בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

המטרה הכוללת של גישת העברת גנים in vivo מבוססת אלקטרופורציה זו היא להעריך את תפקידיהם של גנים מעניינים בהתמיינות של תאי גרגיר מוח קטן באמצעות ניתוחי אובדן תפקוד בתיווך CRISPR. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח ההתפתחותיים ובנוירו-אונקולוגיות, כגון זיהוי המולקולות החשובות להתפתחות תקינה של המוח הקטן ולהיווצרות גידולי מוח. ההליך של אלקטרופורציה תוך רחמית יודגם על ידי ד"ר לנה הרבסט, פוסט-דוקטורנטית ממעבדתו של פרופסור פיטר ליכטר, ולאחר מכן תבוצע האימונוהיסטוכימיה הבאה על ידי ד"ר ווייג'ון פנג, פוסט-דוקטורנט ממעבדתו של ד"ר הייקון די.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לנסות להפיל באופן מעשי גנים מעניינים בתאי המוח הקטן, באמצעות טכנולוגיות CRISPR-cas9, במקום ליצור את השילוב של חיות נוק-אאוט. למרות ששיטה זו יכולה לתת תובנה לגבי תפקודי גנים במהלך התפתחות מוחית תקינה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון התפתחות של אזורי מוח פיזיים אחרים ומודלים של גידולי מוח. התחל בהעמסת נימי זכוכית בורוסיליקט לתוך מושך מיקרופיפטה ומשיכה ליצירת קצה עדין.

סמן את קצה הנימים בדיו שחור להדמיה טובה יותר במהלך ההזרקה, וצייר קנה מידה על הזכוכית. בעבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בסרגל ובפינצטה חדה כדי לקצץ את הקצה לאורך של כשישה מילימטרים וליצור קצה משופע חד צדדי. סנן תמיסת מלאי ירוק מהירה של 1% דרך מסנן נקודת אפס של 22 מיקרון כדי להסיר חלקיקי צבע מהתמיסה.

מערבבים את פלסמידי ה-RNA היחידים בחלקים שווים עם הפלסמיד המדווח על לוציפראז לריכוז סופי של לפחות מיקרוגרם אחד למיליליטר עבור כל פלסמיד. צבעו את תמיסת הפלסמיד בירוק מהיר בריכוז סופי של 0.5% לאחר הרדמת עכבר CD-1 בהריון עם איזופלורן, הניחו את העכבר על גבו על כרית חימום והניחו משכך כאבים. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח.

תקן את העדשה בעזרת סרט ועיקר את הבטן בעזרת חומר חיטוי. מכסים את העכבר בגזה ומשאירים רק את אזור הניתוח חשוף. לאחר ביצוע חתך בעור באורך של כשני סנטימטרים, אתר את הלינאה אלבה והשתמש במספריים עם קצה קהה כדי לבצע חתך שני מעט קטן יותר דרך הצפק.

הרטיבו את חלל הבטן הפתוח עם PBS סטרילי שחומם מראש. לאחר מכן, השתמש במלקחיים טבעתיים כדי לחלץ בזהירות את קרני הרחם מחלל הבטן. אחוז בדופן הרחם ברווח שבין שקי החלמון של שני עוברים שכנים ומשוך בעדינות.

הימנע מכל לחץ על העובר בזמן משיכתו דרך החתך. לאחר חילוץ קרני הרחם, יש לשאוב כ-10 עד 15 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד צבעונית עם נימי הזכוכית המוכנים. הימנע מבועות אוויר במהלך תהליך זה.

החזיקו בעדינות את העובר בעזרת מלקחיים טבעתיים ואתרו את אזור הצוואר. חודרים לאט למוח האחורי הגבי עם קצה נימי הזכוכית ועוברים לחדר הרביעי. הזרקו כמיקרוליטר אחד מתערובת הפלסמיד.

