מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לדמיין את אחד השלבים הראשונים בהפעלה של קספאזות יוזם. שלב זה נקרא קרבה מושרית ומתרחש כאשר מולקולות קספאז מתאחדות ליצירת דימרים פעילים במהלך מוות של תאים אפופטוטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדה ה-caspase כגון מתי, היכן ובאיזו יעילות ניתן להפעיל caspass ספציפיים של יוזם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין את ההרכבה של מתחמי הפעלת קספאז בתאים חיים בזמן אמת. שיטת השלמה פלואורסצנטית ביו-מולקולרית זו משתמשת בשברים של חלבון התירוקסין, נוגה, שהוחדרו לקספאז. השברים אינם פלואורסצנטיים בפני עצמם, אך כאשר הקספאז עובר קרבה מושרית, זה מפגיש את שני חצאי ונוס והם נדלקים.

כדי להעביר את התאים, הוסף תחילה 12 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ל-750 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום בצינור סטרילי. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף 10 ננוגרם של פלסמיד מדווח לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר עבור כל באר שתועבר.

הוסף 20 ננוגרם מכל פלזמת קספאז BiFC לכל צינור. הביאו כל שפופרת לנפח כולל של 100 מיקרוליטר על ידי הוספת מצע סרום מופחת. בעזרת פיפטה P200, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ריאגנט טרנספקציה לתערובת הפלסמיד בצורה טיפתית.

לאחר הדגירה של תערובת ריאגנט טרנספקציה של פלסמיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את המדיום מהתאים באמצעות פיפטה או עם יניקה. לאחר מכן בעזרת פיפטה P1000, פיפטה 800 מיקרוליטר של חומר נטול סרום בעדינות במורד דופן הבאר. בעזרת פיפטה P200, הוסף 200 מיקרוליטר של קומפלקס השומנים של ה- DNA טיפה לכל באר.

דגרו את התאים באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, הסר את המדיה נטולת הסרום המכילה את קומפלקסי השומנים של ה-DNA על ידי שאיבה באמצעות יניקה או עם הפיפטה תוך הקפדה לא לשבש את החד-שכבה. פיפטה שני מיליליטר של מצע גידול מלא שחומם מראש בעדינות לאורך כל באר לפני הדגירה של התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לפני רכישת הנתונים, בצע אינדוקציה של הפעלת קספאז כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפעל את המיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן והפעל את תוכנת הרכישה. בחר את מטרת השמן 60x או 63x והנח טיפת שמן על המטרה.

לאחר מכן הניחו את צלחת התרבות על במת המיקרוסקופ באמצעות מחזיק הצלחת הנכון. הפעל את התנור והגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. התמקד בפלואורסצנטיות המדווח באמצעות לייזר RFP או מסנן.

הזן את אחוז עוצמת הלייזר ב-50% ואת זמן החשיפה ב-100 מילישניות הן עבור נוגה והן עבור RFP כנקודת התחלה כדי לקבוע את ההגדרות האופטימליות לשימוש עבור הניסוי. הפעילו את הלכידה החיה ובדקו את התמונה המתקבלת ואת ההיסטוגרמות המוצגות בשני הערוצים. אם האות חלש וקשה להבחין בתמונה, הגדל את אחוז עוצמת הלייזר או את זמן החשיפה במרווחים עד שהאות והתמונה נראים טוב.

לאחר מכן, בחר או פתח את מודול המחסנית Z בתוכנת המיקרוסקופ. כוונן את המיקוד בכיוון אחד עד שהתא לא יהיה גלוי יותר. בחר באפשרות זו כמיקום העליון.

כוונן את המיקוד בכיוון ההפוך עד שהתא שוב לא יהיה גלוי יותר ובחר במיקום זה כמיקום התחתון. בחר את גודל הצעד האופטימלי והתחל את הרכישה. במידת הצורך, התאם את היסטוגרמה של התצוגה כדי לשפר את המראה החזותי של אות הפלורסנט.

