ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג
March 26th, 2018
ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור ספריות ריצוף מהדור הבא הן מה-DNA והן מה-RNA של אוכלוסיות קטנות של תאים מבלי לפצל את הדגימה בשום שלב. שיטה זו מספקת לחוקרים גישה חדשה לחקר הווריאציות המבניות של ה-DNA על ביטוי הגנים. כשחשבנו לראשונה על Gel-seq, לא היו פרוטוקולים לריצוף בו-זמנית של ה-DNA וה-RNA מאותה דגימה.
למרבה המזל, ישנן כעת שלוש גישות שפורסמו הפותרות בעיה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבל מידע גנומי ותעתיק מאותה קבוצת תאים בעלות נוספת זניחה. Gel-seq פותח במקור עם קלטות זקופות, עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה לעבודה עם כל קלטת אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל
.הכן את תערובות המילוי, הצפיפות הגבוהה והמבשר בצפיפות נמוכה בשלושה צינורות. מוסיפים את הריאגנטים בסדר המתואר, ומערבלים את התערובת. אל תוסיף בטרם עת APS או Temed.
המתן עד להנחיה. לאחר מכן, הסר כל תמיסת מונומר ג'ל על ידי החדרת מחט דרך המכסה. לאחר מכן חיבור המחט לקו ואקום ביתי, והטבעת המכלול הזה באמבטיה אולטרה קולית.
המתן כדקה עד שלא יוצאות עוד בועות מהנוזל. לאחר מכן, לתערובת מבשר המילוי, מוסיפים את ה-Temed ואת ה-APS והמערבולת בקצרה. תוך שלוש דקות, השתמש בפיפטה של מילימטר אחד כדי להוסיף שישה מילימטרים לכל קלטת ג'ל מבלי להישפך.
ודא שהנוזל מפולס על ידי הצבת הקלטות זקופות על שולחן ישר. לאחר מכן, מלאו בהדרגה את הקסטות במים מיוננים נטולי גז, והקפידו למזער את ערבוב תערובת הפילמור עם המים. לאחר מכן, הניחו לפולימר להתרפא במשך שעה עד לילה.
לאחר שהפולימר נרפא, זרוק את שכבת המים, וממרחק של שישה סנטימטרים השתמש בזרם עדין של אוויר דחוס כדי לייבש את פני הג'ל. לאחר מכן, הוסף Temed ו-APS למבשר הג'ל בצפיפות גבוהה, ומערבולת קצרה. תוך שלוש דקות, העבירו 320 מיקרוליטר לכל קסטה, ומרחו אותה על שכבת ג'ל המילוי על ידי נדנוד הקסטה קדימה ואחורה כמה פעמים.
לאחר מכן, מלאו את הקסטות במים נטולי יונים ונטולי גזים, והניחו לפולימר להתרפא במשך כשעה. לאחר הריפוי, יבש את הפולימר כמו קודם. לבסוף, הוסף Temed ו-APS לתערובת מבשר הג'ל בצפיפות נמוכה, ומערבל אותה.
לאחר מכן, מלאו במהירות את שארית הקסטות בתערובת זו, והכניסו את מסרקי הג'ל לפני שהיא מתחילה להתרפא. כעת, הוסף את עודף מבשר המילואים מעל המסרק שייספג במהלך הפילמור. לאחר הריפוי, הקסטה מוכנה לשימוש.
לאחר המרת ה-RNA ל-cDNA, השתמש בג'ל כדי לשחזר את חלק העניין. ראשית, יש לנקות היטב את תא האלקטרופורזה באמצעות מספר מיליליטר של מוצר להסרת DNA, ומגבון נטול מוך. לאחר מכן, מלאו את החדר ב-XTBE נקי ואפס נקודה 5, והניחו את כל המכשיר בתנור צולב UV של 254 ננומטר, ועיקרו למשך 15 דקות.
כעת, הכנס קלטת Gel-seq לתא האלקטרופורזה ונעל אותה במקומה. לאחר מכן, הסר לאט את מסרק הג'ל על ידי משיכה עדינה כלפי מעלה מבלי לקרוע את הג'ל. כעת, טען דגימות באמצעות פיפטה.
הכנס את הקצה במלואו לבארות בעת העמסת דגימות כדי למזער את הסיכוי לזיהום בין בארות. הפעל שדה חשמלי של 250 וולט על פני קלטת ה-Gel-seq למשך 30 דקות כדי להפריד את ה-gDNA מהיברידיות ה-cDNA/RNA. לאחר העמסה, הפעלה ואיסוף הג'ל השתמש באזמל כדי לחתוך את הג'ל לשניים ממש מתחת לשכבה בצפיפות גבוהה, ולהשליך את חצי ג'ל המילוי.
