Name: גל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: למד את שיטת Gel-seq להכנת ספריות רצף DNA ו-RNA בו-זמנית מאוכלוסיות קטנות של תאים ללא פיצול הדגימה. שיטה זו מאפשרת חקר הקשר בין וריאציות מבניות ב-DNA לביטוי גנים בעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון עבור עבודה זו היה בתנאי על-ידי באוניברסיטת סן דייגו, הלאומית למדע קרן בוגר מחקר תכנית העמיתים, NIH להעניק R01-HG007836, ועל ידי קוריאנית משרד המדע, ICT ותכנון העתיד.
גירסאות קודמות של כמה דמויות פורסמו לראשונה ב- "התקליט הזה, ג ד. et al. ג'ל-seq: הגנום כולו, רצף transcriptome על ידי סימולטני קלט נמוך-DNA ו- RNA ספריית הכנה באמצעות מחסומים הידרוג חדיר למחצה. מעבדה על שבב 17, מוריה ברטל-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " מעבדה על שבב וההתנהגותיים שימוש חוזר של דמויות בפרסום זה.

<ol><li>Mawy, T. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nmeth/journal/v11/n1/full/nmeth.2771.html">Single-cell sequencing.</a> Nat Methods. 11 (1), 18(2014).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2013-14-4-r31">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14 (4), 31(2013).</li>
<li>Ramsköld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Hoople, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-seq%3A+whole-genome+and+transcriptome+sequencing+by+simultaneous+low-input+DNA+and+RNA+library+preparation+using+semi-permeable+hydrogel+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.</a> Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome+and+transcriptome+sequencing+of+the+same+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell.</a> Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).</li>
<li>Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+large+RNA+molecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing large RNA molecules in solution.</a> RNA. 18 (2), 284-299 (2012).</li>
<li>SDS-PAGE Gel. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/7/pdb.rec087908.full?text_only=true">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2015 (7), 087908(2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), at http://science.sciencemag.org/content/352/6293/1586 (2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd</a> (2017).</li>
<li>Vitak, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+thousands+of+single-cell+genomes+with+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing.</a> Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).</li>
<li>A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040 Rev B. Bio Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf</a> (2017).</li>
<li>Illumina. <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">Nextera ® XT DNA Library Preparation Kit</a>. , (2017).</li>
<li>Takara Bio USA Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SMART-Seq+v4+Ultra+Low+Input+RNA+Kit+for+Sequencing+User+Manual%22">SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual</a>. , (2016).</li>
<li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).</li>
</ol>

KZ הינו מייסד ומנכ ל מדעי יועץ של Singlera גנומיקה inc.

ישנם מספר שלבים קריטיים המשויך הזיוף התקן ג'ל-seq, כמו גם את הפרוטוקול עצמו. במהלך פבריקציה נוספת, אנו ממליצים החל עוביים השכבה שנקבעו עבור אזורים שונים של הג'ל. בילינו זמן משמעותי בדיקת אפשרויות ייצור שונה ומייצרת הפרוטוקול המתואר כאן ההתקנים הטוב ביותר עבור הקלטות המפורטים בטבלה של חומרים, ריאגנטים. אם חוקרים משתמשים מערכת חלופית קלטת, הם עשויים למצוא אותו צורך לעדן את אמצעי האחסון שמשמש בעת יצירת המכשירים. האתגר העיקרי ב פבריקציה נוספת היא שאם האזור ג'ל בצפיפות גבוהה גדול מדי זה יכול delaminate מקצות ...

