Name: Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: למדו שיטת הפטקטומיה לובולרית חלקית להתחדשות הכבד בעכברים נאונטליים. טכניקה מינימלית פולשנית זו מאפשרת חקר תאי גזע ספציפיים לכבד ותהליכי התחדשות מורפולוגיים ללא שימוש בחומרים כימיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים עמ' צ'ו לביצוע H & E והיסטולוגיה; וואנג ג. ו א מקארתי לדיונים מועיל. המחקר נתמך באמצעות מימון וירג'יניה ו ד K. לודוויג הקרן לחקר הסרטן; הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (R01HL058770 ו- U01HL099999); מכון קליפורניה מענקים רפואה רגנרטיבית (RC1 00354) I.W. Y.R. ונתמך על ידי האדם הגבול המדע תוכנית הקריירה פיתוח בפרס (CDA00017), קרן מחקר גרמני (2787 RI/1), מכון תאי גזע של Siebel, ו תומאס, סטייסי Siebel קרן (1119368-104-GHBJI). J.M.T. נתמכה על ידי NIH (T32GM007365), בפרס שירות המחקר הלאומית (1F30DK108561), ואת פול דייזי סורוס מלגת האמריקאים החדשים.

כל הניסויים בוצעו בהתאמה קפדנית עם המנחים שנקבעו על ידי האגודה מגוונת פאנל ניהול הסמכה של מעבדה חיה אכפת הבינלאומי (AAALAC) ואת אוניברסיטת סטנפורד על חיות מעבדה טיפול (APLAC), (פרוטוקול מס ' #10266), ארצות הברית, או חוק האירופית בעלי חיים רווחה, דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי. הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של ממשלת בוואריה, גרמניה, וקיבל את ההרשאה לא: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. הכנה בעלי חיים
<ol><li>הכן של כלוב ריק עם מצעים המתאימים על כרית החימום.</li>
	<li>לפני מגע חיות עם כפפות, לשפשף המצעים של האם אל הכפפות.</li>
	<li>הסר כל הגורים שלהם אמא ומקום לתוך הכלוב ריק. להסיר חלק מצעים של האם ולמקם אותו בכלוב ריק עם הגורים.</li>
	<li>מקם את האמא בכלוב נפרד, נקי, יבש מהשדה כירורגי.</li>
	<li>דון כפפות חדש, נקי סטרילי לפני ההכנה דימומים.</li>
</ol>2. דימומים הכנה
<ol><li>באמצעות פיפטה של 10-mL, להוסיף 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) צלחת פטרי 10-ס מ.</li>
	<li>פיפטה 2 מ של פתרון ואנטיספטיות betadine או שווה ערך הפטרי ס מ-10.</li>
	<li>במקום טווח ויבתר על השדה הכירורגי. להפעיל לנתח היקף המנורה ולהתאים את רמת האור כדי לנחם את המנתח. גור ניתן להציב בשטח כירורגית מתחת למנורה היקף ויבתר. אור נאותה יכול להיות מאושרות על ידי העדר של צללים על המשטח הגחון של הכלבלב.</li>
	<li>הכינו את תא הרדמה איזופלוריין (ראה טבלה של חומרים) עם קונוס האף. החדר צריך לנקות ללא עדות שתן או צואה. מקם את האף חרוט ואת צינורות המשויך מתחת למיקרוסקופ ויבתר בשטח כירורגית. להטות את זרימת החמצן ואת איזופלוריין אך ורק כדי קונוס האף.</li>
	<li>הכנת אזור ההחלמה שלאחר הניתוח עם כרית חימום להגדיר כ 37 מעלות צלזיוס. ההחלמה לאחר הניתוח צריכה להכיל 4 חתיכות של גזה הממוקמת מעל כרית החימום. במידת האפשר, לשפשף תחבושות גזה מצעים של האם, צואה, שתן כדי לשמר את הריח של האם. הערה: זה לא נבונה להשתמש מנורת חימום, כמו זה מקשה לשלוט בטמפרטורה. טמפרטורות גבוהות תגרום למותם של עכברים neonatal.</li>
	<li>להכין ולחטא את כל מכשירי ניתוח עם החיטוי. הכלים הדרושים כוללים: מספריים לנתח מיקרו מלקחיים לנתח מיקרו, גזה, עוצר דימום, תפרים נספגים monofilament כל 6-0. מכשירי ניתוח יכול להיות resterilzed עם כל מעקר חרוז זכוכית.</li>
</ol>3. חלקית Hepatectomy Lobular
<ol><li>עזים ומתנגד הכלבלב זה, האף חרוט על שלה בחזרה ובעדינות מקליטה את הרגליים והידיים, במקום להניח. הגורים אמורים לקבל איזופלוריין 5% חמצן.<ol>
<li>לאפשר הכלבלב לשבת במשך 5 דקות או עד שלמאחה מרדימים, אשר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי בדיקת קורט הבוהן.</li>
		<li>להזריק 5 מ"ג/ק"ג של carprofen subcutaneously לפני החיתוך. הערה: כל הניתוח לא דרושות יותר מאשר תוצאות עניים 30 דקות עלולים להיות שנצפו ב- neonates הנמצאות תחת הרדמה כללית במשך יותר מ 30 דקות. לנקוט אמצעי זהירות כדי לצמצם את משך הניתוח דרך הכנה יסודית שדה, הרטבה של העור לפני הסגר כדי למזער את התפר המושרה העור דמעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנקות בעדינות הבטן מהקיר האחורי עם כרית קטנה גאזה רטוב עם betadine. לאפשר את הבטאדין לייבוש על 1 דקות.</li>
	<li>עושים חתך אמצע-בריחי השמאלי 0.5 ס מיד מתחת הצלעות עם מספריים לנתח מיקרו, מלקחיים. בעדינות להפריד את העור באמצעות מלקחיים, עושים חתך עמוק השני לתוך חלל הצפק (ראה איור 1C, מרכז ושמאלה)</li>
