Name: התאמת 3 הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למד את שיטת 3' RACE לזיהוי רצפי mRNA בסרטן באמצעות שימוש ב-DNA polymerases שונים ו-PCR מקונן. טכניקה זו מאפשרת למיפוי ORF, קודון עצירה ואזור 3' UTR בתאי סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות Bettine גיבס עזרה טכנית.

ללבוש חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפיים בכל עת בזמן ביצוע כל ההליכים ב פרוטוקול זה. ודא כי מכולות/צינורות המכיל הכימית isothiocyanate פנול ו guanidine נפתחים רק מוסמך הוד, ולאחר השלך פסולת פנול במיכל ייעודי. השתמש DNAse/RNAse ללא צינורות סטרילי, טיפים, ריאגנטים.
1. תרבית תאים
<ol><li>לגדול הלה תא ואת שני ההשעיה מנטל לימפומה התא שורות תאים, Granta-519 ו- Jeko-1, ב- DMEM המכיל 10% FBS ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C. לדלל 1:10 תאים ולספור באמצעות חלקיקים מונה14.</li>
	<li>לחילוץ RNA, צלחת 500,000 תאים/היטב לתוך צלחת טוב 6 (2 מ ל מדיה לכל טוב). לאחר דגירה במשך 24 שעות ביממה, לאסוף RNA התאים.</li>
</ol>2. RNA החילוץ
<ol><li>קציר תאים הערה: למעט השלב צנטריפוגה, לבצע את כל השלבים המפורטים בברדס תרביות רקמה כדי לשמור על עקרות.<ol>
<li>עבור תאים ההשעיה (Jeko-1 ו- Granta-519):<ol>
<li>להעביר את התאים (יחד עם 2 מ"ל של מדיה) צינור 15 mL, ו צנטריפוגה-1,725 g x עבור 5 דק וביופסיה התקשורת ולהשאיר בגדר תא בתחתית של הצינור.</li>
			<li>Resuspend בגדר תא ב- 50 µL 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS). להוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל מדגם בצינור microcentrifuge 1.5 mL. ערבבו היטב והמתינו בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות תוך כדי היפוך הצינור microcentrifuge לכל 1 דקות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עבור תאים חסיד (הלה):<ol>
<li>האחות התקשורת התרבות התא מכל קידוח. להוסיף 1 מ"ל של PBS כל טוב לשטוף את הלכלוך.</li>
			<li>להסיר את PBS ולהוסיף 500 µL של ריאגנט isothiocyanate פנול ו guanidine monophasic כל טוב.</li>
			<li>תקופת דגירה-RT של 5 דקות עם נדנדה עדין. העברת צינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>פירוק התא<ol>
<li>הקפאת התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, ב-20 ° C עבור 1 h. הערה: התמהיל יכול להיות שמאל ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד הצורך.</li>
		<li>להפשיר את התערובת תא פנול ו guanidine של isothiocyanate, על קרח. להוסיף 100 µL של כלורופורם הצינור microcentrifuge בשכונה ה-PCR. מערבולת המדגם עבור s 10-15 עד התערובת הוא ורוד אטום. דגירה המדגם על קרח (ב 4 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות.</li>
		<li>Centrifuge המדגם למשך 15 דקות ב 20,800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את השלב העליון מימית השקופה (~ 200 µL), העברת צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA משקעים<ol>
<li>להוסיף אמצעי שווה של אלכוהול איזופרופיל כל דגימה. להוסיף 1 µL של coprecipitant (ראה טבלה של חומרים) אחד לטעום לפעול כנשא עבור הרנ א. ולעזור להמחיש את הרנ א בצעדים העוקבים. דגירה המדגם ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. לקבלת תוצאות מיטביות, דגירה בין לילה ב- 80 ° c</li>
		<li>להעביר את הדגימה צנטריפוגה מקורר. צנטריפוגה במשך 35 דקות ב 20,800 x g / 4 ° C; הרנ א תופיע כתם כחול על החלק התחתון של הצינור. הסר בזהירות את אלכוהול איזופרופיל מדגם. להוסיף 500 µL של 80% אתנול, resuspend בגדר מאת בקצרה vortexing עבור 3 s.</li>
		<li>צנטריפוגה המדגם ב g x 20,800 ב RT עבור 5 דק להסיר כל האתנול המדגם. תן הדגימה מילה נהדרת כ 10 דקות Resuspend הדגימה ב µL 35 RNAse ללא מים. מניחים על גוש חום (65 ° C) במשך 5 דקות להבטיח הרנ א יהיה מלא בפתרון, מיד במקום הצינור על קרח.</li>
		<li>לקבוע את הריכוז של RNA הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים כאמור תיאר, אלא להשתמש µL 1.5 המדגם RNA במקום 1 µL15. באופן אופציונלי, להפעיל µg 1 של RNA הכולל ג'ל agarose 1% כדי לקבוע את תקינות ה-RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase טיפול