לאחר מכן, מקלפים בעדינות את הג'ל שנותר מהקסטה תוך שימוש זהיר בכלי גירוד. לאחר אימות ההפרדה באמצעות רופא ג'ל, השתמש בטרנס-אילומינטור כדי לכרות את הרצועות. ה-gDNA צריך להיות ממוקם בתחילת הג'ל בצפיפות נמוכה, וה-cDNA צריך להיות בממשק של אזורי הצפיפות הנמוכה והגבוהה.
כעת, השתמשו באזמל כדי לחתוך את אזורי הג'ל המכילים gDNA ו-cDNA. הסר גם את אותם חלקים מנתיב הבקרה השלילי. בעזרת פינצטה קהה, העבירו בעדינות את חלקי הג'ל לצינורות רצועה.
אם הג'ל נשבר, מצא והעביר את כל החלקים השבורים לצינור. לאחר מכן, טוחנים כל ג'ל בתנועות סיבוביות, ולוחצים עם קצה פיפטה. לפני הסרת הקצוות, הוסף 40 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ל-gDNA, ו-80 מיקרוליטר לדגימות ה-cDNA.
לאחר מכן, הסר בזהירות והשליך את הטיפים. כעת, אבטח את צינורות הרצועה למיקסר מערבולת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ונער אותם במשך שמונה עד 12 שעות. כך הדנ"א יחמוק מהג'ל.
לאחר הטלטול, פיפטה את הדגימות לתוך צלחת מסנן רשת של שמונה מיקרון. לאחר מכן, סובב את הצלחת ב -2, 600 גרם למשך חמש דקות כדי לסנן את שברי הג'ל. לאחר מכן, הרם את לוחית מסנן הרשת הרחק מלוחית הדיור והשתמש בפיפטה כדי להעביר את הדגימות נטולות הג'ל מהצלחת לצינורות רצועה חדשים של 200 מיקרוליטר.
לכל דגימה המכילה gDNA, הוסיפו מיקרוליטר אחד של פרוטאז, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. לאחר מכן, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן יש להפעיל חימום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
שלב דלדול נוקלאוזום זה הוא קריטי. לאחר מכן, השתמש במחט בגודל 18 כדי לתקוע חור במכסה של כל צינור דגימה. לאחר מכן, השתמש בוואקופוגה כדי להפחית את דגימות ה-gDNA לחמישה מיקרוליטר, ואת דגימות ה-cDNA ל-10 מיקרוליטר.
אם הנפח יורד מתחת למטרה, הוסף מים נטולי נוקלאז לפי הצורך. היברידיות gDNA ו-cDNA/RNA הופרדו פיזית באמצעות מכשיר Gel-seq. לבקרה השלילית אין פלואורסצנטיות אוטומטית של הג'ל בממשקים.
סולמות ה-DNA מראים רק פס כהה בממשק בין הממברנות בצפיפות נמוכה וגבוהה, מה שחושף כי שברים קטנים יכולים לעבור דרך הג'ל בצפיפות נמוכה. דגימה ביולוגית מ-500 תאי PC3 מציגה את ההפרדה הרצויה של DNA גנומי ו-cDNA/RNA היברידיים. פס כהה בחלק העליון של הממברנה בצפיפות נמוכה הוא DNA גנומי בקנה מידה מגה-בסיסי בעוד שהכלאות cDNA/RNA נערמות בממשק של אזורי הצפיפות הנמוכה והגבוהה.
שברי זוגות הבסיסים הקטנים מתחת ל-100 הם מחוץ לתוצרי מטרה שנוצרו מאוליגו-נוקלאוטידים פריימר במהלך שעתוק הפוך ויש לצפות להם. הספריות נוצרו מ-500 תאי PC3 או 750 תאי HeLa. התפלגויות מקטעים מהספריות המותאמות שנוצרו מ-Gel-seq הושוו לדגימות לא תואמות שנוצרו עם פרוטוקולים סטנדרטיים.
התפלגות שברי הנוקלאוטידים הייתה דומה בכל אחת מהשיטות. תוצאות הריצוף של ספריית תאי PC3 הושוו לשיטות מסורתיות. הושוו וריאציות של מספר עותקים ברחבי הגנום.
מבחינה סטטיסטית, שתי השיטות השיגו תוצאות דומות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספריות ריצוף מהדור הבא מזווגות הן עבור DNA והן עבור RNA מאותה דגימה התחלתית. כמו בכל ניסוי ריצוף קלט נמוך, חובה לזכור לשמור על סביבת עבודה נקייה.