לבסוף, השתמש בתוכנת עיבוד תלת מימד כדי לשחזר את התמונה התלת-ממדית. אם קיים מקור פחמן דו חמצני, הנח את התקן אספקת הפחמן הדו חמצני על גבי מחזיק הצלחת. הגדר את רמת הפחמן הדו חמצני ל-5% והפעל את בקר הפחמן הדו חמצני מתוך התוכנה.

נווט לשדה של תאים שעברו טרנספטציה. דמיין את התמונה החיה של התאים כפי שנרכשה על ידי המצלמה ומוצגת על ידי תוכנת הרכישה על גבי מסך המחשב באמצעות לייזר RFP. לאחר מכן, הזן את ההגדרות עבור אחוז עוצמת הלייזר וזמן החשיפה עבור לייזר RFP.

לאחר מכן, הזן את ההגדרה עבור אחוז עוצמת הלייזר וזמן החשיפה עבור אור הלייזר YFP. עבור כל באר של הצלחת, בחר מספר מיקומים שונים המכילים תא אחד או יותר המבטא את המדווח. הזן את מרווח הזמן בין כל מסגרת של הקפות הזמן ואת המספר הכולל של מסגרות שיש לצלם.

בקר שוב בכל עמדה ותקן ועדכן את המיקוד לפי הצורך. התחל את חלוף הזמן ושמור את הנתונים. לבסוף, נתח את הנתונים באמצעות תוכנת הדמיה זמינה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מוצגת כאן דוגמה של caspase-2 BiFC בעקבות נזק ל-DNA. התאים טופלו במעכב טופואיזומראז אחד: קמפטותצין. החלבון הפלואורסצנטי האדום, mCherry, שימש כמדווח כדי להראות שהתאים מבטאים את בדיקת ה-BiFC ועוזרים לדמיין את המספר הכולל של התאים.

הקרינה של ונוס מוצגת בירוק והפונקטה הגדולה מייצגת קרבה המושרה על ידי קספאז-2. כדי לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלוקליזציה התת-תאית של קומפלקס הפעלת הקספאז, ניתן לדמות תאים בודדים בתלת מימד. הפעלת Caspase-2 מוצגת כאן בירוק והגרעין מוצג באדום.

תצוגת הפרוסות האורתוגניות של התא מוצגת כאשר ניתן לדמיין את מישור ה-xy, מישור ה-yz ומישור ה-xz זה לצד זה. ניתן להציג את התמונה התלת מימדית גם בסרט שבו התא מסובב סביב ציר ה-y. כדי לספק נתונים קינטיים של קספאז, ניתן להשתמש בהדמיית זמן-lapse BiFC.

סרטון זה מציג את הפעלת קספאז-2 בירוק לאחר טיפול במעכב הפרוטאזום:Bortezomib. המיטוכונדריה מוצגים באדום. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-Caspase BiFC כדי לעקוב אחר הרכבת מתחמי הפעלת הקספאז בזמן אמת ולקבוע באופן ברור את הגודל, הצורה והלוקליזציה של הקומפלקסים המיוצרים.

פרוטוקול זה מתאר כמה גישות מבוססות מיקרוסקופ לאיסוף התוצאות לניסוי BiFC קספאז; עם זאת, יש לציין כי ניתן להשתמש במספר וריאציות ושילובים של גישות אלו כדי לחקור באופן יצירתי מסלולי הפעלה של קספאז. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול בקרות מחפצים המושרים על ידי מיקרוסקופיה כגון רעילות פוטו והלבנת תמונות. פרוטוקול הטקסט הנלווה כולל טיפים להשגת מטרה זו.

ההחלטה באיזו שיטת רכישה וניתוח להשתמש תיקבע על פי ההיקפים שיש לחקור והזמינות של תוכנות מכשור והדמיה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בגישות ניתוח הדמיה כדי לפרש את הנתונים. אתה יכול למדוד שינויים בעוצמת הקרינה לאורך זמן או את אחוז התאים הפלואורסצנטיים.

ניתן לחשב גם את מספר המוקדים או גודל האובייקט.