<ol><li>לאחר כימות RNA, מבצע טיפול DNAse הרנ א הכולל כדי להשפיל את כל הדנ א. עבור כל דגימה, הוסף את ריאגנטים הבאים ערכת DNAse RNAse-חופשית כדי לגרום לתגובה הכולל 20 µL לערבב פנימה צינור microcentrifuge נפרדים:<ol>
<li>לערבב 2 µL של DNase 10 X תגובת מאגר עם µg 4.4 של RNA הכולל. מביאים סכום כולל של 14 µL עם מים.</li>
		<li>להוסיף 2 µL של נטול RNase DNAse. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בנוכחות 2 µL של RNase מעכב (מתוך הערכה שעתוק לאחור).</li>
		<li>להוסיף 2 µL של פתרון להפסיק וחום על גוש חום למשך 10 דקות ב 70 ° C כדי להשבית את האנזים DNAse. הערה: DNAse הטיפול היא אופציונלית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cDNA סינתזה
עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL:
<ol><li>עבור אמצעי אחסון התגובה האחרונה של 50 µL: 22 העברת µL של DNase מטופלים RNA צינור חדש או העברה 4 µg של RNA הכולל עם מים נוסף לאמצעי סך של 22 µL על צינור. להוסיף 2 µL של הראשיים25 . dT oligo T7 מהפתרון תחל 10 מיקרומטר. הרצף עבור הראשיים25 . dT oligo T7 הוא 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>הערכה הפוכה שעתוק להוסיף 2 µL של המדכא RNase (20 U µL), µL 8 המאגר התגובה 5 x, µL 4 של 10 מ מ dNTPs ו 2 µL של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL). הערה: להגדיר תגובה בלי רוורס טרנסקריפטאז לפעול כמו פקד שלילי.</li>
	<li>דגירה ב 42 ° C עבור ה 1 העברה ישירות לקרח. מחממים את הצינור ב 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים את הצינורית על קרח.</li>
</ol>5. פריימר חיפוש של פיוז'ן ג'ין התעתיק
<ol><li>
העיצוב תחל
	<ol>
<li>הורד את רצף cDNA מהדפדפן הגנום אנסמבל (ENST00000360839.6/NM_017747) וזהה של אזור בתוך ORF של היעד תמליל (ANKHD1) במעלה הזרם של stop codon. העתקה והדבקה של האזור כולו (עד 700 נוקלאוטידים) המכיל רצפי במעלה הזרם stop codon אל אזור הזנת רצף של תוכנת עיצוב פריימר (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>בחרו באפשרות ' הצג עיצוב מותאם אישית ' ובחרו 10 עבור מספר תחל כי המערכת צריכה לייצר (תוצאות כדי להחזיר) להשאיר את כל הפרמטרים האחרים, קבע כברירת מחדל.</li>
		<li>לבחור חמישה צבעי בסיס קדמי של שני צבעי יסוד הפוך שאינם חופפים. סדר תחל, לשקם עם RNAse/DNAse ללא מים כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. פרטים נוספים על פריימר כללי עיצוב עבור ה-PCR מכוסים במקום אחר16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR לזיהוי תחל פוטנציאל לשימוש הבאים 3' המירוץ הערה: כדי לקבוע את צבעי בסיס קדמי הסופי כדי להשתמש בהתגובה, יש לבדוק את צבעי בסיס מעוצב על-ידי הגדרת שילובים שונים של צבעי יסוד ואחורה עבור PCR רגיל בשכונה ה-PCR.<ol>
<li>להעביר את cDNA (2 µL) צינור PCR טריים 0.5 מ. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים µL 1 של ומהצמיגים הפוכה (מתוך פתרון תחל 10 מ מ). להפוך µL עד 12.5 על-ידי הוספת 8.5 µL של נוקלאז ללא מים. להוסיף 12.5 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR-כדי-ג'ל.</li>
		<li>השתמש PCR תרמי אופניים בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחריו 29 מחזורים של 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 ° C עבור מינימלית 1 להגדיר את המעגל הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות.</li>
		<li>לאחר PCR, להפעיל את המוצרים agarose 1% ג'ל מוכתם אתידיום ברומיד. פרטים על אלקטרופורזה מתוארים כאמור עם שינויים מספר17.<ol>
<li>להמיס 1g של agarose ב- 100 מ של טריס-אצטט (טה) מאגר בבקבוקון 250 מ. מרתיחים במיקרוגל.</li>
			<li>להשאיר להתקרר למשך 1 דקות ולהוסיף µL 7.5 של אתידיום ברומיד פתרון (המניות 10 מ"ג/מ"ל) בברדס fume. מערבבים היטב בעזרת מתערבל את הבקבוקון ויוצקים לתוך מנגנון ג'ל אופקי. יוצאים RT בשכונה fume במשך לפחות 30 דקות לאפשר את הג'ל לגבש.</li>
