראים שימושיות פרוטוקול זה ללמוד AVC ופיתוח שסתום עוברי רגילה, וכן מוטציות, morphants או עוברי שטופלו בסמים. עבור פרוטוקול כלליים יותר הקשורים תא מעקב באמצעות חלבונים photoconvertible במהלך הפיתוח דג זברה, בבקשה להציג את המאמר על ידי לומברדו. et al., 201210.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציוד הכרחי לגידול דגים ואיסוף ביצים (ראה ספר דג הזברה 22 לפרטים).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי זקוף (מצויד בלייזרים הפועלים ב-488 ננומטר, 561 ננומטר ו-405 ננומטר, לייזר מולטיפוטון מתכוונן, ו-Leica HCX IRAPO L, 25 & times;, NA 0.95 אובייקטיבי)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 35 מ"מ x 10 מ"מ</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 באר</td><td>פלקון</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td><td></td>פטרי</tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>זכוכית</tr><tr><td>עובש</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM פתרון</td><td></td><td></td><td></td>מלאי</tr><tr><td>UltraPure נקודת התכה נמוכה agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-phenyl-2-thiourea)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>עובר בינוני: 30x תמיסת</td><td></td><td></td><td></td> מלאי</tr> <tr><td>תוכנה</ חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab מצויד בארגזי הכלים של ניתוח תמונה, התאמת עקומה, ביו-פורמטים</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>8 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי טריקאין</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 מ"ג של אבקת טריקאין (חומצה אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונית)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>יש להתאים ל-pH 7, לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>1 מיליון תמיסת מלאי BDM</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 גרם BDM</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquot ולאחסן ב-20 מעלות; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדיום עוברי: תמיסת מלאי 30x </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50.7 גרם NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0.78 גרם KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1.47 גרם מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2.1 גרם סידן ניטריט טטרה-הידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19.52 גרם HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>התאם ל-pH 7.2 ואחסן בטמפרטורת</td><td></td><td></td><td></td> החדר</tr> <tr><td><חזק>עובש</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שרף</td> <td>PlasCLEARאסיגה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלוס 39&nbsp; מדפסת תלת מימד Freeform Pico</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הפרקים הבאים רקמה endocardial ויה photoconversion תאים של העובר דג זברה

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

במהלך מופרה, התאים עוברים שינויים דינמיים בהתנהגות התא, פיענוח הסלולר ההיגיון מאחורי שינויים אלה היא מטרה היסוד בתחום ביולוגיה התפתחותית. בגילוי ופיתוח של חלבונים photoconvertible במידה רבה כאילו סייע ההבנה שלנו של שינויים דינמיים אלה על-ידי מתן שיטה לסימון שטיחות תאים ורקמות. עם זאת, בעוד photoconversion, מיקרוסקופיה זמן לשגות, ניתוח תמונות עוקבות הוכיחו להיות מאוד מוצלח שיגורי דינמיקה סלולר באיברים כמו המוח או את העין, גישה זו משמשת בדרך כלל לא בלב המתפתח עקב לאתגרים שמציב את התנועה המהירה של הלב במהלך מחזור הלב. פרוטוקול זה מורכב משני חלקים. החלק הראשון מתאר שיטה photoconverting ומעקב לאחר מכן תאים endocardial (והריון) במהלך דג זברה תעלת atrioventricular (AVC) ופיתוח שסתום הלב atrioventricular. השיטה כוללת חנותם עוצר את הלב עם סמים על מנת photoconversion מדויק להתקיים. לבבות מותר לחדש את המכות על הסרת התרופה ואת התפתחות נמשכת בדרך כלל עד הלב הוא נעצר שוב עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של photoconverted והריון בשלב מאוחר יותר זמן התפתחותית. החלק השני של הפרוטוקול מתאר שיטת ניתוח התמונה כדי לכמת את האורך של אזור photoconverted או אי-photoconverted AVC ב צעירים העוברים על-ידי מיפוי האות פלורסנט מתוך מבנה תלת-ממדי על גבי מפה דו-ממדית . יחד, שני חלקי הפרוטוקול מאפשר לבחון את מקור וההתנהגות של תאים המרכיבים את דג זברה AVC ואת מסתמי הלב atrioventricular ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם עבור לומד מוטציות, morphants או עוברי שטופלו עם ריאגנטים לשבש את התפתחות AVC ו/או שסתום.