ודא שה-DNA הצבוע לא דלף מהמוח, ונראה כמבנה בצורת יהלום. כאן חשוב ביותר למלא את כל אזור החדר הרביעי בתמיסת פלסמיד, כדי להעביר DNA גם לחלק הדיסטלי של פרימורדיום המוח הקטן. יחד עם זאת, הקפד לא לגרום לדימום במהלך התהליך הזה.

הניחו פינצטה פלטינה, המצוידות בלוחות אלקטרודות בקוטר חמישה מילימטר לרוחב מעל ראש העובר, כאשר הקוטב השלילי מכסה את האוזן, והקוטב החיובי ממוקם בפרימורדיום המוח הקטן מעל דופן הרחם, והפעל פולסים מרובעים חשמליים. לאחר שכל העוברים עברו אלקטרופורציה, הנח בזהירות את קרני הרחם בחזרה לחלל הבטן, ומלא ב-PBS סטרילי. תן לקרני הרחם להחליק למצב טבעי.

כבה את ההרדמה והנח את בטן החיה כלפי מטה בכלוב חדש כדי להתאושש. לפני ההקפאה, יש לתקן את המוח הקטן למשך הלילה בחמישה מיליליטר של 4% PFA ב-PBS למוח, בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את המוח הקטן הקבוע לעשרה מיליליטר של 30% סוכרוז ב-PBS למוח, ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, לאחר שהרקמה שקעה לתחתית הצינור, הוציאו את המוח מהסוכרוז, וספגו את תמיסת הסוכרוז שנותרה עם פיסת נייר סינון תאית. לאחר מכן, טבלו כל מוח קטן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית בתבנית פלסטיק חד פעמית, והקפיאו על קרח יבש. חותכים את הגוש הקריוגני לחלקים בעובי 10 מיקרון, בעזרת קריוסטט, ושומרים את החלקים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

כאשר מוכנים להמשיך לצביעה חיסונית, יבשו תחילה את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם ב-PBS. הקיפו את החלקים בעט חוסם נוזלים ודגרו את החלקים בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. הוסיפו נוגדנים ראשוניים כנגד המולקולות המעניינות בתמיסה החוסמת, ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

שטפו את השקופיות עם 0.1% טריטון המכיל PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן הוסיפו נוגדן משני מצומד פלואורופור מדולל בתמיסה חוסמת המכילה DAPI, ודגרו על החלקים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את השקופיות ב-PBS-T שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם, ואז הרכיבו את המגלשות ושמרו על ארבע מעלות צלזיוס עד להדמיה.

תאי hek293T המבטאים ביציבות סטרפטוקוקוס פיוגנס cas9 הועברו עם sgRNA המבטא ומכוון לפלסמידים. ביטוי GFP בתאים חיים נוטר באמצעות הדמיית תאים פלואורסצנטיים 48 שעות לאחר הטרנספקציה. תמונה זו מציגה רצף sgRNA מושפע המבוסס על ביטוי GFP.

תמונה זו מציגה חוסר ביטוי GFP הנובע מרצף sgRNA לא יעיל. תמונות אלה מראות צביעה חיסונית של GFP, Ki67 ו-p27 במוח הקטן מעכבר p7-rosa26-LSL-cas9 עם קלטת עצירה פלוקסית ורצפי cas9 ו-EGFP ביסיסטרוניק במורד הזרם, שהיה נתון לאלקטרופורציה ב-E13.5 עם פלסמיד Cre המבטא sgRNA בקרה. הקטע מוכתם נגדית ב-DAPI.

שימו לב לתאים המבטאים GFP בשכבת תאי הגרגיר החיצונית המסומנת על ידי Ki67. לאחר שליטה, ניתן לבצע ניתוח זה תוך פחות מ-30 דקות לכל עכבר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בעובר בזהירות רבה, להשתמש תמיד בנימים חדים, ולמקם את האלקטרודות בזווית המדויקת כדי להבטיח את העברת הפולסים החשמליים לגג החדר הרביעי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי הרפואה לחקור את הגורמים הסיבתיים להפרעות נוירולוגיות, כולל גידולי המוח במוח הקטן של העכבר.