			<li>לכסות את הג'ל עם מאגר x TAE 1 וטען µL 10 של המוצר PCR על גבי הג'ל agarose יחד עם 3-5 µL של הסולם משקל מולקולרי הדנ א. לרוץ במהירות 175 V עבור 10 דקות לדמיין את המוצרים באמצעות imager ולאחר אם נוספת נדרשת הפרדה של מוצרים, הפעל את ג'ל למשך דקות נוספות 5-10.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבחר תחל מקוננים על 3' המירוץ
	<ol>
<li>לנתח את התוצאות של הג'ל agarose PCR לבחירת צבעי יסוד שיש להקה PCR ברורים, חזק יחיד. להשתמש את פריימר 5'-רוב (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') יחד עם הראשיים25 oligodT T7. ב ה-PCR הראשון לרוץ.</li>
		<li>בחר את פריימר מקוננת שנמצאת במורד הזרם של מן המפתח הראשון (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 "), ולהשתמש בו עם ומהצמיגים T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') במערכה השנייה של תגובות PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ייעול 3' גזע כדי למפות את 3' UTR באמצעות שני אנזימים שונים
הערה: חלה עלייה המגוון של ה-DNA polymerases המשמש PCR; לכן, רצינו לקבוע תנאים סטנדרטיים שניתן להחיל גם כאשר באמצעות אנזימים שונים עבור 3' תגובות PCR המירוץ. צבעי יסוד הפוך כל תעתיק נשמרים קבוע; השינויים היחידים הם צבעי בסיס קדמי מקוננים ספציפיים על-ידי היעד.
<ol><li>
פרוטוקול 1:3 ' המירוץ באמצעות של פולימראז דנ א שונה מ- Pyrococcus furiosus (Pfu)
	<ol>
<li>PCR הראשון<ol>
<li>1 µL של cDNA להעביר צינור PCR ולהוסיף µL 5 10 x Pfu התגובה המאגר. להוסיף 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר25 T7 oligodT, 1 µL של dNTPs (מתוך פתרון 10 מ מ).</li>
			<li>להפוך עד 49 µL הנפח הכולל על-ידי הוספת 40 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז ומערבבים היטב. הפעל את ה-PCR שימוש בפרופיל ה-PCR בטבלה1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR השני<ol>
<li>להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR ומערבבים עם µL 5 x 10 PfuII אולטרה התגובה המאגר. הוסף µL 1 של פריימר PCR מקונן השנייה, µL 1 של ומהצמיגים T7 µL 1 של dNTPs (פתרון 10 מ מ).</li>
			<li>להפוך עד 49 µL התגובה הכולל אמצעי אחסון על-ידי הוספת 39 µL של מים. להוסיף 1 µL של Pfu DNA פולימראז. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פרוטוקול 2:3 ' המירוץ באמצעות פולימראז DNA chimeric המורכב של תחום איגוד ה-DNA דבוקה של Pyrococcus-כמו הגהה פולימראז PCR מיקס מאסטר
	<ol>
<li>PCR הראשון<ol>
<li>העברת µL 1 של cDNA צינור ה-PCR. מוסיפים 1 µL של פריימר לפנים מקוננים הראשון µL 1 של פריימר25 oligodT T7. להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים.</li>
			<li>להוסיף 25 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR ומערבבים היטב. השתמש PCR אופניים בתנאים המתוארים בטבלה מס ' 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR השני<ol>
<li>להעביר 2 µL של מוצרי ה-PCR הראשון צינור ה-PCR. להוסיף 1 µL של השנייה תחל PCR מקוננים יחד עם µL 1 של פריימר הפוך T7.</li>
			<li>להפוך µL עד 25 על-ידי הוספת 22 µL של מים. להוסיף 25 µL של 2 X מיקס מאסטר PCR. הפעל את ה-PCR באמצעות PCR באותו הפרופיל כמו הגדרת ה-PCR הראשון (טבלה 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ודא המוצר PCR השני של 3' המירוץ.
<ol><li>µL 5-10 לקחת המוצר PCR השני (כמו גם מוצר מבית בסיבוב הראשון של מותני אם התעתיק מתבטא בשפע) ולהפעיל על agarose ג'ל. להגדיר את הג'ל ולהפעיל את אלקטרופורזה כאמור תיאר (שלבים 5.2.3.1 כדי 5.2.3.3). לדמיין את התוצאות imager.</li>
</ol>8. המוצר טיהור ורצף
<ol><li>לטהר את המוצרים באמצעות PCR ג'ל PCR השני באמצעות ג'ל PCR מקטע DNA לנקות מערכת לפי הפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>לבצע סנגר רצף (לחלופין, שלח הג'ל מטוהרים רצף המתאים תחל למעבדה רצף ודוגמאות של מוצר ה-PCR). לנתח את הנתונים רצף לאחר סנגר רצף.</li>
	<li>להוריד תוכנה-ניתוח רצף (ראה טבלה של חומרים) ולייבא בקבצי המעקב לתוך התוכנה. שימוש בודדים טהור בסיס QVs (ערכי איכות) כדי להשיג את הבסיס לקרוא מידע18. הורד את chromatogram עם איכות גבוהה עקבות לצפייה. אופציונלי: המוצר מטוהרים ג'ל יכול להיות משובטת באמצעות ערכת השכפול המתאים שיבוטים מבודד שלח סנגר רצף.</li>
</ol>