הדור הבא רצף (הגדרות) יש לו השפעה עמוקה על הדרך מתנהל מחקר גנטיקה. כאשר חוקרים התמקדו פעם רצף הגנום של זן שלם, עכשיו זה אפשרי את רצף הגנום של גידול יחיד או אפילו תא בודד בניסוי אחד. 1 הגדרות גם הפכה חסכוניות כדי רצף התרשימים RNA נמצא בתוך תא, אוסף של נתונים המכונה של transcriptome. היכולת להגביר את רצף ה-DNA או RNA מדגימות התחלה קטנה הושגה רק בחמש השנים האחרונות. 2 , 3 , 4 . למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים אינם תואמים, חוקרים עליך לבחור אם רצף ה-DNA או RNA דגימה נתון. כאשר מדגם ההתחלתי הוא גדול מספיק, ניתן לפצל אותו לשניים. קשקשים קטנים יותר, עם זאת, אובדן של חומר עקב פיצול דגימות יכולים להשפיע על איכות ספריה ולאחר איגום של דגימות יכול ממוצעים גרסאות מעניינות בין תאים. 5 יתר על כן, החוקרים מעוניינים יותר ויותר בחינת והמדגמים יכולה להתפצל, כגון תאים בודדים או ביופסיות גידול קטן הטרוגנית. 6
כדי לטפל בבעיה זו, שלושה פרוטוקולים לאחרונה פותחו כדי רצף ה-DNA ו- RNA מדגם המוצא זהה: ג'ל-seq7, G &amp; T-seq8ו ד ר-seq9. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור ג'ל-seq, אשר יכול לשמש כדי בו-זמנית ליצור ספריות DNA ו- RNA מתוך כמה כתאי 100 זניח עלות נוספת. ההיבט הרומן של ג'ל-seq היא היכולת להפריד בין DNA ו- RNA המבוסס באופן בלעדי על גודל באמצעות מטריצות הידרוג בעלות נמוכה. החידוש הליבה של פרוטוקול ג'ל-Seq הוא ההפרדה הפיזית של ה-DNA מ- RNA. ההפרדה הזאת מושגת electrophoretically באמצעות שילוב של ממברנות לזיהוי לנצל גודל ההבדלים בין מולקולות אלה. כדי לשים את ההבדלים בגודל בהקשר, שקול כיצד DNA ו- RNA הם צילמו: בעוד דנ א קיים בסולם מיקרון ניתן להציג באמצעות מיקרוסקופים מסורתיים, RNA קיים בסולם ננומטר ולא חייב לדימות תוך שימוש בטכניקות מורכבות כגון אלקטרונים הקפאה מיקרוסקופ. 10
הגישה הפרדת DNA ו- RNA, פרוטוקול זה מוצג באיור1. החלונית השמאלית מציגה DNA ו- RNA חינם צף בפתרון בקרבת קרום. כאשר שדה חשמלי מוחל, כפי שמוצג בלוח הימני, DNA ו- RNA לחוות כוח electrophoretic שגורם העברה דרך הקרום. על-ידי כיוונון המאפיינים ממברנה, יצרנו קרום חדיר למחצה המפריד DNA RNA. מולקולות DNA יידחפו נגד הקרום, אבל להיות מסובכת בקצה בשל גודלם גדולים. מצד שני, מולקולות RNA קטנות, ניתן להגדיר מחדש, לארוג את דרכם דרך הקרום. תהליך זה, המכונה reptation, דומה לאופן בו שנחש עובר דשא. בסופו של דבר אלה מולקולות RNA מופסקים על ידי קרום השני, בצפיפות גבוהה זה קשה מדי עבור פולימרים אפילו קטנה יותר (&gt; 200 זוגות בסיס) להתחמק על דרך. ברגע פיזית מחוזק, DNA ו- RNA יכול להיות התאושש לעבד להפיק מידע על הגנום והן transcriptome. בעוד נוכל להפריד DNA ו- RNA, מצאנו תוצאות טובות יותר מתקבלים אם ה-RNA היא הפוכה עיבד כדי cDNA לפני ההפרדה. היברידים רבים cDNA/RNA יציבים יותר RNA לבד, עדיין יכול לעבור דרך קרום בצפיפות נמוכה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> איור 1 . עקרון ההפעלה ג'ל-seq. העיקרון הבסיסי המשמש להפרדת פיזית של DNA ו- RNA. בשדה חשמלי יישומית, מולקולות RNA קטנות להעביר דרך קרום בצפיפות נמוכה אבל מולקולות DNA גדולות לכוד על פני השטח. איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
מאמר זה מתאר בפירוט בשני הזיוף של המכשיר ג'ל-seq, הפרוטוקול הביולוגי ליצירת לזווג ספריות DNA ו- RNA. סקירה כללית של שניהם מוצג באיור2. המכשיר מפוברק על ידי שכבות 3 צפיפות שונה לזיהוי ג'לים אחד על גבי השני בתהליך דומה ליצירת תקן ג'לים הערימה. 11 הפרוטוקול הביולוגי מתחיל עם תאים 100-1000 הושעו ב- PBS. התאים הם lysed, הרנ א מומר cDNA לפני המכשיר משמש להפריד את הדנ א כלאיים cDNA/RNA. לאחר ההפרדה, התאוששות, גנומית, transcriptomic ספריות מוכנות באמצעות תהליך זה מקרוב כדלקמן פרוטוקול ערכת הכנה הספרייה הגנום כולו. ניתן לקרוא פרטים נוספים על פיתוח, אימות של ג'ל-seq במעבדה על פרסום שבב "ג'ל-seq: הגנום כולו ורצף transcriptome על ידי סימולטני קלט נמוך-DNA ו- RNA ספריית הכנה באמצעות מחסומים הידרוג חדיר למחצה ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> איור 2 . פרוטוקול ג'ל-seq. מבט כולל על הצעדים כדי לפברק את המכשיר ג'ל-seq והפרוטוקול מחוללות לזווג ספריות DNA ו- RNA. חלקים של איור זה שוחזר הפניה למעורר 7, ברשות החברה המלכותית לכימיה. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי ליצור ספריות DNA ו- RNA מתוך תאים בודדים, חוקרים, כדאי שתשקול להשתמש או G &amp; T-seq או ד ר-תת סעיף. G &amp; T-Seq, כמו ג'ל-seq, מסתמך על הפרדה פיזית של רנ א מ- DNA גנומי. גישה זו נסמכת על messenger RNA (mRNA) 3′ polyadenylated זנב כמטרה נפתחים. ה-mRNA נלכד על חרוז מגנטי באמצעות פריימר oligo-dT biotinylated. ברגע mRNA כבר נתפס החרוזים הם שנערך במקום עם מגנט, תגובת שיקוע המכיל את הדנ א הגנומי יכול להיות הוסר, הועבר צינור אחר. בתום ההפרדה הפיזית הזאת, ספריות שונות ניתן להפיק מן ה-mRNA ו DNA. 8 גישה זו פועלת היטב אם הרנ א עניין polyadenylated, אולם אין אפשרות להשתמש ללמוד תעתיקים הלא-polyadenylated, כגון ribosomal RNA, tRNA, או RNA של אאוקריוטים.
ד ר-seq מסתמך על צעד הגברה מראש לאן דנ א והן cDNA נגזר מן ה-RNA הם מוגבר בצינור אותו. המדגם ואז לשתיים, מעובד במקביל להכין ספריות seq DNA ו- RNA. כדי להבחין בין DNA גנומי של cDNA נגזר מן ה-RNA, ד ר-seq מקבלת גישה חישובית. רצפים היכן נמצאים רק exons מדוכאים שהמפתחות בנתונים דנ א גנומי, כמו אלה יכול להיות שמקורם מן ה-DNA או RNA. 9 היתרון בגישה זו הוא כי ה-DNA ו cDNA/RNA צריך להיות פיזית מופרדים זאת על ג'ל-seq ו G &amp; T-תת סעיף. החיסרון, לעומת זאת, היא ד ר-seq דורשת ידע א-פריורי של הגנום, transcriptome (כלומר, exons לעומת אינטרונים), לא יהיה אידיאלי עבור יישומים כגון רצף של גרעינים, שבו תעתיקים רבים עדיין אינם לגמרי משולבים, עדיין להכיל אינטרונים. 12
ההיבט הרומן של ג'ל-seq היא היכולת להפריד בין DNA ו- RNA מאות תאים המבוסס באופן בלעדי על גודל. שיטה זו דורשת שום ידע אפריורי של הגנום או transcriptome, היא חזקה נגד שחבור לא שלם, אינה מוגבלת תעתיקים פולי-adenylated. עבור יישומים שבהם חוקר יכול להתחיל עם תאים לפחות 100, ג'ל-seq מספקת גישה ישירה באמצעות חומרים נרחב זמין וזול.