	<li>בעדינות לרוחב ללחוץ משני צידי הבטן באמצעות חזרה, מסתיים בוטה של לנתח מיקרו מספריים, מלקחיים כדי לאלץ את השיא של האונה השמאלית מתוך חלל הצפק. השיא השמאלי של האונה השמאלית צריך להיות מטמיעים בקלות (איור 1C, נכון).</li>
	<li>
מהקודקוד, לקטוע ולשקול את כמות רקמת יוסרו.
	<ol>
<li>בעדינות בעזרת המספריים ניתוח מיקרו, לקטוע את הכמות הרצויה של רקמות מן השיא של האונה השמאלית.</li>
		<li>המקום הרקמה הקטוע לתוך צינור 1.5-mL מלא PBS. שוקל הרקמה הקטוע באמצעות איזון האנליטי (ראה טבלה של חומרים). הערה: מניחים חתיכת גזה או נייר על האיזון, להקרע זה. ואז למקם את הרקמה הקטוע גזה או נייר ולמדוד את המסה.</li>
		<li>לתקן אזור הקטוע ב- 2% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 1 h ומקום טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) המורכב על קרח יבש לניתוח באזור הקפואים. לנתח את סעיפים קפוא על ידי חיתוך 7-10 מיקרומטר למקטעים באמצעות כל cryostat רגיל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעדינות באמצעות פיסת גזה מגולגלת, להחליף האונה השמאלית לתוך חלל הצפק. להשאיר את הגזה בחלל עד התחנות דימום.</li>
	<li>הסר את הגזה, רטוב באתר כירורגית והסביבה עם גזה ספוגה PBS.</li>
	<li>לסגור את האתר כירורגית עם 6-0 monofilament, תפרים נספגים עם תפר פועל. צפק ו העור צריך להיות סגור בנפרד. הערה: הרטבת בעדינות את העור עם גזה ספוגה PBS עשוי למזער תפר המושרה דמעות.</li>
	<li>בעדינות אך ביסודיות לנקות את הגור עם גזה ספוגה PBS וודאו כי לא נשאר בדם או betadine. לגלגל את פד גזה ספוגים, לשפשף בעדינות מעל השלט הפצע כדי לנקות דם או betadine כלשהם. הערה: זה חשוב במיוחד כמו האם ייתכן משמידה את הגורים אם הם מנוקים כראוי.</li>
	<li>להסיר את הכלבלב קונוס האף ומניחים אותו על האזור השחזור הכולל את תחבושות גזה, חשופים צואה ושתן של האם. ברגע הכלבלב מתאושש, החלף את הגור בכלוב ריק עם המצעים של האם. הערה: אין להשתמש מנורת חימום. השימוש של מנורת חימום יכול לגרום את neonate להתחמם יתר על המידה.</li>
	<li>חזור על הפעולות על המספר הרצוי של הגורים. למרות כל הגורים ניתן להשתמש, זה בדרך כלל רצוי להשאיר מספר הגורים לא ניתחתי להחליפו יחד עם הגורים המופעלים.</li>
	<li>החלף כל הגורים בו זמנית מצעים של אמם בכלוב של האם.</li>
</ol>4. שחזור וניתוח
<ol><li>
מעקב על העכברים מדי יום.
	<ol>
<li>בדוק הפצע נותר סגור ולהסיר כל הגורים מתים, אם קיים.</li>
		<li>אם הפצע יפתח, להכין את האזור הכירורגי של האתר ושחזור בעבר המתואר, חזור על צעדים 3.8 ל 3.12.</li>
		<li>להזריק 5 מ"ג/ק"ג של carpofen subcutaneously 24 ו 48 h בעקבות ההליך.</li>
		<li>בצע הגורים 56 ימים או יותר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המתת חסד החיות לאחר הסכום הרצוי של ימים לאחר הניתוח על ידי חשיפה פחמן דו-חמצני (CO2) נקע בצוואר הרחם.<ol>
<li>הכנס עכברים אינדוקציה / המתת חסד קאמרית, הפעל את ה-CO2 עד עכברים מפסיק לנשום.</li>
		<li>ודא המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. לוחץ על הצוואר הגבי של העכבר באמצעות ביטוי-אצבע האגודל, בעזרת היד השנייה, למשוך למטה על הזנב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הסר את כל הכבד en bloc , שוקל אותה.
	<ol>
<li>בזהירות להפריד בין האונה כל ולשקול בנפרד. הערה: להסיר את הכבד על ידי ניתוח זהיר של כלי הסרעפת ואת ולשננו פורטל. הפרד בין האונות אחד מהשני על ידי בזהירות לנתח כל אונה-מצורף proximal שלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את מידת ההתחדשות על ידי השוואה בין המסה של האונה השמאלית הקטוע למסה של הכבד כל. האונה השמאלית שציווית הוא כ-30% כל הכבד.</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2701258/">Liver Regeneration.</a> Science. 276 (80), 60-66 (1997).</li>
<li>Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881(1890).</li>
<li>Higgins, G., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="https://www.scienceopen.com/document?vid=57858414-5eff-4c8d-a028-ccb3fc1c44a6">Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal.</a> Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and+unconventional+cell+division+of+hepatocytes+underlie+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration.</a> Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).</li>