<ol><li>Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+factors+in+pre-mRNA+3%27-end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li>
<li>Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+end+mRNA+processing%3A+Molecular+mechanisms+and+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease.</a> EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).</li>
<li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+atlas+of+polyadenylation+in+five+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals.</a> Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+amplification+of+3%E2%80%B2+cDNA+ends+%283%E2%80%B2-RACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Masamha, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFIm25+regulates+glutaminase+alternative+terminal+exon+definition+to+modulate+miR-23+function%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function.</a> RNA. 22 (6), 830-838 (2016).</li>
<li>Rodu, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002962915361474">Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within.</a> Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).</li>
<li>Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-483-6:233">PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology</a>. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).</li>
<li>Freeman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+full-length+transcripts+and+transcript+variants+using+5%27+and+3%27+RACE%5BTitle%5D)+AND+%22Lipoproteins+and+Cardiovascular+Disease%3A+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22%5BJournal%5D)">Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE.</a> Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).</li>
<li>Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+CCND1%2FMRCK+gene+fusion+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma.</a> J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Parker, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenic+FGFR3-TACC3+gene+fusion+escapes+miR-99a+regulation+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Investig%22%5BJournal%5D)">The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma.</a> J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).</li>
<li>Prakash, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+conjoined+genes%3A+Another+mechanism+for+gene+regulation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes.</a> PLOS ONE. 5 (10), e13284(2010).</li>
<li>Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+complexity+of+gene+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The emerging complexity of gene fusions in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).</li>
<li>International Committee For Standardization In, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+evaluation+of+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Protocol for evaluation of automated blood cell counters.</a> Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+primer+specific+filter+metrics+for+the+assessment+of+mitochondrial+DNA+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA%22%5BJournal%5D)">Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data.</a> Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).</li>
<li>Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+better+probes%3A+Effect+of+probe+size%2C+mismatch+position+and+number+on+hybridization+in+DNA+oligonucleotide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays.</a> J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/365f/f55d5d1ca2c64665cf11eaf1a856dc464a19.pdf">The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency.</a> Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).</li>
<li>Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27896140">Multi-template polymerase chain reaction.</a> Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).</li>
<li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nat Commun. 5, 4846(2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות הופעתו של טכנולוגיות רצף מקביל מסיבית, על בסיס ג'ין-מאת-גן, 3' המירוץ נשאר עדיין השיטה הקלה ביותר וחסכוני ביותר לזהות את PAS נוקלאוטידים סמוכים ועד הזנב poly(A). הסתגלות שתוארו כאן מרחיב באמצעות 3' גזע כדי להגביר והן מפת רצפים הכוללים חלק של ORF על stop codon, את כולה 3' UTR של תמליל mRNA ANKHD1 . היתרון העיקרי של 3' המירוץ הוא כי עם כמה עיבודים קלים, מוצרים מ 3' גזע יכולים להיות משובטים לתוך וקטורים אחרים כדי להקל על חקירתו במורד הזרם של 3' UTR פונקציה כולל מיקוד miRNA, מבחני יציבות וכן מבחני מכניסטית אחר...

