התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את רצפי תעתיקי ה-mRNA מהקצה השלישי לאזורים בתוך אזור קידוד החלבון על ידי שימוש בפריימרים מקוננים ספציפיים לתעתיק בשני PCR עוקבים וריצוף תוצרי ה-PCR המטוהרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנטי, כגון קביעת אות הפוליאדנילציה, קודון העצירה והרצף של האזור הלא מתורגם בעל שלושת הראשונים של התעתיק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על כל תעתיק אם הרצף של האזור הקטן של מסגרת הקריאה הפתוחה הוא ההשלכה של טכניקה זו משתרעת לכיוון אבחון סרטן, מכיוון שהיא יכולה לזהות גנים ספציפיים לגידול וגרסאות חיבור.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר זיהינו תעתיקים חדשים עם אזורים לא מתורגמים שלא אופיינו בעבר. כדי להתחיל את הפרוטוקול, יש להפשיר את תערובת תאי הפנול והגואנידין איזותיוציאנט על קרח. לאחר ההפשרה, הוסף 100 מיקרוליטר כלורופורם לצינור המיקרו-צנטריפוגה במכסה המנוע PCR.

מערבל את הדגימה למשך 10 עד 15 שניות עד שהתערובת ורודה ואטומה. לאחר מכן, דגרו את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות בחום של 20, 800 גרם וארבע מעלות צלזיוס.

הסר בזהירות את השלב המימי חסר הצבע העליון והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, עברו למשקעים והוסיפו נפח שווה של איזופרופנול לדגימה. הוסף לדגימה מיקרוליטר אחד של משקע משותף כדי לשמש כנשא עבור ה-RNA וכדי לעזור לדמיין את ה-RNA בשלבים הבאים.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. לאחר הדגירה, העבירו את הדגימה לצנטריפוגה מקוררת וסובבו במשך 35 דקות בחום של 20, 800 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, ה-RNA יופיע כמפרט כחול בתחתית הצינור.

הסר בזהירות את האיזופרופנול מהדגימה. הוסף 500 מיקרוליטר של אתנול 80% והשהה מחדש את הגלולה על ידי מערבולת קצרה למשך שלוש שניות. צנטריפוגה שוב את הדגימה.

הסר את כל האתנול מהדגימה ותן לדגימה להתייבש באוויר כ-10 דקות. לאחר שהדגימה יבשה, השעו אותה מחדש ב-35 מיקרוליטר מים ללא RNase. לאחר מכן, הניחו את הדגימה על גוש חום.

הגדר על 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להבטיח שה-RNA נמצא בתמיסה מלאה. לאחר החימום, הניחו מיד את הצינור על קרח. לנפח תגובה סופי של 50 מיקרוליטר, הוסף ארבעה מיקרוגרם של RNA כולל בתוספת מים לנפח כולל של 22 מיקרוליטר לצינור חדש.

הוסף שני מיקרוליטר של פריימר Oligo dT 25 מתמיסת הפריימר המיקרומולרית 10. מערכת השעתוק ההפוך, הוסף שני מיקרוליטר של מעכב RNase, שמונה מיקרוליטר של מאגר התגובה 5x, ארבעה מיקרוליטרים של 10 מילי-מולרי dNTPs ושני מיקרוליטרים של הטרנסקריפטאז ההפוך. הגדר תגובה ללא טרנסקריפטאז הפוך כדי לשמש כבקרה שלילית.

דגרו את הצינור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה, העבירו את הצינור ישירות לקרח לפני העברתו לגוש החימום. לאחר מכן, מחממים את הצינור בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר חימום 75 מעלות צלזיוס, הניחו את הצינור על קרח. העבירו שני מיקרוליטרים של ה-cDNA לצינור PCR טרי של 0.5 מיליליטר. הוסף מיקרוליטר אחד של הפריימר הקדמי ומיקרוליטר אחד של הפריימר ההפוך מתמיסת פריימר של 10 מילי-מולאר.

הכינו עד 12.5 מיקרוליטר על ידי הוספת 8.5 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז והוסיפו 12.5 מיקרוליטר של 2x PCR לתערובת ג'ל מאסטר. לאחר מכן, הזן את תנאי הרכיבה התרמית של PCR המפורטים על המסך והפעל את ה-PCR. לאחר ה-PCR, הכינו ג'ל אגרוז 1% מוכתם באתידיום ברומיד.