<li>Miyaoka, Y., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+divide+or+not+to+divide%3A+revisiting+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">To divide or not to divide: revisiting liver regeneration.</a> Cell Div. 8, 8(2013).</li>
<li>Tsai, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hepatic+lobular+regeneration+by+central-vein-associated+lineage-restricted+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331, 1078-1080 (2011).</li>
<li>Shyh-Chang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lin28+enhances+tissue+repair+by+reprogramming+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism.</a> Cell. 155, 778-792 (2013).</li>
<li>Yin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+alcohol-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice.</a> Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).</li>
<li>Gao, B., Bataller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+disease%3A+pathogenesis+and+new+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets.</a> Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).</li>
<li>Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+involved+in+the+mechanism+of+early+alcohol-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice.</a> Hepatology. 34, 101-108 (2001).</li>
<li>Coen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+metabonomic+investigation+of+acetaminophen+toxicity+in+the+mouse+using+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy.</a> Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).</li>
<li>Oz, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+antioxidants+protect+against+acetaminophen+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).</li>
<li>Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+proteomics+analysis+of+acetaminophen+toxicity+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver.</a> Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).</li>
<li>Gunawan, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+plays+a+major+role+in+murine+acetaminophen+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity.</a> Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).</li>
<li>Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postulated+carbon+tetrachloride+mode+of+action%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Sci.+Health.+C.+Environ.+Carcinog.+Ecotoxicol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review.</a> J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).</li>
<li>Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+carbon+tetrachloride+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity.</a> Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).</li>
<li>Sell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+plasticity+of+hepatocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells.</a> Hepatology. 33, 738-750 (2001).</li>
<li>Malato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+of+mature+hepatocytes+in+mouse+liver+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration.</a> J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).</li>
<li>Greene, A. K., Puder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+the+mouse%3A+technique+and+perioperative+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management.</a> J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).</li>
<li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Global+Double-Fluorescent+Cre+Reporter+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse.</a> Genesis. 605, 593-605 (2007).</li>
<li>Poley, W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.3758/BF03199187">Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice.</a> Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).</li>
<li>Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+responses+to+infant+vocalizations+and+olfactory+cues+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice.</a> Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים.