היווצרות של הקצה 3' הוא שלב קריטי ב- mRNA ההבשלה שכוללת את המחשוף של pre-mRNA במורד הזרם של פאס ואחריו התוספת של ~ 250 untemplated adenines, אשר מרכיבים את הזנב poly(A)1,2. החלבון איגוד poly(A) (PABP) נקשר הזנב poly(A), זה מגן על התעתיק mRNA מפני השפלה, ומקלה על תרגום1.
הערכות הנוכחי מראים כי 70% של גנים אנושיים יש מסירה מרובים, ובכך עוברים פוליאדנילציה חלופיים, וכתוצאה מכך מספר 3' קצוות3. לכן, חשוב לזהות איפה הזנב poly(A) מייחסת שארית 3' UTR, כמו גם לזהות את PAS בשימוש על ידי כל תעתיק נתון. כניסתו של הדור הבא רצפי הביא זיהוי בו זמנית של 3' UTRs ואת המעבר של אלפי גנים. עלייה זו יכולת רצף דרש הפיתוח של bioinformatic אלגוריתמים לניתוח נתונים מעורבים פוליאדנילציה חלופית של הסוף 3'. עבור זיהוי דה נובו או אימות של מלון פאס, ומכאן מיפוי של 3' סוף גנים יחידניים מנתונים רצף בקנה מידה גדול, 3' המירוץ נשאר לשיטת הבחירה4,5. רצפי הכלולים במוצרי cDNA של 3' המירוץ בדרך כלל כוללים רק חלק מתוכן 3' UTR המכיל את הזנב poly(A), האתר המחשוף, מלון פאס, רצפי במעלה הזרם PAS. בניגוד PCR, הדורש שימוש של גן מסוים ואחורה תחל ועיצוב, 3' המירוץ רק דורש שני גנים ספציפיים מקוננים קדימה תחל. לפיכך, PCR דורש ידע מפורט יותר של הרצף נוקלאוטיד של אזור גדול של הגן להיות מוגבר4,6. מאז 3' המירוץ משתמשת אותו הפוך פריימר כי מטרות poly(A) זנב עבור כל התרשימים polyadenylated RNA, רק תחל קדימה צריך להיות גנים ספציפיים, לפיכך, רק הדורשים ידע של אזור הקטנה משמעותית mRNA. פעולה זו מאפשרת ההגברה של אזורים רצפים של מי אינם במלואו מאופיין4,7. זו אפשרה 3' גזע כדי לשמש לא רק כדי לקבוע את הקצה 3' של הגן, אבל גם לקבוע לאפיין אזורים גדולים במעלה הזרם של מלון פאס המהווים חלק ניכר 3' UTR. על ידי שילוב 5' המירוץ עם ששונה 3' המירוץ הכולל חלקים גדולים יותר 3' UTR ואזורים איגוף, זה אפשרי לחלוטין רצף או לשכפל התעתיק mRNA כולו מקצה 5' שלה 3' סוף8.
דוגמה של יישום זה של ששונה 3' המירוץ הוא זיהוי האחרונות רומן CCND1-MRCK פיוז'ן ג'ין תעתיק של שורות תאים לימפומה המעטפת התא, חולי סרטן. 3' UTR כללה רצף של גנים הן CCND1 והן MRCK , היה הסרבן miRNA תקנה9. שני מקוננים CCND1 ספציפי לפנים תחל היו משלימים באזור הסמוך מיידי של הזרם של codon להפסיק CCND1 . למרות transcriptome כל רצף יחד עם כלים bioinformatic ספציפי יכול לשמש כדי לזהות גנים fusions בתוך 3' UTR10, מעבדות רבות ייתכן שיחסרו את המשאבים הכספיים או מומחיות bioinformatic לעשות שימוש בטכנולוגיה זו. ומכאן, 3' המירוץ הוא חלופה עבור דה נובו זיהוי ואימות של פיוז'ן הרומן גנים מעורבים של 3' UTR. בהתחשב בכך דרסטי להגדיל את מספר גנים פיוז'ן שדווחה וכן לקרוא דרך תעתיקים, 3' המירוץ הפך להיות כלי רב עוצמה באפיון ג'ין-רצפים-11,-12. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכי רצפים שונים בטווח 3' UTR, כמו גם את אורך 3' UTR יכול להשפיע mRNA התעתיק יציבות, לוקליזציה, translatability, הפונקציה13. בחלקו בשל עניין מוגבר במיפוי של transcriptome, חלה עלייה במספר polymerases דנ א שונים שפותחו לשימוש במעבדה. חשוב לקבוע מה סוגי שינויים יכולים להתבצע 3' פרוטוקול המירוץ ב כדי לנצל את הרפרטואר הזמינים של דנ א polymerases.
עבודה זו דוחות התאמה 3' גזע כדי למפות את כל 3' UTR, מלון פאס, ואתר 3' סוף המחשוף של התעתיק ANKHD1 באמצעות מקונן תחל בתוך המקטע ANKHD1 של התעתיק, שני polymerases דנ א שונים.

