Name: שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: חקור שיטה לכימות ואיכות ספינגומיילין בדגימות ביולוגיות באמצעות LC-MS/MS/MS. הפרוטוקול מאפשר אנליזה מדויקת של מיני ליפידים בתאי HeLa ותורם להבנת ביולוגיית ליפידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך, תרבות, ספורט, המדע, הטכנולוגיה של יפן (KAKENHI) כדי בעדותה (#15 K 01691), שפורחים (#15 K 08625), K.Y. (#26461532), מענק לצורך המחקר של פרוייקט סורר המחלה של משרד בריאות, העבודה והרווחה (K.Y. #201510032A). אנו מודים קבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב היד הזה.

<ol><li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li>
<li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li>
<li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+degradation+pathways%2C+functions%2C+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li>
<li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipidomics%3A+high-throughput%2C+structure-specific%2C+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li>
<li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li>
<li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/10.1139/o59-099#.WlOY-N-nHIU">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS%2FMS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability%2C+data+quality%2C+and+assay+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+dissociation%3A+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li>
<li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li>
<li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li>
<li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.

בשיטה איכותית נוכח, השגנו MS3 המוצר יונים SPC, N-moiety ליפיד. זה קריטי להקצות כראוי SPC והן N-acyl השומן moiety. לשם כך, יצוין כי מולקולות אחרות המכילות phosphorylcholine ניתן לזהות גם כמו MS3 המוצר יונים. פלסמלוגן-PC ו- Diacyl-phosphatidylcholine (PC) נמצאים בשפע בתרבית של תאים, hydrophobicity שלהם דומה לזה של SM. לכן, diacyl-PC ופלסמלוגן-PC עם איזוטופ (בדרך כלל 13ג) יכול תיאורטית יזוהו בו זמנית עם מפקד חיל האוויר. בניסויים שלנו, היונים מוצר3 MS של פלסמלוגן-...

ספינגומיילין (SM) הוא ספינגוליפיד נפוצות בתאים בתרבית. SM היא מסונתז intracellularly1 ומתנת כמבשר sphingolipids אחרים כגון sphingosine-1-פוספט ו- ceramide של, אשר יש תפקיד מכריע החיסון תא סחר ועור מכשול הומאוסטזיס, בהתאמה2, 3. לפיכך, ניתוח מדויק של החומרים SM חשוב שחקרתי את התפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים של sphingolipids.
SM מורכבת של ceramide phosphorylcholine מקושרת קבוצת ceramide, אשר מורכב עוד יותר sphingosine Nהידרוקסי 1-acyl השומן moiety. מגוון את המספרים פחמן, הקשר הכפול הן sphingosine והן N-moiety ליפיד מתבטא המין מספר ceramide (SM). התפתחויות אחרונות LC-ESI-MS/MS איפשר ניתוח כמותי ואיכותי של SM4,5. בספירת הדם, המספר של פחמן ו כפולים של sphingoid LCB של SM זוהה על-ידי הקצאת המוצר ספקטרום יון של LCB. עם זאת, במידע המבני N-acyl השומן moiety לא ישירות הושג כי יונים המוצר המקביל שלו לא דווחו, ולכן N-acyl השומן moieties היו להסיק על ידי ניתוח ההפרש בין יונים קודמן ו יונים של המוצר המתאים LCB שני יונים חיוביים ושליליים מצבי4,5. בדו ח זה, אנו מציגים שיטה לגילוי היונים מוצר של LCB ו- N-moiety ליפיד בו-זמנית במצב MS3 באמצעות פאול משולשת, פאול מלכודת יונים ליניארי ספקטרומטר מסה, המאפשרת את מבני מדויק ספקולציות של כל המינים SM6.
יון דיכוי (או שיפור) ההשפעות שנגרמו על ידי המטריקס בדגימות ביולוגיות ה"בלתי כימות מדויק בניתוח LC-ESI-MS, לכן רצוי לבנות עקומות כיול עבור analytes כל עניין המטריצה זהים המדגם ביולוגי. עם זאת, אסטרטגיה זו הוא לא ריאלי כי זה כמעט בלתי אפשרי להכין את כל המינים SM בדגימות ביולוגיות, במיוחד בניתוח מקיף. לכן מעשית לבנות עקומת כיול ולקבוע טווח כמותית באמצעות זן SM נציג עלה בדגימות ביולוגיות. היינו שני מינים של SM isotopically התווית על-ידי בניית עקומת כיול; אחד שימש תקן פנימי והשני עבור תקן מורכבים. גילינו כמות קטנה של מינים SM isotopically שכותרתו כמו תרכובת רגילה עלה בדגימות ביולוגיות והשיג בהצלחה עקומת כיול ו טווח כמותי6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 100 מ"מ</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>צינור סיליקון 2.0 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>מכסה בורג מרופד טפלון</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>צינור זכוכית חד פעמי</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 ומיקרו; m 1.5 מ"מ מזהה x 100 מ"מ</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>מחסנית Guard מוכנסת למחזיק המחסנית, ומקושרת לעמודת C18</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 מ"מ x 10 מ"מ GUARD CARTRIDGE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחסנית</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול (איזופרופיל אלכוהול)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% מי אמוניה</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (סוג אמבטיה)</td> <td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת למבחנה מזכוכית</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 מ"ל בקבוקון זכוכית</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>הדגימות מאוחסנות בבקבוקון זכוכית של 1.4 מ"ל אטום עם מכסה בורג ומחיצה של 8 מ"מ ב-20&deg; C</td></tr><tr><td>8 מ"מ מחיצה</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>כאשר מנתחים דגימות, מכסי הברגים מוחלפים במכסי בורג עם מחיצת חריץ</td></tr><tr><td>מכסה בורג לבקבוקון זכוכית 1.4 מ"מ</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>מכסה בורג עם מחיצת חריץ</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 & מיקרו; m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטריית מסה משולשת של מלכודת יונים ליניארית מרובעת ומרובעת</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>התוכנה לרכישת נתונים וניתוח ספקטרום יונים של מוצר</td><td>SCIEX</td><td>אנליסט</td><td></td></tr><tr><td>התוכנה לשילוב נתונים בניתוח כמותי</td><td>מערכת SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>בקבוק זכוכית Nexera</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylphosphorylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' מדיום חיוני מינימלי</td><td>סיגמא</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת lc-ms באמצעות שני אורווה isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