פגיעה כבדית חריפה באופן מסורתי נחקרה באמצעות חומר כימי (פרצטמול, אתנול, פחם tetrachloride), או מודלים כירורגי (70% hepatectomy חלקית). התגובה הרגנרציה לאחר 70% hepatectomy חלקי מאפיין לערב היפרטרופיה hepatocyte הכללית, מספר סיבובים של חלוקת התא4,5. לעצירת דימום, עם זאת, מודל זה היא מוגבלת, שכן כלי מרכזי חייב להיות מאתרים עוזב סביבה חריג עבור התחדשות. מחקרים רבים ולכן המועסקים דגמים אחרים פחות פולשני של פגיעה חריפה דרך נזק כימי, עוזב את הארכיטקטורה מגעיל במקום עבו...

כבר חשבה את היכולת להתחדש איבר, או לשחזר צורה ותפקוד, ללכת לאיבוד בעיקר לאורך זמן אבולוציונית. פוטנציאל הרגנרציה של הכבד יונקים בוגרים לאחר פגיעה חריפה כימיים או פיזיים נמצאה לערב גיוס כל hepatocytes הנותרים וכתוצאה מכך גלים של היפרטרופיה כמה סיבובים של חלוקת התא, וכתוצאה מכך אך פונקציונלי איברים שונים מבחינה ארכיטקטונית1,2,3,4,5. לאחרונה, מחקרים החלו לאפיין את התגובה הרגנרציה של איברים יונקים neonatal לפגיעה בתוך השבוע הראשון של החיים-6,-7,-8. מחקרים אלה הראו כי כאשר נפגע במהלך הפיתוח neonatal, איברים יונקים מסוימים להגיב עם התחדשות מורפולוגי במקום לתת פיצוי הצמיחה או פיברוזיס7,8.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חידוש עולמי מבנה ותפקוד מתרחשת במהלך7,התקופה neonatal6,מוקדמת8. פגיעה בכבד הוקמה פרוטוקולים כרוכה פגיעה כימית או מנהלה של אתנול9,10,11, פרצטמול12,13,14,15 , tetrachloride פחמן16,17,18,19, 70% hepatectomy חלקי4,20,21או הסרה של השמאל, אונות החציוני. ניהול כימי מובילה למוות תא hepatocyte, אבל לעתים קרובות משאיר מיקרו-מאקרו-מבנים שלמים. התחדשות מורפולוגיות לא יכול להילמד ברצון בהקשר זה, כפי הארכיטקטורה הכוללת הכבד לא יצורים שנכחדו. Hepatectomy חלקית 70% כרוך מצדו בתפר של כלי מרכזי, אשר יש צורך לעצור את הדימום, אבל משאיר סביבה שאינם הפיזיולוגיות עם הפרעה קבועה של להערכת. יתר על כן, שיטה זו שימש רק על מכרסמים למבוגרים, היישום שלה כדי neonates טכנית קשה מאוד. עם זאת, פיתחנו שיטת עבודה שבו יוסר 20-30% השיא של האונה השמאלית של עכבר P0 היילוד (איור 1A-1B). שיטה זו בניתוח השמרני, פולשנית, לא באופן טכני מאתגר, ומוביל ברוטו אובדן של מורפולוגיה בלי מצדו של להערכת, השארת מקום התחדשות להתרחש. פרוטוקול צעד אחר צעד וכתוצאה מכך, המתוארים להלן, מאפשרת לכל חוקר לביצוע של hepatectomy lobular חלקית על עכברים neonatal ללימוד בתרבית של התחדשות neonatal בשלבים המוקדמים של החיים אחרי לידה. בשיטה זו יש גם יישומים ברורים השוואתי רפואה רגנרטיבית וביולוגיה תאי גזע, זה יכול לשמש בכבד במהלך ובשלבים מאוחרים יותר של החיים.
המחקרים פציעת כבד חריפה הנפוצים ביותר הם נזק בהשפעת כימיקלים, קטיעה הכבד למבוגרים או 70% hepatectomy חלקית. נזק כימי לעתים קרובות כרוך הניהול תוך ורידי, בקרום הבטן או אוראלי של פרצטמול, tetrachloride פחמן או אתנול, מודל פגיעה קלה יחסית, לא פולשנית. כפי שכבר שוחחנו, גורמת נזק כימי מוות של תאים hepatocyte, אבל לעתים קרובות עלים משתית parenchyma מבנים שלמים, ומקשה על טענות על התחדשות מורפולוגיות. נזק כימי לעיתים קרובות מרכזי על כלי הכבד, שהופך אותו טכניקה שימושית ללמוד באתר תא ספציפי פציעה, אבל גם מקשה לחקור, ברמת כל האיבר, אוכלוסיות אחרות זה יכול להיות ממוקם רחוק יותר מכלי, זה ייתכן לתרום התחדשות. למרות מגבלות אלו, נזק כימי נשאר עדיין מודל שימושי ורלוונטי מאוד מבחינה פיזיולוגית פציעה.
למבוגרים 70% hepatectomy חלקית כרוכה הסרת האונות החציוני ושמאלה בעקבות מצדו של להערכת הכבד. מאפיין היטב בתגובה hepatectomy: הכבד הקטוע 14 ימים פוסט 70% hepatectomy חלקית מפתחת ארכיטקטורת בגסות שונה מזו של האונה ניזוק המקורי, כמו hepatocytes של האונות המזונבת וימינה הנותרים עוברים היפרטרופיה, כמה. סיבובים של חלוקת התא4,5. זה מפצה לאיבוד מסת ותפקוד, אך נכשל להתחדש שתי האונות הקטוע, ולכן אינו מהווה תחליף מורפולוגיה ברוטו. כתוצאה מכך, התגובה פציעה hepatectomy חלקי 70% שימושי ללמוד מנגנוני פיצוי צמיחה התחדשות מוגבלת.
כאן, באופן מלא נתאר עבור hepatectomy lobular חלקית neonatal פרוטוקול. ההליך כרוך הבחירה בעלי חיים המתאים, הכנה, הכנה דימומים, ניתוח ושחזור. אופטימיזציה והתאמה של כל אחד מהצעדים הללו ייתכן שתידרש עבור יישומים שונים של הפרוטוקול.
לנו יש בהרחבה לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה פראי סוג C57BL/6J הגורים (ג'אקס 000664), לעומת זאת, במחקר אוכלוסיות תאים שונים ומנגנונים של התחדשות, השתמשנו גם חיות הטרנסגניים שונות לרבות עכברים מחסה Cre שונים, CreERT2 transgenes ו/או טוק-in (ג'אקסAxin2CreERT2 018867, ו Sox9CreERT2 ג'אקס 018829) בשילוב עם כתבים פלורסנט, כגון מערכות הקשת ו- mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. מצאנו אין צורך לשנות מתודולוגיה זו עבור זנים העכבר שונים, כאשר אין הבדלים תוצאות ההישרדות או פוטנציאל הרגנרציה נצפו.
בנוסף לשימוש זנים בעלי חיים שונים, אנחנו גם לבצע hepatectomies lobular חלקית על neonatal עכברים שטופלו מולקולות קטנות, כגון 4-הידרוקסי-טמוקסיפן ו- 5-ethynyl-2 ′-deoxyuridine (אדו). דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ואתנול שימשו ממיסים, כפי נמצא שכי שמן תירס היה מטרה משמעותית של תחלואה. אחרת מצאנו כי הממשל בקרום הבטן של מולקולות קטנות לא השפיע על הישרדות או תוצאות משובי. אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה מותאם לשימוש עם מולקולות קטנות אחרות לחקור היבטים שונים של התחדשות.
העכבר neonatal ניתוחים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, מחייבות מומחיות מיוחדת לטיפול בבעלי חיים, ניתוח מיקרוסקופי. גידול בעלי חיים מומחיות יש צורך להימנע קניבליזם אימהית בעקבות הניתוח, במהלך תקופת ההחלמה מיידית.