<table><tbody><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>קו תאי סרטן צוואר הרחם.</td></tr><tr><td>תאי Jeko-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>קו תאי לימפומה של תאי מעטפת.</td></tr><tr><td>תאי Granta-519</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>קו תאי לימפומה של תאי מעטפת.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>סרום בקר עוברי לתרבית תאים.</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>אנטיביוטיקה ואנטי-פטרייה.</td></tr><tr><td>משקע GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>מדיה של תרבית תאים של המותג Gibco עם GlutaMAX.</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>אמביון DNase ו-RNAse ללא מים (לא מטופלים ב-DEPC).</td></tr><tr><td>דולבקו s תמיסה חוצצת פוספט</td><td>קורנינג</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא&nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט אלכוהול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>793175</td><td>אתנול</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד תמיסת</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>טריזול ריאגנט</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>פנול מונופזי ומגיב גואנידין איזותיוציאנט.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&nbsp; מכיל צבע טעינה המשמש בבדיקות PCR מהירות שגרתיות וחיפוש פריימר.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr>RQ1 <td>ערכת טיפול</td> DNase <td>Promega</td><td>M6101</td><td>DNase ללא RNase</td>.</tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל כתום (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix עם מאגר HF</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix המכיל DNA פולימראז כימרי המורכב מתחום קשירת DNA המאוחה לפולימראז הגהה דמוי פירוקוקוס וריאגנטים אחרים.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA פולימראז</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>DNA פולימראז שונה מ- Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך של RevertAid RT</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>משמשת לשעתוק הפוך של mRNA לתוך סינתזת cDNA. הערכה כוללת&nbsp; מעכב Ribolock RNAse, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase וריאגנטים אחרים המפורטים בכתב היד.</td></tr><tr><td>סולם 1Kb בגודל מיוחד</td><td></td><td>5 2500360 סולם</td><td>DNA במשקל מולקולרי.</td></tr><tr><td>אלפא אינוטק FluorChem Q MultiImage III</td><td>אלפא אינוטק</td><td></td><td>משמש להמחשת ג'ל אגרוז מוכתם אתידיום ברומיד.</td></tr><tr><td>סולם משקל מולקולרי נמוך</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N3233L</td><td>סולם DNA במשקל מולקולרי.</td></tr><tr><td>מערבולת מיקסר</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיה יבשה</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>ספקטרופוטומטר.</td></tr><tr><td>מיני-סאב רחב&nbsp; מערכת אלקטרופורזה אופקית של תא GT</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>ציוד אלקטרופורזה להקמת ספק</td></tr><tr><td>כוח בסיסי</td><td>ג'ל PowerPac ספק כוח BioRad</td><td>1645050</td><td>ספק כוח לאלקטרופורזה בג'ל.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>אשף SV ג'ל ושברי PCR מערכת ניקוי DNA</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR ערכת שיבוט, עם זריקה אחת&nbsp; TOP10 תאי E. coli מוכשרים כימית</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>תחנת הכנה MyPCR מכסה מנוע Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>המוקדש לעבודת PCR.</td></tr><tr><td>קולט אדים Hamilton SafeAire II</td><td>קולט אדים</td> <td>ThermoFisherScientific</td><td></td>.</tr><tr><td>בקמן קולטר Z1&nbsp; חלקיקים&nbsp; מונה</td><td>בקמן קולטר</td><td>6605698</td><td>מונה חלקיקים. לספירת תאים לפני הציפוי&nbsp; למיצוי RNA.</td></tr><tr><td>תוכנת סורק רצפים יישומית של ביוסיסטמס v2.0</td><td>Applied Biosystems (באמצעות ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>תוכנה לניתוח נתוני ריצוף Sanger.</td></tr></tbody></table>

