שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור עותקים באיכות גבוהה של הספרייה המוטנטית המסודרת והלא מיותרת של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 המכונה ערכת PA14NR. פרוטוקול זה שומר על תקינות ערכת PA14NR במהלך השכפול, ויוצר עותקים באיכות גבוהה של ספרייה זו. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק תיאור מפורט של כל השלבים הכרוכים בשכפול ספרייה, בקרת איכות ואחסון נכון של מוטאנטים בודדים.

למרות שפרוטוקול זה תוכנן לשכפל את ערכת P14NR, ניתן להתאים אותו לשכפול ספריות חיידקים אחרות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הסיכון לזיהום במהלך תהליך השכפול. לכן, פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות שלב אחר שלב כדי להפחית את הסיכון הזה.

המעבדה שלנו מפיצה את ערכת PA14NR לקהילה המדעית העולמית. ואנו ממליצים שהספריות ישוכפלו על-ידי משתמש הקצה. כדי לספק הדרכה, אנו מציעים פרוטוקול המפרט כיצד ליצור עותקים באיכות גבוהה של הספרייה.

הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית, במיוחד הצעדים שנועדו למנוע זיהום צולב. להגנה עצמית, כמו גם להגנה על תרביות החיידקים, יש ללבוש תמיד מעיל מעבדה, כפפות ומסכה בעת הטיפול בספריית המוטנטים הלא מיותרת של החדרת טרנספוזון של זן P aeruginosa PA14, המיועד לסט PA14NR. הכן צלחות LB Agar על ידי יציקת כ -60 מיליליטר אגר LB מותך לצלחות מלבניות.

יבש את הצלחות במכסה מנוע סטרילי כשעה לפני השימוש. צור שדה סטרילי עם מבער בונסן על ספסל מנוגב אתנול. והגדר מכולות עם פתרונות מתאימים לעיקור סיכות משכפל.

הסר פלטת מאסטר סט PA14NR מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס, והניח אותה על קרח יבש בתבנית קרח של 4 ליטר. קח את לוח המאסטר של 96 הבארות כדי לשכפל מהקרח היבש והנח אותו על הספסל כדי לאפשר הפשרה קצרה. יישר את לוחית המאסטר ואת לוחית האגר עם קואורדינטות A1 של שתי הלוחות בפינה השמאלית העליונה.

סמן את המיקום של קואורדינטת A1 על צלחת האגר המלבנית. כדי לעקר את פיני המשכפל, טבלו את הפינים ב-250 מיליליטר של 0.3 עד 0.5% נתרן היפוכלוריט למשך 30 שניות. הקש מעט על המשכפל כדי להסיר עודפי נוזלים ולטבול את הפינים ב-250 מיליליטר של מים אולטרה-טהורים סטריליים למשך 10 שניות, ולאחר מכן 250 מיליליטר של 70% אתנול למשך 30 שניות ו-250 מיליליטר של 95% אתנול למשך שתי דקות.

להבה מעקרת את פיני המשכפל על ידי החזקת המשכפל בניצב ללהבת מבער הבונסן , מתקרבת לאט ללהבה עד שהאתנול נדלק ואז מושכת אותו מיד מהלהבה. הלהבה תכבה ברגע שכל האתנול יישרף. מצננים את הסיכות על ידי הצמדה לצלחת מלבנית שאינה בשימוש המכילה אגר LB סטרילי למשך 30 שניות.

בזמן שפיני המשכפל מתקררים, חממו לזמן קצר את אטם האלומיניום מלוח המאסטר של ערכת PA14NR בידכם, ולאחר מכן קלפו אותו בזהירות, וודאו שהאטם אינו מרטש את הצלחת. השתמש בפינצטה כדי לקלף שאריות של אטם האלומיניום. הכנס את פיני המשכפל לתוך לוח המאסטר, דחף בעדינות והניף את המשכפל לכל ארבעת הכיוונים כדי להבטיח שהפינים יבואו במגע עם תרביות החיידקים הקפואות בכל אחת מ-96 הבארות.

