שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח במדויק את הכמות והמבנה של כל מין ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השומנים הנוגעות לביולוגיה של שומנים ושומנים היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לאפיין מגוון מיני ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות על ידי מערכת ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה. כדי להתחיל, הסר את אמצעי התרבית מצלחת תרבית רקמה בגודל 10 סנטימטר המכילה תאי HeLa ושטוף את התאים פעמיים עם שישה מיליליטר PBS קר כקרח.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר והשתמש במגרד תאים כדי לקצור את התאים. לאחר הסרתם מפני השטח של הצלחת, העבירו את התאים לשני צינורות פלסטיק סיליקון של מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר מתנול אחד לכל כדור תא.

ואז מערבל בקצרה את הצינורות. לאחר מכן, הכניסו את הדגימות לסוניקטור מסוג אמבטיה וסוניקטו ב-200 וואט למשך חמש דקות. בסיום, העבירו את כל התא ההומוגני למבחנות המצוידות במכסי הברגה מצופים טפלון.

כעת הוסף מיליליטר אחד של מתנול, מיליליטר אחד של כלורופורם, 0.8 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ב-50 מיקרוליטר של 10 מיקרומולר של תקן פנימי לכל מבחנה. מכסים את הצינורות ומערבלים אותם במרץ ב -2, 500 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף מיליליטר נוסף של כלורופורם ומיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים לכל צינור.

שוב, מערבל את הצינורות במרץ ב -2, 500 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות על מנת להפריד לחלוטין בין השלבים המימיים והאורגניים. העבירו את השלב התחתון לצינורות זכוכית חד פעמיים.

הוסף שני מיליליטר כלורופורם למבחנות. לאחר מכן מערבל את הצינורות במרץ ב -2, 500 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להתערבב מספיק עם השלב העליון והמוך הבין-שלבי. לאחר צנטריפוגה שנייה, העבירו את השלב התחתון שהשתנה לצינורות הזכוכית החד פעמיים יחד עם השלב התחתון הראשוני.

כעת הניחו את צינורות הזכוכית מתחת לזרם חנקן למשך כ- 60 דקות והסירו לחלוטין את הממיסים האורגניים בשלב התחתון שנאסף. לבסוף, הרכיבו מחדש את הדגימות עם 500 מיקרוליטר מתנול או אתנול. מסננים את התערובת המתקבלת עם פילטר 0.02 מיקרון לבקבוקוני זכוכית.

לאחר מכן אחסן את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס. בצע דילולים סדרתיים של התרכובת הסטנדרטית והוסף 50 מיקרוליטר מכל ריכוז למבחנות נפרדות. לאחר מכן, הכינו שלוש דגימות בקרת איכות על ידי הוספת כמות בטווח של פי שלושה מהגבול התחתון של העקומה הסטנדרטית לדגימה הראשונה, כמות ליד מרכז העקומה עבור הדגימה השנייה, וכמות ליד הגבול העליון של העקומה הסטנדרטית עבור הדגימה השלישית.

לאחר מכן הוסף את התא הומוגנאט במיליליטר אחד של מתנול לכל מבחנה וחלץ את שבר השומנים הכולל מכל דגימה בשיטה שהוצגה זה עתה. כדי להתחיל, הכינו את השלב הנייד. מערבבים יחד אצטוניטריל, מתנול ומים מזוקקים כפולים ביחס של שניים לשניים לאחד עבור השלב הימי.

השתמש באיזופרופנול לשלב האורגני בבקבוקי זכוכית עם מכסי הברגה מצופים טפלון. לאחר מכן סוניקטור את שני השלבים הניידים למשך חמש דקות בסוניקטור מסוג אמבטיה. לאחר מכן הוסף חומצה פורמית לריכוז סופי של 26.4 מילי-מולרית ואמוניום הידרוקסיד ב-14.9 מילי-מולר לכל שלב נייד.

לניתוח איכותי, הפעל את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים. הכניסו צינורות כניסה לבקבוקי הזכוכית המכילים את השלבים הניידים וטהרו את קווי ה-HPLC. לאחר מכן קשר עמודת HPLC C18 למערכת HPLC.

שמור על הטמפרטורה בתנור העמודים על 50 מעלות צלזיוס ומצב את העמודה בשלב הנייד המימי ב -100 מיקרוליטר לדקה. במהלך הריצה, הנח את הדגימות לתוך מתלה דגימה של הדגימה האוטומטית. הגדר את הפרמטרים של מערכת ספקטרומטריית המסה של מלכודת יונים ליניארית משולשת ומרובעת לניתוח ספקטרומטריית מסה תלת-שלבית כמפורט בטבלה הראשונה ובטבלה השנייה של פרוטוקול הטקסט הנלווה.

כמו כן, הגדר את הפרמטרים עבור יוני המבשר הראשון והשני של מיני ה-SM המעניינים כמתואר ביתר פירוט בפרוטוקול הטקסט הנלווה. צור קובץ אצווה והגש את קובץ האצווה כדי לקבל את הנתונים של MS שלושה ספקטרום יונים של כל מין Sphingomyelin על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, יינון אלקטרו-ספריי, ניתוח ספקטרומטרי מסה טנדם. השג את ספקטרום היונים התלת פאזי של תוצר MS של מיני הספינגומיאלין המעניינים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, יינון אלקטרוספריי, ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם.

לאחר מכן הקצה לכל MS שלושה ספקטרום יונים של ה-Sphingomyelin על ידי השוואת יחס המסה למטען של ספקטרום יוני התוצר במסה המדויקת של בסיס השרשרת הארוכה של הספינגואיד וחלק ה-n-acyl המעניין. לנתח כמותית את הספינגומיאלין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, יינון אלקטרוספריי, ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן עבד את נתוני ניטור התגובות המרובות באמצעות התוכנה לשילוב נתונים כדי להשיג את הנתונים של אזור השיא עבור כרומטוגרמת היונים המופקת של כל מין ספינגומיאלין.

כמת כל מין של ספינגומיאלין ובנה את העקומות הסטנדרטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הספקטרום של ספינגומיאלין וספינגומיאלין מסונתזים כימית בדגימות שומנים המופקות מתאי HeLa מוצג כאן. יש לציין כי עוצמת הספקטרום של ספינגוזיל פוספוריל-כולין דה-מתילציה גדולה מזו של חלק ה-SM n-acyl בשתי הדגימות.

מעניין גם שהספקטרום המתאים לספינגוזין-1-פוספט שימושי כדי לשער את מספר הפחמן והקשרים הכפולים של בסיס השרשרת הארוכה של הספינגומיאלין. בשיטה הכמותית הנוכחית, קריטי להכין במדויק דגימות לבניית עקומת הכיול באימות שיטה זו. העקומה המתאימה לריכוז נמוך שופרה בבירור על ידי שימוש במקדם השקלול שווה לאחד על x בריבוע בהשוואה לזה שהשתמש במקדם השקלול של אחד או אחד על x.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה והתעשייה לאפיין מגוון זני ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות ובמוצרים תעשייתיים כגון קוסמטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח במדויק את הכמות והמבנה של כל מין ספינגומיאלין בדגימות ביולוגיות. אל תשכח שעבודה עם סופגים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בשחיתות זכוכית מתאימות בעת ביצוע הליך זה.

בנוסף, חשוב ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום של שומנים שמקורם בידיים.