התאמת 3' הגברה מהירה של cdna מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

ההבשלה של mRNAs האיקריוטים כרוך 3' הקצה למערך, הכוללת התוספת של זנב poly(A). על מנת למפות את קצה 3' של גנים, השיטה המסורתית להתמקד יש 3' הגברה מהירה קצות cDNA (3' גזע). פרוטוקולים עבור 3' המירוץ דורשים תכנון זהיר ומבחר תחל מקוננים בתוך 3' האזור לא מתורגם (3' UTR) של הגן היעד עניין. עם זאת, עם מספר שינויים בפרוטוקול יכול לשמש כדי לכלול את כל 3' UTR רצפים בתוך מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מתן תמונה מקיפה יותר של הקשר בין של ORF את 3' UTR. זאת, בנוסף זיהוי של הסימן פוליאדנילציה (PAS), כמו גם המחשוף ואתר פוליאדנילציה שסופקו על-ידי קונבנציונלי 3' המירוץ. המורחב 3' גזע יכולים לזהות יוצא דופן 3' UTRs, כולל גנים fusions בטווח 3' UTR, ואת המידע רצף יכול לשמש כדי לחזות אתרי קישור miRNA פוטנציאליים, כמו גם AU עשיר יציב אלמנטים שעשויים להשפיע על היציבות של התעתיק.