<table><tbody><tr><td><חזק>חיות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמא עם המלטה של גורי ילודים ביום 0 (כל זן)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אם פונדקאית והמלטה פונדקאית (אופציונלי)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק><</td><td>חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</ ריאגנטים סטנדרטיים חזקים</td></tr><tr><td>><חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט בופר סרום (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרובידין-יוד או תמיסת</td><td></td><td></td><td></td> חיטוי שווה ערך</tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</ ציוד</td></tr> <tr><td>כירורגי חזק><חזק></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנתח מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"מ מספריים מיקרו קפיץ ישר</td><td>Vannas</td><td>72932-01</td><td></td></tr><tr><td>5SF מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים קלי</td><td>גריינג'ר</td><td>17-050G</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Sunbeam</td><td>000771-810-000</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs</td><td>0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמת מכרסמים</td><td>Kent Scientific</td><td>1205S</td><td></td></tr><tr><td>גזה, 10.16 x 10.16 ס"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</ חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד סטנדרטי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>6-0 תפרי מונוקריל</td><td>Ethicon</td><td>MCP489G</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S35839</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid, רגיל, 110V</td><td>Drummond</td><td>4-000-110</td><td></td></tr><tr><td>מטלר טולדו NewClassic ME מאזנים אנליטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>01-912-402</td><td></td></tr><tr><td>תא אינדוקציה בעלות נמוכה</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>SOMNO-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