כדאי לשים לב היטב לעיקור צינורות וכפפות ניקוי. אפילו עם אמצעי זהירות אלה, ניסויים נכשלים מדי פעם בגלל זיהום. הערה חשובה, הנוכחות והבטיחות של ג'לים פוליאקרילאמיד מקלה על השכיחה שמבשרי הייצור הם נוירוטוקסינים מסוכנים.
אתה תמיד צריך לעבוד עם ריאגנטים אלה במכסה אדים ולנקות מיד כל שפיכה. עיצבנו את Gel-seq כך שיהיה קל לחוקרים ליישם במעבדות שלהם, ואנו מקווים שזה יקל על אימוץ מהיר של טכנולוגיה זו.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
Gel-seq היא שיטה חדשנית המאפשרת הכנה בו-זמנית של ספריות רצף DNA ו-RNA מאוכלוסיות תאים קטנות ללא פיצול דגימות. טכניקה זו מספקת גישה חסכונית לחקר הקשר בין וריאציות מבניות של DNA לביטוי גנים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנומיקה
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- Gel-seq מאפשר יצירת ספריות משויכות מדגימה יחידה.
- בעבר, לא היו פרוטוקולים לרצף DNA ו-RNA בו-זמנית.
- שלושה גישות שפורסמו כיום מתייחסות לאתגר זה.
- השיטה יכולה להתאים לקסטות אלקטרופורזה של ג'ל שונות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול להפקת ספריות רצף מאוכלוסיות תאים קטנות.
- לחקור את השפעת וריאציות מבניות של DNA על ביטוי גנים.
- לספק פתרון חסכוני למחקרים מולטי-אומיים.
שיטות ששימשו
- שימוש במתקן הידרוג'ל להכנת הספרייה.
- חילוץ בו-זמני של DNA ו-RNA מאותה דגימה.
- יישום של טכניקות אלקטרופורזה סטנדרטיות של ג'ל.
- פרוטוקול ייצור מפורט וביולוגי שסופק.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של ספריות DNA ו-RNA משויכות מ-100-1000 תאים.
- הוכחת עלות נוספת זניחה לרצף בו-זמני.
- התאמת הפרוטוקול למגוון הגדרות אלקטרופורזה.
- הבנה משופרת של ויסות ביטוי גנים דרך וריאציות מבניות.
מסקנות
- Gel-seq מייצגת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית הרצף.
- השיטה מאפשרת ניתוח גנומי וטרנסקריפטומי מקיף.
- היא פותחת דרכים חדשות למחקר בתחום ביטוי גנים ושונות מבנית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Gel-seq enables simultaneous DNA and RNA library preparation from small cell populations without sample splitting, addressing a key bottleneck in multi-omics discovery workflows. This capability supports target validation by linking genomic structural variations to transcriptional responses in disease-relevant systems, enhancing predictive confidence in early-stage R&D. The method’s compatibility with standard electrophoresis equipment and low input requirements (100–1000 cells) facilitates scalable adoption in preclinical screening and biomarker discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating DNA copy number variations with gene expression changes in the same cellular context.
- Operational Value: Eliminates sample splitting, reducing variability and preserving biological fidelity for target de-risking.
- Scientific Value: Supports functional validation of genomic targets through paired genomic-transcriptomic readouts from identical samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative nucleic acid outputs suitable for assay normalization and cross-platform comparison.
- Operational Value: Uses familiar WTA and library prep kits, minimizing training overhead and enabling rapid integration into existing genomics workflows.
- Scientific Value: Generates reproducible fragment distributions comparable to standard methods, ensuring data reliability for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving native DNA-RNA relationships in disease models.
- Operational Value: Adaptable to standard gel cassettes, allowing seamless transfer across labs and core facilities without specialized equipment.
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by enabling direct observation of how structural variants influence expression profiles in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
Gel-seq fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and enabling scalable input into lead identification through multi-omic profiling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by linking structural DNA alterations to transcriptional outcomes without sample division.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative DNA and RNA libraries with consistent fragmentation profiles for reliable compound screening.
- Analytics: Generates paired-end sequencing data allowing integrated analysis of copy number variation and expression changes.
- Translational Research: Preserves biological context from primary samples through preclinical models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Leverages widely available electrophoresis infrastructure, positioning Gel-seq as a reusable, low-barrier capability across discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in genotype-phenotype relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized hydrogel-based separation and minimal hands-on variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling earlier, more biologically grounded target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing multi-omic evidence from limited, precious samples.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in nucleic acid handling and gel-based techniques.
- Depends on standard gel electrophoresis chambers, power supplies, and UV crosslinking equipment.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation and fractionation protocols.
- Involves handling neurotoxic acrylamide precursors, requiring fume hood use and safety training.
- Performance may vary with input quality and gel polymerization consistency, necessitating QC steps.