<table><tbody><tr><td>ריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד מונומר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>אמפור XP חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63880</td><td>המכונה בטקסט חרוזי אימוביליזציה הפיכה בשלב מוצק (SPRI)</td></tr> DNA <tr><td>ג'ל טעינת צבע (6x)</td> <td>ThermoFisher מדעי</td><td>R0611</td><td>המכונה בטקסט כ-6X טוען צבע</td></tr><tr><td>אתיל אלכוהול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR ערכות qRT-PCR מהירות שלב אחד</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>המכונה בטקסט 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenebis(acrylamide)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>ידוע גם בשם bis-acrylamide</td></tr><tr><td>NexteraXT ערכת הכנת ספריית DNA (המכונה בטקסט ערכת הכנת ספרייה)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>כולל: TD (המכונה בטקסט מאגר טרנספוזאז), ATM (המכונה בטקסט טרנספוזאז), NT (המכונה בטקסט כמאגר עצירת טרנספוזאז), ו-NPM (מכונה בטקסט תערובת PCR להכנת ספרייה)</td></tr> <tr><td>מים</td> <td>ללא נוקלאזערכת Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 (המכונה בטקסט ערכת הגברת תעתיק שלם (WTA))</td> <td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>כולל: מאגר ליזה, מעכב RNase, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (המכונה בטקסט פריימר RT), 5X Ultra Low First Strand Buffer (המכונה בטקסט מאגר גדיל ראשון), SMART-Seq v4 אוליגונוקלאוטיד (המכונה בטקסט אוליגונוקלאוטיד מתג תבנית (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (המכונה בטקסט טרנסקריפטאז הפוך), ו-PCR Primer II A (המכונה בטקסט פריימר cDNA PCR)</td></tr><tr><td>הקסמר אקראי עם מתאם WTA&nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime;</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T9281-25 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>DNA רחוק מטהר פני השטח</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&nbsp; &nbsp;</td><td>מכונה בטקסט מוצר להסרת DNA</td></tr><tr><td>מאגר Tris-Borate-EDTA (ריכוז פי 10)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהב (תרכיז פי 10,000 ב-DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>המכונה בטקסט כצבע ג'ל</td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; מחטי מזרק, מד 18</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Z192554</td><td>כל חומרה שווה ערך מקובלת</td></tr><tr><td>אמבטיה אולטרסאונד מסדרת ברנסון CPX</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>Z769363 כל חומרה שווה ערך מקובלת</td></tr> קלטות <tr><td>ג'ל ריקות, מיני, 1.0 מ"מ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>כל חומרה שווה ערך מקובלת</td></tr><tr><td>פלטת סינון רשת - Corning&nbsp; HTS Transwell 96 תומך חדיר היטב - 8.0 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>CLS3374</td><td>המכונה בטקסט צלחת מסנן רשת 8 אום</td></tr><tr><td>PowerPac HC ספק כוח</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>כל חומרה שווה ערך מקובלת</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>כל חומרה שווה ערך מקובלת</td></tr> רכז <tr><td>ואקופוגה</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>כל חומרה שווה ערך מקובלת</td></tr><tr><td>מערכת XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>כל חומרה מקבילה מקובלת</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch בזמן אמת מערכת זיהוי PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp;</td><td>כל חומרה מקבילה מקובלת</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>הופסק, כל חומרה מקבילה מקובלת</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>המכונה בטקסט</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>המכונה בטקסט transilluminator UV transilluminator</td></tr><tr><td>&nbsp; אולטרסאונד&nbsp; אמבט</td><td>ברנסוניק</td><td>1207K35</td><td>כל אמבטיה אולטרסאונד שווה ערך מקובלת.</td></tr></tbody></table>