אנו מציגים שיטה של ניתוח ספינגומיילין (SM) איכותית, באופן כמותי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (LC-ESI-MS/MS). SM הוא ספינגוליפיד משותף מורכב של phosphorylcholine של ceramide כרכיב הידרופיליות, הידרופוביות, בהתאמה. מספר מינים SM נמצאים בתאי יונקים בשל מגוון רחב של sphingoid ארוך רשת בסיס (LCB) N-moiety ליפיד ב- ceramide. בדו ח זה, אנו מציגים שיטה להערכת המספר של פחמן קשרים כפולים LCB, N-moiety ליפיד המבוסס על יונים המוצר המקביל שלהם בניסויים MS/MS/MS (MS3). בנוסף, אנו מציגים שיטת ניתוח כמותי ס באמצעות שני יציב isotopically שכותרתו SM מינים, אשר מקלה על קביעת הטווח בשימוש SM כימות. השיטה הנוכחית יהיה מועיל באפיון מגוון מינים SM דגימות ביולוגיות ומוצרים תעשייתיים כגון מוצרי קוסמטיקה.

מסונתז כימית d18:1 / 24:0 SM (איור 1א') ו- d18:1 / 24:0 SM בדגימות השומנים שחולצו מן התאים הלה (איור 1B) נותחו על ידי LC-ESI-MS3 העסקת [M + HCOO]– [M-CH3]- כמו יונים קודמן הראשון והשני, בהתאמה. שים לב האינטנסיביות ספקטרום של demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (מ/z 449) הוא גדול מזה של SM N-moiety ליפיד (מ/z 378). ב...

כאן, אנו מציגים בפרוטוקול כדי לכמת ויגדיר לכל מין ספינגומיילין באמצעות ניטור התגובה מרובים ומצב MS/MS/MS, בהתאמה.

שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח במדויק את הכמות והמבנה של כל מין ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השומנים הנוגעות לביולוגיה של שומנים ושומנים היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לאפיין מגוון מיני ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות על ידי מערכת ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה. כדי להתחיל, הסר את אמצעי התרבית מצלחת תרבית רקמה בגודל 10 סנטימטר המכילה תאי HeLa ושטוף את התאים פעמיים עם שישה מיליליטר PBS קר כקרח.לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר והשתמש במגרד תאים כדי לקצור את התאים. לאחר הסרתם מפני השטח של הצלחת, העבירו את התאים לשני צינורות פלסטיק סיליקון של מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר מתנול אחד לכל כדור תא.ואז מערבל בקצרה את הצינורות. לאחר מכן, הכניסו את הדגימות לסוניקטור מסוג אמבטיה וסוניקטו ב-200 וואט למשך חמש דקות. בסיום, העבירו את כל התא ההומוגני למבחנות המצוידות במכסי הברגה מצופים טפלון.כעת הוסף מיליליטר אחד של מתנול, מיליליטר אחד של כלורופורם, 0.8 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ב-50 מיקרוליטר של 10 מיקרומולר של תקן פנימי לכל מבחנה. מכסים את הצינורות ומערבלים אותם במרץ ב -2, 500 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף מיליליטר נוסף של כלורופורם ומיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים לכל צינור.שוב, מערבל את הצינורות במרץ ב -2, 500 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות על מנת להפריד לחלוטין בין השלבים המימיים והאורגניים. העבירו את השלב התחתון לצינורות זכוכית חד פעמיים.הוסף שני מיליליטר כלורופורם למבחנות. לאחר מכן מערבל את הצינורות במרץ ב -2, 500 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להתערבב מספיק עם השלב העליון והמוך הבין-שלבי. לאחר צנטריפוגה שנייה, העבירו את השלב התחתון שהשתנה לצינורות הזכוכית החד פעמיים יחד עם השלב התחתון הראשוני.כעת הניחו את צינורות הזכוכית מתחת לזרם חנקן למשך כ- 60 דקות והסירו לחלוטין את הממיסים האורגניים בשלב התחתון שנאסף. לבסוף, הרכיבו מחדש את הדגימות עם 500 מיקרוליטר מתנול או אתנול. מסננים את התערובת המתקבלת עם פילטר 0.02 מיקרון לבקבוקוני זכוכית.לאחר מכן אחסן את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס. בצע דילולים סדרתיים של התרכובת הסטנדרטית והוסף 50 מיקרוליטר מכל ריכוז למבחנות נפרדות. לאחר מכן, הכינו שלוש דגימות בקרת איכות על ידי הוספת כמות בטווח של פי שלושה מהגבול התחתון של העקומה הסטנדרטית לדגימה הראשונה, כמות ליד מרכז העקומה עבור הדגימה השנייה, וכמות ליד הגבול העליון של העקומה הסטנדרטית עבור הדגימה השלישית.לאחר מכן הוסף את התא הומוגנאט במיליליטר אחד של מתנול לכל מבחנה וחלץ את שבר השומנים הכולל מכל דגימה בשיטה שהוצגה זה עתה. כדי להתחיל, הכינו את השלב הנייד. מערבבים יחד אצטוניטריל, מתנול ומים מזוקקים כפולים ביחס של שניים לשניים לאחד עבור השלב הימי.השתמש באיזופרופנול לשלב האורגני בבקבוקי זכוכית עם מכסי הברגה מצופים טפלון. לאחר מכן סוניקטור את שני השלבים הניידים למשך חמש דקות בסוניקטור מסוג אמבטיה. לאחר מכן הוסף חומצה פורמית לריכוז סופי של 26.4 מילי-מולרית ואמוניום הידרוקסיד ב-14.9 מילי-מולר לכל שלב נייד.לניתוח איכותי, הפעל את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים. הכניסו צינורות כניסה לבקבוקי הזכוכית המכילים את השלבים הניידים וטהרו את קווי ה-HPLC. לאחר מכן קשר עמודת HPLC C18 למערכת HPLC.שמור על הטמפרטורה בתנור העמודים על 50 מעלות צלזיוס ומצב את העמודה בשלב הנייד המימי ב -100 מיקרוליטר לדקה. במהלך הריצה, הנח את הדגימות לתוך מתלה דגימה של הדגימה האוטומטית. הגדר את הפרמטרים של מערכת ספקטרומטריית המסה של מלכודת יונים ליניארית משולשת ומרובעת לניתוח ספקטרומטריית מסה תלת-שלבית כמפורט בטבלה הראשונה ובטבלה השנייה של פרוטוקול הטקסט הנלווה.כמו כן, הגדר את הפרמטרים עבור יוני המבשר הראשון והשני של מיני ה-SM המעניינים כמתואר ביתר פירוט בפרוטוקול הטקסט הנלווה. צור קובץ אצווה והגש את קובץ האצווה כדי לקבל את הנתונים של MS שלושה ספקטרום יונים של כל מין Sphingomyelin על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, יינון אלקטרו-ספריי, ניתוח ספקטרומטרי מסה טנדם. השג את ספקטרום היונים התלת פאזי של תוצר MS של מיני הספינגומיאלין המעניינים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, יינון אלקטרוספריי, ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם.לאחר מכן הקצה לכל MS שלושה ספקטרום יונים של ה-Sphingomyelin על ידי השוואת יחס המסה למטען של ספקטרום יוני התוצר במסה המדויקת של בסיס השרשרת הארוכה של הספינגואיד וחלק ה-n-acyl המעניין. לנתח כמותית את הספינגומיאלין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, יינון אלקטרוספריי, ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן עבד את נתוני ניטור התגובות המרובות באמצעות התוכנה לשילוב נתונים כדי להשיג את הנתונים של אזור השיא עבור כרומטוגרמת היונים המופקת של כל מין ספינגומיאלין.כמת כל מין של ספינגומיאלין ובנה את העקומות הסטנדרטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הספקטרום של ספינגומיאלין וספינגומיאלין מסונתזים כימית בדגימות שומנים המופקות מתאי HeLa מוצג כאן. יש לציין כי עוצמת הספקטרום של ספינגוזיל פוספוריל-כולין דה-מתילציה גדולה מזו של חלק ה-SM n-acyl בשתי הדגימות.מעניין גם שהספקטרום המתאים לספינגוזין-1-פוספט שימושי כדי לשער את מספר הפחמן והקשרים הכפולים של בסיס השרשרת הארוכה של הספינגומיאלין. בשיטה הכמותית הנוכחית, קריטי להכין במדויק דגימות לבניית עקומת הכיול באימות שיטה זו. העקומה המתאימה לריכוז נמוך שופרה בבירור על ידי שימוש במקדם השקלול שווה לאחד על x בריבוע בהשוואה לזה שהשתמש במקדם השקלול של אחד או אחד על x.טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה והתעשייה לאפיין מגוון זני ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות ובמוצרים תעשייתיים כגון קוסמטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח במדויק את הכמות והמבנה של כל מין ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות. אל תשכח שעבודה עם סופגים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בשחיתות זכוכית מתאימות בעת ביצוע הליך זה.בנוסף, חשוב ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום של שומנים שמקורם בידיים.