hepatectomy lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

התחדשות האיברים מורפולוגי בעקבות איבוד רקמות חריפה נפוצה בקרב בעלי חוליות נמוכים יותר, אבל הוא לעיתים נדירות בחיי כמחנכת יונקים. למבוגרים התחדשות הכבד לאחר 70% hepatectomy חלקית תוצאות היפרטרופיה hepatocyte עם כמה שכפול באונות הנותרים שיקום של פעילות חילוף החומרים, אבל עם אובדן קבוע של אדריכלות ומורפולוגיה של האונה פצועים. כאן, אנו מפרטים שיטה כירורגית חדשה ב neonate זה משאיר סביבה הפיזיולוגיות להצטיינות התחדשות. מודל זה כולל כריתה של האונה השמאלית השיא, משטר ניהול שמרנית עוקבות, חסרה את הצורך מצדו של כלי כבד הגדולות או פגיעה כימית, עוזב סביבה הפיזיולוגיות בו התחדשות עלולה להתרחש. אנו להרחיב את פרוטוקול זה כדי כריתות על ילדותי עכברים (P7-14), שבמהלכו הכבד נפגע המעברים של התחדשות האיברים לצמיחה לפיצוי על ידי היפרטרופיה. פרוטוקול שהוצגו, קצר 30 דקות מספק מסגרת כדי ללמוד על מנגנוני התחדשות שלה ירידה גיל-הקשורים ביונקים, אפיון בשם גזע כבדית או אבות.

איור 1A מפרט כללי ציר זמן של neonatal חלקית lobular hepatectomy (סכמטי של איור 1B), ואת אורך זמן לחכות עד התחדשות נצפית הצפוי. התחדשות עדין של האונה השמאלית יכול להיות שנצפו 7-14 ימים שלאחר ניתוח. התחדשות מלא לעתים קרובות נצפתה לאחר 56 ימים לתגובה. עכברים צריך להראות סימנים של ליקויים הפיזיולוגיות לאחר הניתוח.
עכברים שעברו חלקית hepatectomies lobular הורשו שחזור עבור 2,...

כאן, אנו מציגים שיטה חדשה עבור כריתה חלקית של האונה השמאלית הכבד בעכברים neonatal (יום 0). פרוטוקול חדש זה מתאים ללמוד פציעת כבד חריפה ותגובה פציעה בהגדרת neonatal.

Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לגרום להתחדשות מורפולוגית של הכבד באמצעות כריתת כבד לובולרית חלקית. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה של תאי הגזע והרפואה הרגנרטיבית לגבי התחדשות מורפולוגית של הכבד ותאי גזע ספציפיים לכבד. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא זעיר פולשנית ואינה דורשת עלבונות כימיים או צריבה.לפני שנוגעים בבעלי החיים, יש לשפשף את המצעים מכלוב האם על הכפפות. לאחר מכן העבירו את כל הגורים וכמה מצעים מהכלוב של האם לכלוב ריק על גבי כרית חימום. לאחר מכן, הניחו גור מתחת למיקרוסקופ מנתח.לאחר אישור רמת ההרגעה המתאימה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן, השתמש בפד גזה קטן כדי לחטא את דופן הבטן האחורית של החיה בבטדין. השתמש במספריים ומלקחיים לניתוח מיקרו כדי לבצע חתך באמצע הקלביקולר השמאלי של חצי סנטימטר מיד מתחת לכלוב הצלעות. השתמש במלקחיים כדי להפריד בעדינות את העור.לאחר מכן בצע חתך שני עמוק יותר לתוך חלל הצפק והשתמש בקצה הקהה האחורי של המספריים והמלקחיים המיקרו כדי להפעיל לחץ רוחבי עדין על שני צידי הבטן, ולאלץ את קודקוד האונה השמאלית לצאת מחלל הצפק. כאשר הקודקוד השמאלי של האונה השמאלית נראה לעין, קטעו את כמות הניסוי המתאימה של רקמה מהאונה והניחו את הרקמה בצינור של 1.5 מיליליטר של PBS על קרח. בעזרת חתיכת גזה מגולגלת, החזירו בעדינות את האונה השמאלית לחלל הצפק.הסר את הגזה כאשר הדימום נפסק והרטיב את אתר הניתוח וסביבתו בגזה ספוגה ב- PBS. סגור את אתר הניתוח עם תפרים ותפר רץ. לאחר מכן גלגלו בעדינות אך ביסודיות גזה ספוגה PBS על הגור ואזור הפצע כדי להבטיח שלא יישאר דם או בטאדין.אפשרו לגור להתאושש ליד רפידות גזה החשופות לצואה ולשתן של האם. כאשר כל הגורים עברו כריתת כבד, החזירו את כל החיות והמצעים לכלוב האם. לאחר שקילת האונות, יש לתקן דגימות רקמה ב-2% פרפורמלדהיד למשך שעה בטמפרטורת החדר.בתום הקיבוע מעבירים את הרקמות לתבניות הקפאה בודדות המכילות מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית להקפאה על קרח יבש. ורכשו חלקים של 7-10 מיקרומטר מכל אונה באמצעות כל קריוסטט סטנדרטי. בדוק את הגורים מדי יום במשך 56 ימים לפחות כדי לוודא שהפצעים שלהם נשארים סגורים ולהזריק משככי כאבים 24 ו-48 שעות לאחר הניתוח.בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, קצרו ושקלו את הכבד מכל גור בבלוק. לאחר מכן הפרד בזהירות כל אונה בודדת בחיבור הפרוקסימלי שלה והשווה את מסת האונה השמאלית הקטועה למסה של הכבד כולו כדי לקבוע את מידת ההתחדשות בכל אונה. ניתן להבחין בהתחדשות עדינה של האונה השמאלית 7-14 ימים לאחר הניתוח והתחדשות מלאה נצפית לעתים קרובות לאחר 56 ימים.ללא הבדל משמעותי באזורי הפטוציטים בכבד המחודש שהתגלה בניתוח היסטולוגי. יתר על כן, הזרקות עכברים יילודים עם EdU מצביעות על עלייה משמעותית במספר התאים המתרבים באונה השמאלית המתחדשת הפגועה בהשוואה לבקרות שלא נפגעו, מה שמרמז על כך שריבוי תאים תורם להתחדשות האונה השמאלית בילודים. עם זאת, כריתת הכבד בעכברים צעירים ביום 14 לאחר הלידה גורמת לירידה בהתחדשות באונה השמאלית עם פיצוי מוגבר מהאונות הלא פגועות.מצביע על כך שעד 14 יום תגובת הפציעה לכריתה חריפה עוברת מהתחדשות ספציפית לאונה לפיצוי גלובלי. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות זהירים ככל האפשר כדי לא לגרום ללחץ נוסף לאם או לגורים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הפטקומיות סדרתיות או פגיעות כבד כרוניות כדי להעריך עוד יותר את פוטנציאל ההתחדשות של הכבד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע לחקור את התחדשות הכבד בעכבר היילוד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשלים כריתה מבוקרת ספציפית לאונה של כבד העכבר היילוד.אל תשכח שעבודה עם איזופלורן מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו מסכת פנים וכפפות בעת ביצוע הליך זה.

partial-lobular-hepatectomy-surgical-model-for-morphologic-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שכיחות גבוהה של הישנות גידול לאחר כריתה של גרורות בכבד נותרה בעיה לא פתורה. מודל העכבר המאויר עשוי להיות שימושי כדי לחקור את הסיבות להישנות כזו. הוא משלב לראשונה מודל כריתת כבד עם הזרקת תאי גידול תוך כבדיים.