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף dna ו- rna באמצעות מטריצות הידרוג

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

היכולת להגביר את רצף ה-DNA או RNA מדגימות התחלה קטנה הושגה רק בחמש השנים האחרונות. למרבה הצער, פרוטוקולים סטנדרטיים עבור יצירת גנומית או ספריות transcriptomic אינם תואמים, חוקרים עליך לבחור אם רצף ה-DNA או RNA מדגם מסוים. ג'ל-seq פותר בעיה זו בכך שהוא מאפשר לחוקרים בו-זמנית להתכונן ספריות הן DNA ו- RNA החל מ 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג. עיצבנו ג'ל-seq. כך זה יכול להיות מיושם בקלות על ידי חוקרים אחרים; מעבדות גנטיקה רבים יש כבר את כל הציוד הדרוש כדי לשחזר את ייצור המכשיר ג'ל-seq. פרוטוקול שלנו מעסיקה נפוצות ערכות עבור שניהם הגברה שלם-תעתיק (של WTA), ספריית הכנה, אשר הם גם נוטים להיות מוכר חוקרים כבר שבקיאים גנומית ושוויונית transcriptomic ספריות. הגישה שלנו מאפשר לחוקרים להביא לשאת את הכוח של רצפי DNA ו- RNA על דוגמה אחת ללא פיצול ועם זניח בתוספת מחיר.

