ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא ליצור צמחים טרנסגניים הנושאים החדרות שלמות של עותק יחיד של DNA העברה, או T-DNA, בצורה יעילה. וקטור BIBAC-Gateway הוא כלי רב ערך ליצירת צמחים טרנסגניים הנושאים הוספות שלמות בעותק יחיד של רצפים מעניינים המראים ביטוי גנים יציב. עם וקטור BIBAC-Gateway, ניתן להשתמש בטכנולוגיית רקומבינציה של Gateway כדי להכניס רצפים מעניינים במינימום מאמץ.

כל נגזרות BIBAC, כולל וקטורי BIBAC-Gateway, מתאימות להעברת מקטעי DNA גדולים וטרנסגניים לגנום של צמחים. ניתן להשתמש בווקטורי BIBAC-GW כדי להכניס רצפים מעניינים למערכות צמחים רבות, כגון תירס, אורז ועגבנייה. ישנם שני פלסמידים BIBAC-GW זמינים.

הפלסמיד BIBAC-RFP-GW מכיל גן DsRed המתבטא בשכבות זרעים. הפלסמיד BIBAC-BAR-GW מכיל גן המספק עמידות לגלופוסינאט. שני הווקטורים מכילים גן עמיד לקנמיצין כסמן בחירה בחיידקים.

כדי להכניס את רצפי העניין לווקטור הבינארי, הכן תחילה את ערך השער והווקטורים הבינאריים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע תגובת Gateway, הכינו את תגובת הרקומבינציה של LR בהתאם להצעות הספק בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר בטמפרטורת החדר. מערבבים 100 עד 300 ננוגרם של שיבוט הכניסה המפותל ו-300 ננוגרם של וקטור BIBAC-Gateway.

התאם את נפח התערובת ל -16 מיקרוליטר עם TE. לבסוף, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של תערובת אנזימים LR Clonase, וערבבו על ידי מערבולת. דוגרים על התערובת בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה. סיים את תגובת ה-LR על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של תמיסת Proteinase K לתערובת.

מערבבים ומדגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני שתמשיך בטרנספורמציה ל- E.coli, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את צמחי הארבידופסיס לטרנספורמציה, גדלו צמחי ארבידופסיס בחממה או בתא גידול מבוקר אקלים עד שהם פורחים. מהדקים את הברגים הראשונים כדי לאפשר לברגים משניים נוספים להופיע.

הצמחים מוכנים לטבילה ארבעה עד שישה ימים לאחר הגזירה, כאשר לצמחים יש הרבה ראשי פרחים לא בשלים ולא הרבה סיליקיות מופרות. לביצוע טבילת פרחים, טבלו תפרחות למשך חמש עד 10 שניות בתרחיף אגרובקטריום. השתמש בתסיסה עדינה.

עטפו את החלקים מעל הקרקע של הצמחים בניילון נצמד כדי לשמור על לחות גבוהה, וכסו את העציצים בקופסה כדי לשמור על הצמחים בחושך. דגרו את הצמחים במשך יומיים בחממה או בתא גידול. לאחר יומיים, הסר את הקופסה ואת הסרט הנצמד וגדל את הצמחים לבגרות בחממה או בתא גידול.

כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, ניתן לטבול מחדש את אותם צמחים שבעה ימים לאחר הטבילה הראשונה. לאחר מכן, כאשר הצמחים שעברו טרנספורמציה בוגרים ויבשים, קצרו את הזרעים. אסוף ונתח את זרעי הצמחים שעברו טרנספורמציה עם אותו מבנה כמו קבוצה בודדת.

במקרה שצמחים עוברים טרנספורמציה עם נגזרת פלסמיד BIBAC-RFP-Gateway, זהה צמחים טרנסגניים על ידי ניתוח הזרעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לזהות ביטוי DsRed בשכבות זרעים, דמו את הזרעים בעירור של 560 ננומטר ופליטה של 600 עד 650 ננומטר. הפרד את זרעי הפלואורסצנט מעמיתיהם שאינם פלואורסצנטיים באמצעות מלקחיים.

כדי לסנן צמחים טרנסגניים שעברו טרנספורמציה עם נגזרת פלסמיד BIBAC-BAR-Gateway, זרעו את הזרעים במגשים מלאים באדמה. הקפידו על פיזור אחיד של זרעים על מגשים על ידי השעיית זרעים ב-0.1% אגר במדיום MS 0.5x, ופזרו את הזרעים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד. לעורר את הזרעים לנבוט בצורה סינכרונית על ידי דגירה של הזרעים למשך יומיים לפחות בארבע מעלות צלזיוס.

ניתן לעשות זאת לפני או אחרי זריעת הזרעים. שבועיים ושלושה לאחר זריעת הזרעים, יש לרסס את השתילים בתמיסת גלופוסינאט-אמוניום של 0.5%. השתמש ב-500 מיליליטר של תמיסת גלופוסינאט-אמוניום למטר מרובע אחד.

העבירו שתילים ששרדו לעציצים. נתח את הצמחים העמידים לגלופוסינאט-אמוניום על ידי PCR לנוכחות המבנה המעניין. קבע את מספר האינטגרציות של T-DNA ואת שלמותן על ידי ספיגת DNA באמצעות אנזימי הגבלה.

שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטגרציות בודדות כמו גם חוזרות ונשנות באותו מקום או במיקומים שונים בגנום. השתמש בסדרה של עיכול הגבלה כדי לזהות את דפוסי האינטגרציה השונים האפשריים. בחר אנזים שחותך פעם אחת באמצע ה-T-DNA, כדי להיות מסוגל לחקור באופן עצמאי רצפים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אתר ההגבלה.