ממיסים גרם אחד של אגרוז ב-100 מיליליטר טריאצטט או מאגר TAE בבקבוק של 250 מיליליטר. מרתיחים את התוכן במיקרוגל. הניחו לג'ל להתקרר במשך דקה אחת, והוסיפו 7.5 מיקרוליטר תמיסת אתידיום ברומיד במכסה אדים.

מערבבים היטב על ידי סיבוב הבקבוק. יוצקים את התכולה למנגנון ג'ל אופקי ומניחים לג'ל להתמצק בטמפרטורת החדר במכסה האדים למשך 30 דקות לפחות. מכסים את הג'ל במאגר 1x TAE וטוענים 10 מיקרוליטר של מוצר ה-PCR על ג'ל האגרוז יחד עם שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של סולם המשקל המולקולרי של ה-DNA.

הפעל את הג'ל בחום של 175 וולט למשך 10 דקות. עבור ה-PCR הראשון, העבירו מיקרוליטר אחד של cDNA לצינור PCR והוסיפו חמישה מיקרוליטר של מאגר תגובה של 10x Pfu. הוסף מיקרוליטר אחד של הפריימר הקדמי המקונן הראשון, מיקרוליטר אחד של פריימר T7 Oligo dT 25, ומיקרוליטר אחד של dNTPs מתמיסה של 10 מילי-מולאר.

הכינו עד 49 מיקרוליטר מהנפח הכולל על ידי הוספת 40 מיקרוליטר מים. מוסיפים מיקרוליטר אחד של Pfu DNA פולימראז ומערבבים היטב. לאחר מכן, הפעל את ה-PCR.

לאחר מכן, הכינו את ה-PCR השני. העבירו שני מיקרוליטרים של המוצרים מה-PCR הראשון לצינור PCR חדש וערבבו אותו עם חמישה מיקרוליטרים של 10x Pfu ultra two reaction buffer. הוסף מיקרוליטר אחד של פריימר ה-PCR המקונן השני, מיקרוליטר אחד של פריימר T7 ומיקרוליטר אחד של dNTPs.

צור עד 49 מיקרוליטר נפח תגובה כולל על ידי הוספת 39 מיקרוליטר מים והוסף מיקרוליטר אחד של פולימראז Pfu DNA. הפעל את ה-PCR באמצעות אותו פרופיל PCR כמו הגדרת ה-PCR הראשונה. לחלופין, במקום להשתמש ב-Pfu DNA פולימראז, ניתן להשתמש ב-DNA פולימראז כימרי בשני ה-PCR השונים.

קח חמישה עד עשרה מיקרוליטר ממוצר ה-PCR השני והפעל אותו על ג'ל אגרוז. לבסוף, דמיין את התוצאה על מצלם. ג'ל אגרוז זה מציג שני מוצרי PCR נפרדים המשתמשים באותו פריימר קדימה אך פריימרים הפוכים שונים ומוצר PCR מובהק שיש לו פריימר מובהק קדימה ואחורה.

הפריימרים האידיאליים לשימוש לתגובה מבוססת PCR הם אלה שנותנים תוצר PCR מובהק אחד. מוצרים מתגובת ה-PCR השנייה עם Pfu DNA פולימראז ו-DNA פולימראז כימרי ייצרו מוצרי PCR בגודל זהה למרות שהיו להם תנאי מחזור PCR שונים עבור ה-RACE התלת-ראשוני. הבקרות השליליות של הטרנסקריפטאז ההפוך לא הראו זיהום גנומי של ה-RNA המשמש בסינתזה של cDNA כמו גם בתגובות בהמשך הזרם.

מוצרי PCR מטוהרים בג'ל נשלחו לריצוף. רצף סנגר מייצג מכרומטוגרמה של רצף זיהה את המיקום של קודון העצירה, אות הפוליאדנילציה המשוער והאתר, כמו גם את זנב הפולי A במכפלת ה-RACE התלת-ראשונית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללבוש ציוד מגן וכפפות בכל עת.

בנוסף, השתמש ב-DNase ו-RNase סטריליים עבור צינורות הריאגנטים שלך וכלים חד פעמיים אחרים. אל תשכח שעבודה עם פנול וכלורופורם יכולה להיות מסוכנת ביותר. ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בריאגנטים במכסה המנוע והשלכת חומר למיכל פסולת ייעודי בעת ביצוע הליך זה.