ההפרדה הפיזית של מכוניות היברידיות gDNA הרנ"א/cDNA במכשיר ג'ל-seq להיות visualized באמצעות ג'ל פלורסנט הדמיה; תוצאה נציג מוצג באיור3. פאנל A מראה המכשיר ג'ל-seq והתחייה; הצבעים נוספה כדי להבחין בין האזורים השונים ג'ל. לוח ב' מופיע קרוב של ארבעה הפרדות שונות נעשה שימוש עבור אימות. במסלול השלישי, פקד שלילי, מייצג את הרקע ומראה שאין שום autoflourescence של הג'ל על הממשקים. אנו נטען המסלולים הראשון והשני עם ה-DNA סולמות. מסלולים אלה מראים רק להקה כהה. הממשק בין d...

ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור ספריות ריצוף מהדור הבא הן מה-DNA והן מה-RNA של אוכלוסיות קטנות של תאים מבלי לפצל את הדגימה בשום שלב. שיטה זו מספקת לחוקרים גישה חדשה לחקר הווריאציות המבניות של ה-DNA על ביטוי הגנים. כשחשבנו לראשונה על Gel-seq, לא היו פרוטוקולים לריצוף בו-זמנית של ה-DNA וה-RNA מאותה דגימה.למרבה המזל, ישנן כעת שלוש גישות שפורסמו הפותרות בעיה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבל מידע גנומי ותעתיק מאותה קבוצת תאים בעלות נוספת זניחה. Gel-seq פותח במקור עם קלטות זקופות, עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה לעבודה עם כל קלטת אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל.הכן את תערובות המילוי, הצפיפות הגבוהה והמבשר בצפיפות נמוכה בשלושה צינורות. מוסיפים את הריאגנטים בסדר המתואר, ומערבלים את התערובת. אל תוסיף בטרם עת APS או Temed.המתן עד להנחיה. לאחר מכן, הסר כל תמיסת מונומר ג'ל על ידי החדרת מחט דרך המכסה. לאחר מכן חיבור המחט לקו ואקום ביתי, והטבעת המכלול הזה באמבטיה אולטרה קולית.המתן כדקה עד שלא יוצאות עוד בועות מהנוזל. לאחר מכן, לתערובת מבשר המילוי, מוסיפים את ה-Temed ואת ה-APS והמערבולת בקצרה. תוך שלוש דקות, השתמש בפיפטה של מילימטר אחד כדי להוסיף שישה מילימטרים לכל קלטת ג'ל מבלי להישפך.ודא שהנוזל מפולס על ידי הצבת הקלטות זקופות על שולחן ישר. לאחר מכן, מלאו בהדרגה את הקסטות במים מיוננים נטולי גז, והקפידו למזער את ערבוב תערובת הפילמור עם המים. לאחר מכן, הניחו לפולימר להתרפא במשך שעה עד לילה.לאחר שהפולימר נרפא, זרוק את שכבת המים, וממרחק של שישה סנטימטרים השתמש בזרם עדין של אוויר דחוס כדי לייבש את פני הג'ל. לאחר מכן, הוסף Temed ו-APS למבשר הג'ל בצפיפות גבוהה, ומערבולת קצרה. תוך שלוש דקות, העבירו 320 מיקרוליטר לכל קסטה, ומרחו אותה על שכבת ג'ל המילוי על ידי נדנוד הקסטה קדימה ואחורה כמה פעמים.לאחר מכן, מלאו את הקסטות במים נטולי יונים ונטולי גזים, והניחו לפולימר להתרפא במשך כשעה. לאחר הריפוי, יבש את הפולימר כמו קודם. לבסוף, הוסף Temed ו-APS לתערובת מבשר הג'ל בצפיפות נמוכה, ומערבל אותה.לאחר מכן, מלאו במהירות את שארית הקסטות בתערובת זו, והכניסו את מסרקי הג'ל לפני שהיא מתחילה להתרפא. כעת, הוסף את עודף מבשר המילואים מעל המסרק שייספג במהלך הפילמור. לאחר הריפוי, הקסטה מוכנה לשימוש.לאחר המרת ה-RNA ל-cDNA, השתמש בג'ל כדי לשחזר את חלק העניין. ראשית, יש לנקות היטב את תא האלקטרופורזה באמצעות מספר מיליליטר של מוצר להסרת DNA, ומגבון נטול מוך. לאחר מכן, מלאו את החדר ב-XTBE נקי ואפס נקודה 5, והניחו את כל המכשיר בתנור צולב UV של 254 ננומטר, ועיקרו למשך 15 דקות.כעת, הכנס קלטת Gel-seq לתא האלקטרופורזה ונעל אותה במקומה. לאחר מכן, הסר לאט את מסרק הג'ל על ידי משיכה עדינה כלפי מעלה מבלי לקרוע את הג'ל. כעת, טען דגימות באמצעות פיפטה.הכנס את הקצה במלואו לבארות בעת העמסת דגימות כדי למזער את הסיכוי לזיהום בין בארות. הפעל שדה חשמלי של 250 וולט על פני קלטת ה-Gel-seq למשך 30 דקות כדי להפריד את ה-gDNA מהיברידיות ה-cDNA/RNA. לאחר העמסה, הפעלה ואיסוף הג'ל השתמש באזמל כדי לחתוך את הג'ל לשניים ממש מתחת לשכבה בצפיפות גבוהה, ולהשליך את חצי ג'ל המילוי.