שימו לב במיוחד לבארות הממוקמות בקצה החיצוני של הצלחת על ידי דחיפת סיכות משכפל כנגד תרביות קפואות בבארות הממוקמות בקצה הצלחת. הנח בעדינות את סיכות המשכפל על פני לוחות האגר. הזז את המשכפל בתנועה מעגלית קלה כדי ליצור מדשאות רבות של כארבעה עד חמישה מילימטרים עבור כל זן מוטנטי.

אטום את לוחית המאסטר של ערכת PA14NR עם אטם אלומיניום סטרילי חדש. השתמש ברולר צלחת כדי להבטיח שכל באר וקצוות הצלחת אטומים לחלוטין. החזר את לוח המאסטר של 96 בארות לקרח יבש.

לאחר הטיפול בערכת PA14NR, נגב את כל משטחי העבודה עם 70% אתנול. העבירו את צלחת האגר המשוכפלת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך הלילה. לפני שתתחיל בהליך זה, ודא שמכסה המנוע הלמינרי נקי מציוד מיותר והפעל את מפוח מכסה המנוע למשך 10 דקות לפחות.

נגב את משטחי מכסה המנוע וכל פריט המונח במכסה המנוע באמצעות 70% אתנול. בעזרת פיפטה אלקטרונית של 50 עד 1200 מיקרוליטר 12 ערוצים, מלאו כל באר של בלוק באר עמוק של 12 מיליליטר ב-525 מיקרוליטר של מרק נוזלי LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. לאחר מכן אטום את גוש הבאר העמוק לפני הסרתו ממכסה המנוע הלמינר.

לאחר מכן, העבירו את בלוק הבאר העמוק המלא במדיה לספסל מנוגב באתנול. צור שדה סטרילי עם מבער בונסן על הספסל, והגדר מיכלים עם פתרונות מתאימים לעיקור סיכות משכפל. טבלו את פיני המשכפל בכל פתרון כפי שהודגם קודם לכן.

להבה לעקר את סיכות המשכפל. לאחר מכן מצננים את הסיכות על ידי הצמדה לצלחת מלבנית שאינה בשימוש המכילה אגר LB למשך 30 שניות. הנח בעדינות את סיכות המשכפל על צלחת האגר המכילה זנים מוטנטיים מגודלים, ובדוק שהפינים נמצאים במגע עם כל 96 המוטאנטים על צלחת האגר

לאחר מכן טבלו את הסיכות לבארות העמוקות המכילות מרק נוזלי LB למשך חמש עד 10 שניות. הימנע מלגעת בדפנות הבארות עם הסיכות. אטום את גוש הבאר העמוק בקרום איטום נושם סטרילי.

השתמש ברולר צלחת כדי להבטיח שכל באר בודדת אטומה כהלכה. נגב את כל משטחי העבודה עם 70% אתנול לאחר הטיפול בסט PA14NR. גדל את תרביות הנוזל המחוסנות בשייקר במהירות גבוהה ב-37 מעלות צלזיוס ו-950 סל"ד למשך 15 עד 16 שעות.

התחל בניקוי מכסה המנוע הלמינארי, והפעלת מפוח מכסה המנוע למשך 10 דקות לפחות. נגב את כל משטחי מכסה המנוע וכל פריט המונח במכסה המנוע עם 70% אתנול. הסר את צלחות 96 הבאר מהניילון.

קלף את תווית הצלחת עבור כל צלחת והנח אותה לאורך קצה הצלחת הקרוב ביותר לבארות A1 עד H1 של לוחית היעד. הרם מעט את המכסה של לוחית היעד והנח את התווית בקצה התחתון כדי להציג את התווית כאשר הצלחת מכוסה במכסה. הסר את גוש הבאר העמוק מהשייקר המהיר, והעביר את הבלוק למכסה הזרימה הלמינרי הסטרילי.