כמו כן, בחר אנזים או שילוב של אנזימים החותכים את כל רצף העניין בבת אחת. הקפד להשתמש רק באנזימי הגבלה שאינם רגישים למתילציה של ציטוזין. לאחר ביצוע ספיגת DNA, כמפורט בפרוטוקול הטקסט, בצע ניתוח כתמים.

הניתוח תלוי באסטרטגיית ההגבלה בה נעשה שימוש. כאשר מנתחים את הכתם באמצעות האסטרטגיה עם אתר הגבלה אחד באמצע ה-T-DNA, ספרו את מספר השברים שזוהו. באסטרטגיה זו, מספר המקטעים ההיברידיים מרמז על מספר אינטגרציות T-DNA.

השווה את מספר השברים שזוהו עם בדיקה עבור הצד השמאלי והימני של ה-T-DNA. אם מתגלה מספר שונה של שברי הכלאה עם שתי הבדיקות, אז קיימים אינטגרציות T-DNA מרובות בחזרה הפוכה או T-DNA משולב באופן לא מלא. כדי לזהות סידורים טנדם והפוכים של ה-T-DNA, העריכו את הגדלים של השברים ההיברידיים על הכתם על סמך גודל רצועות הסמן, והשוו את הגדלים המשוערים עם גדלי השברים הצפויים המחושבים על סמך אסטרטגיית ההגבלה.

כדי לבחון אם רצף העניין הטרנסגני שלם, נתח את הכתם שהוכן על פי האסטרטגיה עם אתרי הגבלה בקצוות רצף העניין. העריכו את גודל השברים ההכלאיים על הכתם על סמך גודל רצועות הסמן, והשוו אותו לגודל הצפוי. החדרה שלמה מניבה שבר בודד באורך מוגדר.

כל סטייה מהאורך הצפוי מעידה על אינטגרציה לא שלמה. מוצגת אסטרטגיית הגבלת ה-DNA והכתמה לקביעת המספר והשלמות של אינטגרציות T-DNA. אתר הגבלת ScaI מחלק את רצף המדווח לחלקים הפרוקסימליים של הגבול השמאלי שמתגלים בעת שימוש בבדיקה עבור סרגל ולחלקים הפרוקסימליים של הגבול הימני שמתגלים בעת שימוש בבדיקה עבור eYFP.

אתרי ההגבלה BglII ו-PciI ממוקמים בתוך ה-T-DNA, מחוץ למבנה המדווח. עיכול כפול מביא לשבר בגודל מוגדר, וכל סטייה היא אינדיקציה להחדרה לא שלמה. מספר מקטעי הכלאה שזוהו משקף את מספר החדרות ה-T-DNA.

כתם אחד המכיל DNA גנומי של תשע טרנסגניות שעוכלו עם ScaI הוכלאה עם בדיקות לבר ו-eYFP. מספר נתיבים מצביעים על טרנסגניות עם אינטגרציות T-DNA יחידות. נתיב 4 מציג שני מקטעים עם עמודה ואחד עם eYFP, המציין חיתוך של רצף eYFP או חזרה הפוכה סביב הגבול הימני.

נתיב שש מציג שני שברים עם בר ו-eYFP. לשבר אחד יש עוצמה חלשה עם בדיקת המוט. השבר השני הוא בעל עוצמה גבוהה, מה שמעיד על שתי החדרות T-DNA, שאחת מהן קטועה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב את רצף ה-DNA המעניין שלך בווקטור בינארי של BIBAC-GW באמצעות רקומבינציה של Gateway, ואחריו טרנספורמציה, סינון והערכה של מספר אינטגרציות T-DNA ושלמותן. ייצור ואפיון צמחים טרנסגניים גוזל זמן. בעת שימוש ב-BIBAC-Gateway כווקטור בינארי, ניתן לקצר את תהליך זיהוי הטרנסגניות עם אינטגרציות שלמות של עותק יחיד.

כמחצית מהטרנסגניות שנוצרו עם נגזרות BIBAC נושאות אינטגרציות שלמות בעותק יחיד. בדרך כלל, אנשים אינם מבינים שצמחים טרנסגניים רבים שנוצרו באמצעות וקטורים בינאריים נפוצים נושאים עותקים קטומים של טרנסגן או טרנסגנים המראים השתקת גנים. עם נגזרות BIBAC, רוב הצמחים הטרנסגניים שנוצרו נושאים אינטגרציות בודדות שלמות של טרנסגן שמראים לעתים רחוקות השתקת גנים.

בעת שימוש ב-BIBAC-GW ליצירת טרנסגנים, חשוב להפוך מספר מספיק של חומרים צמחיים, מכיוון שיעילות הטרנספורמציה הכוללת של נגזרות BIBAC נמוכה מזו של וקטורים בינאריים נפוצים. יעילות הטרנספורמציה של BIBAC-GW היא בדרך כלל בין 0.2% ל-0.5% לאחר זיהוי צמחים טרנסגניים הנושאים אינטגרציות T-DNA שלמות בעותק יחיד, במידת הצורך, ניתן לבצע ניתוח נוסף כדי להגדיר את המיקום הגנומי המדויק של החדרת T-DNA. טרנסגנים עם אינטגרציות שלמות של עותק יחיד מציגות רמות ביטוי דומות של הטרנסגנים.

זה מצביע על כך שלמיקום האינטגרציה של ה-T-DNA בגנום יש השפעה מועטה על רמת הביטוי של הטרנסגן.