בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין
9 ביוני 2018
מחקרים אובדן-של-הפונקציה המקובלת של גנים באמצעות ההסתרה חיות לעתים קרובות היו יקרים ולגזול. מבוסס-אלקטרופורציה בתיווך CRISPR סומאטית מוטגנזה מכוונת הוא כלי רב עוצמה כדי להבין ג'ין פונקציות בתוך vivo. כאן, אנחנו מדווחים על שיטה לנתח נוקאאוט פנוטיפים מתרבים תאים של הצרבלום.
המטרה הכוללת של גישת העברת גנים in vivo מבוססת אלקטרופורציה זו היא להעריך את תפקידיהם של גנים מעניינים בהתמיינות של תאי גרגיר מוח קטן באמצעות ניתוחי אובדן תפקוד בתיווך CRISPR. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח ההתפתחותיים ובנוירו-אונקולוגיות, כגון זיהוי המולקולות החשובות להתפתחות תקינה של המוח הקטן ולהיווצרות גידולי מוח. ההליך של אלקטרופורציה תוך רחמית יודגם על ידי ד"ר לנה הרבסט, פוסט-דוקטורנטית ממעבדתו של פרופסור פיטר ליכטר, ולאחר מכן תבוצע האימונוהיסטוכימיה הבאה על ידי ד"ר ווייג'ון פנג, פוסט-דוקטורנט ממעבדתו של ד"ר הייקון די.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לנסות להפיל באופן מעשי גנים מעניינים בתאי המוח הקטן, באמצעות טכנולוגיות CRISPR-cas9, במקום ליצור את השילוב של חיות נוק-אאוט. למרות ששיטה זו יכולה לתת תובנה לגבי תפקודי גנים במהלך התפתחות מוחית תקינה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון התפתחות של אזורי מוח פיזיים אחרים ומודלים של גידולי מוח. התחל בהעמסת נימי זכוכית בורוסיליקט לתוך מושך מיקרופיפטה ומשיכה ליצירת קצה עדין.
סמן את קצה הנימים בדיו שחור להדמיה טובה יותר במהלך ההזרקה, וצייר קנה מידה על הזכוכית. בעבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בסרגל ובפינצטה חדה כדי לקצץ את הקצה לאורך של כשישה מילימטרים וליצור קצה משופע חד צדדי. סנן תמיסת מלאי ירוק מהירה של 1% דרך מסנן נקודת אפס של 22 מיקרון כדי להסיר חלקיקי צבע מהתמיסה.
מערבבים את פלסמידי ה-RNA היחידים בחלקים שווים עם הפלסמיד המדווח על לוציפראז לריכוז סופי של לפחות מיקרוגרם אחד למיליליטר עבור כל פלסמיד. צבעו את תמיסת הפלסמיד בירוק מהיר בריכוז סופי של 0.5% לאחר הרדמת עכבר CD-1 בהריון עם איזופלורן, הניחו את העכבר על גבו על כרית חימום והניחו משכך כאבים. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח.
תקן את העדשה בעזרת סרט ועיקר את הבטן בעזרת חומר חיטוי. מכסים את העכבר בגזה ומשאירים רק את אזור הניתוח חשוף. לאחר ביצוע חתך בעור באורך של כשני סנטימטרים, אתר את הלינאה אלבה והשתמש במספריים עם קצה קהה כדי לבצע חתך שני מעט קטן יותר דרך הצפק.
הרטיבו את חלל הבטן הפתוח עם PBS סטרילי שחומם מראש. לאחר מכן, השתמש במלקחיים טבעתיים כדי לחלץ בזהירות את קרני הרחם מחלל הבטן. אחוז בדופן הרחם ברווח שבין שקי החלמון של שני עוברים שכנים ומשוך בעדינות.
הימנע מכל לחץ על העובר בזמן משיכתו דרך החתך. לאחר חילוץ קרני הרחם, יש לשאוב כ-10 עד 15 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד צבעונית עם נימי הזכוכית המוכנים. הימנע מבועות אוויר במהלך תהליך זה.
החזיקו בעדינות את העובר בעזרת מלקחיים טבעתיים ואתרו את אזור הצוואר. חודרים לאט למוח האחורי הגבי עם קצה נימי הזכוכית ועוברים לחדר הרביעי. הזרקו כמיקרוליטר אחד מתערובת הפלסמיד.
ודא שה-DNA הצבוע לא דלף מהמוח, ונראה כמבנה בצורת יהלום. כאן חשוב ביותר למלא את כל אזור החדר הרביעי בתמיסת פלסמיד, כדי להעביר DNA גם לחלק הדיסטלי של פרימורדיום המוח הקטן. יחד עם זאת, הקפד לא לגרום לדימום במהלך התהליך הזה.