לאחר מכן, מקלפים בעדינות את הג'ל שנותר מהקסטה תוך שימוש זהיר בכלי גירוד. לאחר אימות ההפרדה באמצעות רופא ג'ל, השתמש בטרנס-אילומינטור כדי לכרות את הרצועות. ה-gDNA צריך להיות ממוקם בתחילת הג'ל בצפיפות נמוכה, וה-cDNA צריך להיות בממשק של אזורי הצפיפות הנמוכה והגבוהה.כעת, השתמשו באזמל כדי לחתוך את אזורי הג'ל המכילים gDNA ו-cDNA. הסר גם את אותם חלקים מנתיב הבקרה השלילי. בעזרת פינצטה קהה, העבירו בעדינות את חלקי הג'ל לצינורות רצועה.אם הג'ל נשבר, מצא והעביר את כל החלקים השבורים לצינור. לאחר מכן, טוחנים כל ג'ל בתנועות סיבוביות, ולוחצים עם קצה פיפטה. לפני הסרת הקצוות, הוסף 40 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ל-gDNA, ו-80 מיקרוליטר לדגימות ה-cDNA.לאחר מכן, הסר בזהירות והשליך את הטיפים. כעת, אבטח את צינורות הרצועה למיקסר מערבולת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ונער אותם במשך שמונה עד 12 שעות. כך הדנ"א יחמוק מהג'ל.לאחר הטלטול, פיפטה את הדגימות לתוך צלחת מסנן רשת של שמונה מיקרון. לאחר מכן, סובב את הצלחת ב -2, 600 גרם למשך חמש דקות כדי לסנן את שברי הג'ל. לאחר מכן, הרם את לוחית מסנן הרשת הרחק מלוחית הדיור והשתמש בפיפטה כדי להעביר את הדגימות נטולות הג'ל מהצלחת לצינורות רצועה חדשים של 200 מיקרוליטר.לכל דגימה המכילה gDNA, הוסיפו מיקרוליטר אחד של פרוטאז, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. לאחר מכן, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן יש להפעיל חימום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.שלב דלדול נוקלאוזום זה הוא קריטי. לאחר מכן, השתמש במחט בגודל 18 כדי לתקוע חור במכסה של כל צינור דגימה. לאחר מכן, השתמש בוואקופוגה כדי להפחית את דגימות ה-gDNA לחמישה מיקרוליטר, ואת דגימות ה-cDNA ל-10 מיקרוליטר.אם הנפח יורד מתחת למטרה, הוסף מים נטולי נוקלאז לפי הצורך. היברידיות gDNA ו-cDNA/RNA הופרדו פיזית באמצעות מכשיר Gel-seq. לבקרה השלילית אין פלואורסצנטיות אוטומטית של הג'ל בממשקים.סולמות ה-DNA מראים רק פס כהה בממשק בין הממברנות בצפיפות נמוכה וגבוהה, מה שחושף כי שברים קטנים יכולים לעבור דרך הג'ל בצפיפות נמוכה. דגימה ביולוגית מ-500 תאי PC3 מציגה את ההפרדה הרצויה של DNA גנומי ו-cDNA/RNA היברידיים. פס כהה בחלק העליון של הממברנה בצפיפות נמוכה הוא DNA גנומי בקנה מידה מגה-בסיסי בעוד שהכלאות cDNA/RNA נערמות בממשק של אזורי הצפיפות הנמוכה והגבוהה.שברי זוגות הבסיסים הקטנים מתחת ל-100 הם מחוץ לתוצרי מטרה שנוצרו מאוליגו-נוקלאוטידים פריימר במהלך שעתוק הפוך ויש לצפות להם. הספריות נוצרו מ-500 תאי PC3 או 750 תאי HeLa. התפלגויות מקטעים מהספריות המותאמות שנוצרו מ-Gel-seq הושוו לדגימות לא תואמות שנוצרו עם פרוטוקולים סטנדרטיים.התפלגות שברי הנוקלאוטידים הייתה דומה בכל אחת מהשיטות. תוצאות הריצוף של ספריית תאי PC3 הושוו לשיטות מסורתיות. הושוו וריאציות של מספר עותקים ברחבי הגנום.מבחינה סטטיסטית, שתי השיטות השיגו תוצאות דומות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספריות ריצוף מהדור הבא מזווגות הן עבור DNA והן עבור RNA מאותה דגימה התחלתית. כמו בכל ניסוי ריצוף קלט נמוך, חובה לזכור לשמור על סביבת עבודה נקייה.כדאי לשים לב היטב לעיקור צינורות וכפפות ניקוי. אפילו עם אמצעי זהירות אלה, ניסויים נכשלים מדי פעם בגלל זיהום. הערה חשובה, הנוכחות והבטיחות של ג'לים פוליאקרילאמיד מקלה על השכיחה שמבשרי הייצור הם נוירוטוקסינים מסוכנים.אתה תמיד צריך לעבוד עם ריאגנטים אלה במכסה אדים ולנקות מיד כל שפיכה. עיצבנו את Gel-seq כך שיהיה קל לחוקרים ליישם במעבדות שלהם, ואנו מקווים שזה יקל על אימוץ מהיר של טכנולוגיה זו.