השפעת הכריתה כבדה על צמיחת גידול intrahepatic

גרימת היפרטרופיה הכבד מהירה באמצעות שיוך מחיצה הכבד, וריד שער הכבד מצדו hepatectomy בשלבים (ALPPS) הוצע עבור כריתה של גידולים בכבד resectable גבוליים. מודל זה עשוי להבהיר המנגנונים המעורבים היפרטרופיה מהיר ומאפשר בדיקות סמים לקדם או לחסום את ההאצה של התחדשות.

עכברוש מודל של שיוך מחיצה בכבד, וריד שער הכבד מצדו לניתוח בשלבים Hepatectomy (ALPPS)

תארנו פרוטוקול לביצוע חלקי hepatectomy (PHx), השתלת תא באמצעות הטחול ב במנוד ראש. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) עכברים. ב פרוטוקול זה, חתך לחשוף ולאחר נכרות האונה השמאלית של הכבד, ואחריו עוד חתך השתלת intrasplenic של תאים.

השתלת intrasplenic של Hepatocytes לאחר Hepatectomy חלקית ב במנוד ראש. SCID עכברים

אנו להקים טכניקה כירורגית חדשניים עבור מודל זלוף יחיד בכבד באונה ויוו בשנת החולדה כתנאי נוספת ללמוד ויוו הכבד חלקית הנדסה בעתיד.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

הפטוציטים עמוסי שומנים טבועים בהתחדשות הכבד, אך בדרך כלל הולכים לאיבוד עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאים אופטימלי השומר על הפטוציטים סטאטוטיים, ומניב אוכלוסיות מייצגות של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

מחקרים רבים הוכיחו את היתרונות של כריתה אנטומית. עם זאת, השאלה אם כריתה אנטומית יכולה להגדיל את שיעורי כריתת R0 נותרה שנויה במחלוקת. כתוצאה מכך, המחקר הנוכחי מתאר הליך חדשני המערב את תפיסת en bloc בשילוב עם כריתה אנטומית בכריתת כבד לפרוסקופית, אשר יכולה להפחית הישנות לאחר הניתוח וגרורות.

יישום תפיסת הגוש בשילוב כריתה אנטומית בכריתת כבד לפרוסקופית

קישור מחיצת כבד וקשירת ורידים פורטלית לכריתת כבד בשלבים (ALPPS) הוכח כגורם להתחדשות כבד יוצאת דופן לאחר מספר שבועות לאחר ניתוח בשלב הראשון. מודלים של בעלי חיים שעברו ALPPS פותחו כדי לחקור יכולת התחדשות פוטנציאלית של הכבד ולהשיג תוצאות קליניות חיוביות.

מודל עכברי של מחיצת הכבד המשויכת וקשירת ורידים פורטלית להליך כריתת כבד בשלבים בעזרת מיקרוסקופ

אורגנואידים הנוצרים מגידולי חולים מוזרקים אורתוטופית לכבד העכבר. כריתה של רקמת כבד לא גידולית מובילה לסביבה רגנרטיבית ברקמת הכבד בה נמצא הגידול.

מודל קסנוגרפט אורגנואיד שמקורו בחולי סרטן הכבד כדי לחקור את ההשפעה של התחדשות הכבד על צמיחת הגידול

מודל העכבר של כריתת כבד חלקית 2/3 (66%) מתואר היטב בספרות, אך לעתים רחוקות נעשה שימוש בכריתת כבד ממושכת יותר המחקה תסמונת קטנה לגודל לאחר השתלת כבד. אנו מתארים הליך מורחב של 78% כריתת כבד במודל עכבר שמביא לכ-50% קטלניות לאחר הניתוח בעכברים בריאים.

כריתת כבד מורחבת של 78% במודל כירורגי עכבר

למדו שיטת הפטקטומיה לובולרית חלקית להתחדשות הכבד בעכברים נאונטליים. טכניקה מינימלית פולשנית זו מאפשרת חקר תאי גזע ספציפיים לכבד ותהליכי התחדשות מורפולוגיים ללא שימוש בחומרים כימיים.

Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

גלה סרטונים נוספים