חיפוש מקוננים פריימר לפנים:
הג'ל agarose מ איור 1 מציג שני ברורים PCR ג'ל מוצרים (מסלולים 1 ו- 2) אשר השתמש אותו קדימה פריימר אלא תחל הפוכה שונים. 3 ליין יש מוצר ה-PCR ברורים ויש פריימר ואחורה ברורים. צבעי בסיס אידיאלי לשימוש עבור התגובה PCR מבוסס הם אלה שנותנים את מוצר ה-PCR נפרדים אחד (ליין 3). פריימר לפנים בשימוש מסלולים 1 ו- 2 נותן את הלהקה הכי חזק, נותן את המוצרים PCR הגדול (מצופה...

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את רצפי תעתיקי ה-mRNA מהקצה השלישי לאזורים בתוך אזור קידוד החלבון על ידי שימוש בפריימרים מקוננים ספציפיים לתעתיק בשני PCR עוקבים וריצוף תוצרי ה-PCR המטוהרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנטי, כגון קביעת אות הפוליאדנילציה, קודון העצירה והרצף של האזור הלא מתורגם בעל שלושת הראשונים של התעתיק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על כל תעתיק אם הרצף של האזור הקטן של מסגרת הקריאה הפתוחה הוא ההשלכה של טכניקה זו משתרעת לכיוון אבחון סרטן, מכיוון שהיא יכולה לזהות גנים ספציפיים לגידול וגרסאות חיבור.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר זיהינו תעתיקים חדשים עם אזורים לא מתורגמים שלא אופיינו בעבר. כדי להתחיל את הפרוטוקול, יש להפשיר את תערובת תאי הפנול והגואנידין איזותיוציאנט על קרח. לאחר ההפשרה, הוסף 100 מיקרוליטר כלורופורם לצינור המיקרו-צנטריפוגה במכסה המנוע PCR.מערבל את הדגימה למשך 10 עד 15 שניות עד שהתערובת ורודה ואטומה. לאחר מכן, דגרו את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות בחום של 20, 800 גרם וארבע מעלות צלזיוס.הסר בזהירות את השלב המימי חסר הצבע העליון והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, עברו למשקעים והוסיפו נפח שווה של איזופרופנול לדגימה. הוסף לדגימה מיקרוליטר א

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

ATAC-seq היא שיטת ריצוף DNA המשתמשת בטרנספוזאז מוטנטי היפראקטיבי, Tn5, כדי למפות שינויים בנגישות הכרומטין המתווכים על ידי גורמי שעתוק. ATAC-seq מאפשר לגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים בתאים סרטניים. פרוטוקול זה מתווה הליכי אופטימיזציה עבור ATAC-seq בסוגי תאי אפיתל, כולל תאים סרטניים.

אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

פרוטוקול זה מפרט מתודולוגיה לזיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון בקטעי רקמה משובצים פרפין קבועים בפורמלין.

קרטוגרפיה מולקולרית דו-מודאלית: שילוב זיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון

אירועי שחבור טנדם מתרחשים באתרים המרוחקים פחות מ-12 נוקלאוטידים זה מזה. כימות יחסים של גרסאות חיבור כאלה אפשרי באמצעות גישת PCR כמותית מוחלטת. כתב יד זה מתאר כיצד ניתן לכמת וריאנטים של הגן STAT3, שבהם שני אירועי שחבור מביאים להכללה/אי הכללה של Serine-701 ו-α/β C-termini.

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

למד את שיטת 3' RACE לזיהוי רצפי mRNA בסרטן באמצעות שימוש ב-DNA polymerases שונים ו-PCR מקונן. טכניקה זו מאפשרת למיפוי ORF, קודון עצירה ואזור 3' UTR בתאי סרטן.

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

גלה סרטונים נוספים