דוגמא photoconverted העובר ב 48 hpf, עם תמונה שוב 80 hpf מוצג באיור 2, סרטים 1 ו- 2. חשיפת קאךה 405 ננומטר לאור בלתי הפיך ממיר מ החלבון שלו בטופס ירוק ניאון לטופס אדום פלואורסצנטי, המאפשר את אופן הפעולה של תאים עם הירוק או את הטופס אדום שלהם להיות בעקבות עם תוויות הכבוד שלהם באופן שונה בצבע השכנים במהלך היווצרות שסתום. ניתן לראות כי מספר תאי photoconverted AVC hpf 48 התרבו מאוחר יותר, לאחר מכן התגורר בעיקר בצד אחד של העלעל שס...

פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר תאים אנדוקרדיאליים במהלך היווצרות התעלה הפרוזדורית ומסתמי הלב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הלב, כגון להבין כיצד תאים אנדוקרדיאליים מתנהגים בסוגים שונים של מוטציות. מעקב אחר תאים במהלך AVC והיווצרות מסתמים הוא מאתגר בגלל הקצב המהיר של הלב.זה מקשה על מעקב אחר תאים באמצעות מיקרוסקופ מסורתי של זמן-lapse. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא עוקפת חלק מהקשיים הללו. מי שתדגים את ההליך תהיה רנה, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי.לאחר יצירת תבנית על פי פרוטוקול הטקסט, פיפטה כ -1.5 מיליליטר של אגרוז 1% מומס לכלי הרכבה מפלסטיק בגודל 35 מילימטר. לאחר מכן, מקם את תבנית הפלסטיק באגרוז הנוזלי, הקפד להימנע מלכידת אוויר בין התבנית לאגרוז. מניחים את התבשיל על ארבע מעלות צלזיוס עד שהאגרוז מתקשה.לאחר מכן, הסר את תבנית הפלסטיק מהאגרוז. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מדיום הרכבה שהוכן בעבר לכלי ההרכבה, ואפשר 15 עד 30 דקות עד שהתמיסה תתפזר לתוך האגרוז. בינתיים, המיס אליקוט של מיליליטר אחד של 0.7% נקודת התכה נמוכה, או LMP, אגרוז על ידי הנחת הצינור בגוש חום של 70 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות.פיפטה ה-LMP התרומם למעלה ולמטה כדי לקרר אותו מעט. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של שמונה מיליגרם למיליליטר טריקאין ו-40 מיקרוליטר של תמיסת BDM טוחנת אחת לשפופרת. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.לאחר מכן, העבירו את הצינור לגוש חום של 38 מעלות צלזיוס כדי לשמור על ה-LMP במצבו הנוזלי. העבירו את העוברים לכלי נפרד המכיל שני מיליליטר של מדיום הרכבה. לאחר מכן, כאשר הלבבות הפסיקו לפעום, העבירו את העוברים לצלחת ההרכבה והשתמשו במלקחיים כדי לסדר אותם בבארות כך שהם שוכבים בזווית של 25 מעלות, כשהזנבות פונים לכיוון החלק העמוק יותר של הבאר, כשהחלמון פונה כלפי מעלה.כאשר העוברים נמצאים במקומם בערך, הסר את המדיום והטמיע אותם בכ-200 מיקרוליטר של 0.7% אגרוז LMP המכיל טריקאין ו-BDM. לאחר מכן, התאם מחדש את מיקומי העוברים, הטה אותם שמאלה או ימינה לפי הצורך. לחץ כלפי מטה על קירות הריבוע השקוע כדי לאפשר לעודף אגרוז לעלות על גדותיו לאזורים הצדדיים של צלחת ההרכבה.המתן כחמש דקות עד שה-LMP אגרוז יתייצב, ולאחר מכן הוסף מדיום הרכבה למנה. העוברים מוכנים כעת להמרה באור. כדי לבצע המרה פוטו, במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף המצויד במקורות לייזר 405, 488 ו-561 ננומטר, השתמש באור לבן מועבר ובעדשה אובייקטיבית כדי לאתר את לב העובר.באמצעות לייזר 561 ננומטר, בדוק אם יש פלואורסצנטיות Kaede אדומה. לאחר מכן, השתמש בלייזר של 488 ננומטר כדי לדמיין את האנדוקרדיום. לאחר מכן, בתוכנת רכישת המיקרוסקופ, היכנס למצב FRAP.לאחר מכן, בחר כ-1% הספק לייזר הן עבור הלייזר 488 והן עבור הלייזר של 561 ננומטר. תוך כדי התמקדות במישור העניין, בחר אזור עניין, או החזר ROI. לאחר מכן, באמצעות לייזר דיודה של 405 ננומטר בעוצמת לייזר של 25%, המירו את התאים, סרקו את ההחזר על ההשקעה שלוש פעמים.