הסר בזהירות את קרום האיטום הנושם והחלף בחותם אלומיניום. סובב את גוש הבאר העמוק במהירות נמוכה מאוד כדי לאסוף עיבוי. מכיוון שהעברת התרביות ללוחות היעד מהווה את הסיכון הגדול ביותר לזיהום פוטנציאלי בין בארות, חשוב לעקוב בקפידה אחר כל הנהלים לשמירה על סטריליות.

החזר את גוש הבאר העמוק למכסה המנוע הסטרילי. בעזרת פיפטה אלקטרונית של 50 עד 1200 מיקרוליטר 12 ערוצים וקצות מסוננות סטריליות, הוסף 525 מיקרוליטר של תערובת מרק נוזלי גליצרול LB לכל באר. מערבבים על ידי פיפטינג עדין של 300 מיקרוליטר למעלה ולמטה שלוש פעמים בעזרת פיפטה אלקטרונית.

גע בקצוות בצד הבארות, לפני הזרקת הקצוות כדי למנוע טפטוף. טען מחדש את הפיפטה בקצוות מסוננים סטריליים חדשים, ומלא את שורת הבארות הבאה בתערובת המרק הנוזלי גליצרול LB. לאחר שכל הבארות התמלאו בתערובת המרק הנוזלי של גליצרול LB, השתמש בפיפטה האלקטרונית בעלת 12 הערוצים ובקצות המסוננים כדי למשוך 900 מיקרוליטר של תערובת תרבית מוטנטית של גליצרול מכל שורה של בלוק הבאר העמוק, ולהוציא 150 מיקרוליטר לבארות של השורה המתאימה בלוחות היעד כדי ליצור שישה עותקים של לוחית הספרייה.

השתמש באטם האלומיניום הסטרילי כדי לכסות כל צלחות יעד של 96 בארות, והשתמש ברולר צלחת כדי לאטום לחלוטין את קצוות הצלחת ואת כל הבארות. הקפד לא לכסות את מזהה התווית בחותם האלומיניום. הסר את הצלחות האטומות ממכסה המנוע והניח אותן על משטח ישר במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.

נגב את כל משטחי העבודה עם 70% אתנול לאחר הטיפול בספרייה. באמצעות הפרוטוקול המודגם בסרטון זה, שוכפלו 12 עותקים של ערכת PA14NR כולל לוחות בקרה המורכבים מבארות מחוסנות ולא מחוסנות מסוג PA14 המשולבות בתבנית מוגדרת מראש. לוחות הבקרה נבדקו ויזואלית לאחר שכפול על לוחות אגר LB כדי להבטיח את נוכחותם של דפוסי גידול צפויים.

38 זנים מוטנטיים נבחרו באופן אקראי מאחד העותקים החדשים שנוצרו של ערכת PA14NR, והגברת PCR באמצעות פריימרים שרירותיים בוצעה כדי לאשר את זהות המוטציות של הטרנספוזונים. ריצוף מאוחר יותר של שברי ה-DNA אישר את זהותם של 35 מתוך 38 המוטאנטים שנבדקו. לאחר השליטה, שכפול הספרייה כולה לוקח בערך 80 שעות.

בעת השימוש בפרוטוקול זה, חשוב לשים לב לדברים סטריליות של אזור העבודה בכל עת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור עותקים באיכות גבוהה של ערכת P14NR או ספריות חיידקים אחרות. אל תשכח, עבודה עם Pseudomonas עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש ללבוש ציוד מגן אישי בזמן ביצוע פרוטוקול זה.

פרוטוקול זה משמר את ספריית המוטציות הלא מיותרות Pseudomonas aeruginosa PA14 שממשיכה להוות משאב חשוב, לא רק לבדיקת תפוקה גבוהה, אלא גם כמקור למוטציות בודדות ברוב הגנים של Pseudomonas aeruginosa.