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

פרוטוקול זה ידגים מיצוי וניתוח של חומצות שומן ביו-אקטיביות חופשיות ואסטריות מהתאים. חומצות שומן מכומתות במדויק באמצעות דילול איזוטופים יציב, כרומטוגרפיה נוזלית כיראלית, לכידת אלקטרונים, יינון כימי אטמוספרי, ספקטרומטריית מסה לניטור תגובות מרובות (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

כאן אנו מראים טסיות אדם מבודדים יכולים לשמש נגיש vivo לשעבר מודל ללמוד עיבודים מטבוליים בתגובה במתחם שאני מעכב rotenone. גישה זו מעסיקה עקיבת איזוטופי וכימות ביחס ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה הנוזלית וניתן ליישם במגוון רחב של עיצובי מחקר.

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

ליפאזות (פוספו)ליפאזות חזויות רבות מאופיינות בצורה גרועה מבחינת הספציפיות של הסובסטרט והתפקודים הפיזיולוגיים שלהן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לייעול פעילות האנזימים, חיפוש אחר סובסטרטים טבעיים ומציעים פונקציות פיזיולוגיות לאנזימים אלה.

הגדרת מצע ספציפי עבור מועמדי lipase ו פוספוליפאז

טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים בעלי תפקידים מבוססים היטב במחלות אנושיות. אפיון שינויים ברקמות עם ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף תפקידים באטיולוגיה של מחלות או לזהות מטרות טיפוליות. עם זאת, תרכובת ה-OCT המשמשת לשימור בהקפאה בביו-רפוזיטורים מפריעה לספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטות לניתוח ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוטמעות ב-OCT עם LC-ESI-MS/MS.

הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה

מוצגת כאן שיטה לסינון מבני שומנים באמצעות תיוג איזוטופים יציבים באמצעות זמן השמירה, הניידות והפיצול שלהם.

מעקב אחר ליפידים של נובו באמצעות תיוג איזוטופ יציב LC-TIMS-TOF MS/MS

חקור שיטה לכימות ואיכות ספינגומיילין בדגימות ביולוגיות באמצעות LC-MS/MS/MS. הפרוטוקול מאפשר אנליזה מדויקת של מיני ליפידים בתאי HeLa ותורם להבנת ביולוגיית ליפידים.

שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

גלה סרטונים נוספים