אם לא מספיק Kaede לא יהיה המרה בפוטו ב-ROI, סרוק את הלייזר של 405 ננומטר מעל האזור שלוש פעמים שוב. חזרו לאופן TCS SP8 בתוכנה, והשתמשו בלייזרים של 561 ו-488 ננומטר ברצף, באופן דו-כיווני, רכשו מחסנית Z. לאחר המרת האור, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי ללחוץ מעט מעל ראש העובר כדי לשבור את אגרוז ה-LMP.לאחר מכן, מצצו בעדינות את העובר. כדי לשטוף את המדיום המכיל BDM, הוציאו את העובר מפיפטת הזכוכית לתוך צלחת פטרי בגודל 85 מילימטר המכילה מדיום עוברי עם PTU. העבירו את העובר לבאר בצלחת בת שש בארות המכילה מדיום עוברי עם PTU.במהלך שלב זה, הקפד לשים לב איזה עובר נכנס לאיזה באר, מכיוון שזה חיוני כדי לתאם את המיקום של תאים מומרים בשלבי התפתחות מאוחרים יותר. כעת, לאחר שהעוברים הוסרו מהמדיום המכיל BDM, ליבם אמור להתחיל לפעום שוב בעוד כחמש דקות. להחזיר את העוברים לחושך בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להם להמשיך להתפתח כרגיל.בשלב הרצוי, עצרו את הלב והטמיעו מחדש את העוברים, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, עם ההבדל החשוב שיש לטפל בעוברים ב-BDM בכלים נפרדים ומסומנים כדי לעקוב אחריהם. עבור עוברים עד 62 hpf, רכשו ערימות Z של האנדוקרדיום באמצעות 561 ו-488 ננומטר עבור אותות פלואורסצנטיים אדומים וירוקים, בהתאמה. עבור עוברים שגילם מעל 62 hpf, השתמש בלייזר מולטיפוטון המוגדר ל-940 ננומטר כדי לצלם Kaede ירוק במקום לייזר 488 ננומטר.עבור עוברים מתחת ל-48 hpf, ניתן להקרין את ה-AVC התלת מימדי על תמונה דו מימדית לניתוח. ראשית, סף את התמונה. לאחר מכן, מחק נקודות שנמצאות מחוץ ללב.כדי לבצע פילוח ידני, כוון את התמונה משמאל כך שתתאים לתמונה מימין. פלחו את הצד של הלב שבו עובר הווקטור הכתום, והוסיפו נקודות בכיוון הווקטור הכחול. לאחר מכן, הפנימו את חתכי הרוחב והקרינו את עוצמת הצבע על פני השטח.לבסוף, התאם את כיוון ה-AVC והקרין אותו על משטח דו-ממדי. דוגמה ללב עוברי מיד לאחר המרה פוטו ב-48 hpf מוצגת כאן. Kaede ציטופלזמי במספר תאים של הצד העליון של ה-AVC הומר מירוק לאדום.באותו עובר ב-80 hpf, ניכר שהתאים שהומרו לאור התרבו ונדדו לצד הפנימי של המסתם האטריו-חדרי העליון. דוגמה לעובר של 36 hpf שבו ה-EdCs בפרוזדור ובחדר הומרו באור מוצגת כאן. לאחר מכן ה-AVC מוקרן לשני ממדים להדמיה וניתוח קלים יותר ומאפשר לכמת את המרחק בין שני האזורים שהומרו באור.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על זמן עצירת הלב למינימום כדי למנוע השפעה על ההתפתחות התקינה. עם תרגול, ניתן להשלים המרת תמונות תוך כ-30 דקות בתנאי שהכל מוכן מראש. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעקוב אחר תאים אנדוקרדיאליים לאחר המרת אור בעובר דג זברה חי ולנתח את מערכי הנתונים שלך.

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

כאן אנו מציגים שיטה להפעלה פוטו-אקטיבית של חלבוני פלואורסצנציה הניתנים להמרה פוטו-כימית (PCFPs) בעובר דג זבוב חי, ומעקב המשך אחר החלבון שהומר בנקודות זמן ספציפיות במהלך ההתפתחות. מתודולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועים ביולוגיים תאיים העומדים בבסיס תהליכי התפתחות שונים באורגניזם חולייר חי.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש פיתוח לבבות דג זברה 4-ממדים (4-D). הדמיה 4-D, באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM), לוקח תמונות תלת-ממדי (3-D) לאורך זמן, לשחזר לבבות המתפתח. אנו מראים איכותית, באופן כמותי שזה גזירה מפעילה חריץ endocardial איתות במהלך הפיתוח קאמרית, המקדם trabeculation הלב.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.

הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

למד מעקב אחר תאים אנדוקרדיאליים בזברה דגים בעזרת פוטוקונברסיה של חלבון Kaede פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מחקר התפתחות לב ומבנים של שסתומים בזמן אמת.

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

גלה סרטונים נוספים