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

פורמלין-קבוע דגימות פרפין-מוטבע מהווים מקור חשוב של סמנים מולקולריים של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכנה ספריית cDNA מבוסס המעבדה, בתחילה עוצב עם RNA טריים קפואים, באופן מיטבי עבור הניתוח של מיקרו Rna בארכיון של רקמות מאוחסן עד 35 שנים.

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף &gt; הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

רצפי זמן-קריאה מאוד להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים ואפיון של וריאציה מבנית. אנו מתארים שיטה כדי ליצור רצפים ארוכים במיוחד על ידי רצף nanopore מבוססי פלטפורמות. הגישה מאמצת הוצאה DNA ממוטבת ואחריו ההכנות ספריית ששונה כדי להפיק מאות קריאות kilobase עם כיסוי מתון של תאים אנושיים.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

במאמר זה, אנו מציגים ולדון התפתחויות חדשות סינתזה ויישומים של חומצות גרעין מיקרומערכים מפוברק באתרו. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד הפרוטוקולים לסינתזה DNA ניתן להרחיב RNA וכיצד מיקרו מערכים ניתן להשתמש כדי ליצור לאחזור ספריות גרעין של חומצה.

בצפיפות גבוהה DNA ו-RNA מיקרומערכים-פוטוליתוגרפיה סינתזה, היברידיזציה והכנת ספריות גרעין גדול חומצות

צוואר בקבוק במחזור ' עיצוב-לבנות בדיקה ' של הנדסת חיידקים היא המהירות שבה אנחנו יכולים לבצע מסכי פונקציונלי של זנים. אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה לסינון המתח המוחל על מאות אלפי תאים שמרים לכל ניסוי העושה שיטה ברצף RNA מבוסס droplet.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

למד את שיטת Gel-seq להכנת ספריות רצף DNA ו-RNA בו-זמנית מאוכלוסיות קטנות של תאים ללא פיצול הדגימה. שיטה זו מאפשרת חקר הקשר בין וריאציות מבניות ב-DNA לביטוי גנים בעלות נמוכה.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

גלה סרטונים נוספים