הניחו פינצטה פלטינה, המצוידות בלוחות אלקטרודות בקוטר חמישה מילימטר לרוחב מעל ראש העובר, כאשר הקוטב השלילי מכסה את האוזן, והקוטב החיובי ממוקם בפרימורדיום המוח הקטן מעל דופן הרחם, והפעל פולסים מרובעים חשמליים. לאחר שכל העוברים עברו אלקטרופורציה, הנח בזהירות את קרני הרחם בחזרה לחלל הבטן, ומלא ב-PBS סטרילי. תן לקרני הרחם להחליק למצב טבעי.
כבה את ההרדמה והנח את בטן החיה כלפי מטה בכלוב חדש כדי להתאושש. לפני ההקפאה, יש לתקן את המוח הקטן למשך הלילה בחמישה מיליליטר של 4% PFA ב-PBS למוח, בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את המוח הקטן הקבוע לעשרה מיליליטר של 30% סוכרוז ב-PBS למוח, ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, לאחר שהרקמה שקעה לתחתית הצינור, הוציאו את המוח מהסוכרוז, וספגו את תמיסת הסוכרוז שנותרה עם פיסת נייר סינון תאית. לאחר מכן, טבלו כל מוח קטן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית בתבנית פלסטיק חד פעמית, והקפיאו על קרח יבש. חותכים את הגוש הקריוגני לחלקים בעובי 10 מיקרון, בעזרת קריוסטט, ושומרים את החלקים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
כאשר מוכנים להמשיך לצביעה חיסונית, יבשו תחילה את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם ב-PBS. הקיפו את החלקים בעט חוסם נוזלים ודגרו את החלקים בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. הוסיפו נוגדנים ראשוניים כנגד המולקולות המעניינות בתמיסה החוסמת, ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
שטפו את השקופיות עם 0.1% טריטון המכיל PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן הוסיפו נוגדן משני מצומד פלואורופור מדולל בתמיסה חוסמת המכילה DAPI, ודגרו על החלקים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את השקופיות ב-PBS-T שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם, ואז הרכיבו את המגלשות ושמרו על ארבע מעלות צלזיוס עד להדמיה.
תאי hek293T המבטאים ביציבות סטרפטוקוקוס פיוגנס cas9 הועברו עם sgRNA המבטא ומכוון לפלסמידים. ביטוי GFP בתאים חיים נוטר באמצעות הדמיית תאים פלואורסצנטיים 48 שעות לאחר הטרנספקציה. תמונה זו מציגה רצף sgRNA מושפע המבוסס על ביטוי GFP.
תמונה זו מציגה חוסר ביטוי GFP הנובע מרצף sgRNA לא יעיל. תמונות אלה מראות צביעה חיסונית של GFP, Ki67 ו-p27 במוח הקטן מעכבר p7-rosa26-LSL-cas9 עם קלטת עצירה פלוקסית ורצפי cas9 ו-EGFP ביסיסטרוניק במורד הזרם, שהיה נתון לאלקטרופורציה ב-E13.5 עם פלסמיד Cre המבטא sgRNA בקרה. הקטע מוכתם נגדית ב-DAPI.
שימו לב לתאים המבטאים GFP בשכבת תאי הגרגיר החיצונית המסומנת על ידי Ki67. לאחר שליטה, ניתן לבצע ניתוח זה תוך פחות מ-30 דקות לכל עכבר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בעובר בזהירות רבה, להשתמש תמיד בנימים חדים, ולמקם את האלקטרודות בזווית המדויקת כדי להבטיח את העברת הפולסים החשמליים לגג החדר הרביעי.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי הרפואה לחקור את הגורמים הסיבתיים להפרעות נוירולוגיות, כולל גידולי המוח במוח הקטן של העכבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למוטגנזה סומטית מתווכת CRISPR המבוססת על אלקטרופורציה, לצורך ניתוח תפקודי גנים בתאי גרנולה של המוח הקטן. גישה זו מאפשרת הערכה יעילה של תפקידי גנים בהתפתחות תקינה של המוח הקטן ובהיווצרות גידולי מוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ניתוח תפקוד גנים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מחקרי נוק-אאוט (knockout) קונבנציונליים הם לרוב יקרים וגוזלים זמן רב.
- טכנולוגיית CRISPR מאפשרת עריכה גנטית ממוקדת.
- המוחון חיוני לבקרה מוטורית ולפונקציות קוגניטיביות.
- הבנת תפקידי הגנים יכולה להשיר אור על תהליכים התפתחותיים ופתולוגיים.
מטרת המחקר
- להערכת תפקודי גנים באבחנה של תאי גרנולה בדגיון.
- לזיהוי מולקולות החשובות להתפתחות הדגיון.
- למידול היווצרות גידולי מוח באמצעות טכניקות של נטרול גנים (gene knockout).
שיטות שהשתמשו בהן
- אלקטרופורציה תוך-רחמית להעברת גנים.
- טכנולוגיית CRISPR-Cas9 להשבתה גנטית (gene knockout).
- אימונוהיסטוכימיה לניתוח שינויים תאיים.
- שיתוף פעולה בין מספר מעבדות מחקר.
תוצאות עיקריות
- הוכחת היתכנות של השבתה גנטית (gene knockout) בתאי דגימרה (cerebellar cells).
- אספקת תובנות לגבי תפקודי גנים במהלך התפתחות הדגימרה.
- הצגת יישומים פוטנציאליים באזורי מוח אחרים ובמידול גידולים.
- הדגשת היתרונות של שיטה זו על פני מודלי השבתה מסורתיים.
מסקנות
- שיטה זו מציעה גישה מהירה ללימוד תפקודי גנים in vivo.
- היא יכולה לקדם משמעותית את המחקר במדעי העצבים ההתפתחותיים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב להפרעות נוירולוגיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
מוטגנזה סומטית בתיווך CRISPR בתאי גרנול של המוחדבאר (cerebellar granule cells) באמצעות אלקטרופורציה בעובר (in utero electroporation) מאפשרת בחינה פונקציונלית מהירה וחסכונית של גנים רלוונטיים למחלות במחקרי נוירו-התפתחות ונוירו-אונקולוגיה. גישה זו עוקפת את מגבלות הזמן והמשאבים של מודלים של קו נבט (germline models), ובכך תומכת בתיקוף מוקדם יותר של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליך הגילוי. הפנוטיפיקה הכמותית ומודלי הכימרה של השיטה מחזקים את הביטחון החזוי לצורך תעדוף תיקי פיתוח והמשכיות תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח ישיר של אובדן תפקוד (loss-of-function) עבור גנים מועמדים המעורבים במומיות וגידולים במוח.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת תפקוד הגנים באוכלוסיות של תאי עצב הרלוונטיים למחלה.
- מקל על בדיקה מהירה של היפותזות ללא הצורך ביצירת מודל knockout מלא של קו הנבט (germline).
- מספק תיקוף תפקודי לממצאים גנטיים שהתקבלו מרצף של רקמות המופקות מחולים.
סקר ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות רקמת מוח כימריות שעברו תיקוף לצורך סריקה פנוטיפית ואנליזה כמותית בשלבים הבאים.
- מספק אוכלוסיות תאים בעלות סימון GFP הניתנות לשחזור, עבור תהליכי עבודה סטנדרטיים של דימות ואימונוהיסטוכימיה.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של מספר מבני sgRNA לבדיקת יעילות פגיעה גנטית.
- תומך בהשוואה חסונה בין תנאי נוקאאוט גנטי לתנאי ביקורת in situ.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מידול מוטציות סומטיות רלוונטיות למחלה לצורך גילוי ביו-סמנים תרגומיים.
- שומר על רצף מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני בהקשרי נוירו-התפתחותיים וגידוליים.
- מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית מוקדמת של מטרות מועמדות.
שילוב בקו עיבוד ובזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח מודלים פרה-קליניים, ומגשרת בין זיהוי מטרות גנטיות לבין תיקוף פונקציונלי in vivo.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערת האפס ובבירור מסלולים עבור גנים מועמדים להתפתחות עצבית.
- סריקה: מספקת פלטים פנוטיפיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של השפעות נוק-אאוט (knockout) של גנים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ומדדים מבוססי GFP.
- מחקר תרגומי: מסייעת במידול מוטציות סומטיות הרלוונטיות להפרעות ולגידולים במוח האדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך בירור מהיר של תפקודי גנים במגוון מטרות עצביות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ומפחית עמימות מכניסטית במסלולים נוירוביולוגיים.
- ערך תפעולי: מייעל את יצירת המודלים, משפר את השחזוריות ותומך במחקרים ניתנים להרחבה של תפקודי גנים.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים ביולוגית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק מידע לתעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות בנושאי התפתחות נוירולוגית ונוירו-אונקולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של אלקטרופורציה תוך-רחמית (in utero electroporation) ועריכת גנים באמצעות CRISPR-Cas9.
- מחייב גישה לתשתיות ייעודיות לניתוח, דימוי וביולוגיה מולקולרית.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדית בין צוותים עבור פרוטוקולים של עיצוב פלסמידים, הובלה ואנליזה פנוטיפית.
- התאמה לאזורי מוח אחרים או לסוגי תאים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות מעשיות כוללות דרישות למיומנות ניתוחית ושונות פוטנציאלית ביעילות האלקטרופורציה.
