Name: הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: חקור שיטה לבידוד תאי איי הלבלב בעכברים לזיהוי כימיקלים משרים ROS ופוטנציאל סוכרתי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מעבדה של השפעות על הפרשת אינסולין מבוקרת גלוקוז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפרויקט טייס ממרכז CREH ממומן על ידי NIEHS ועל ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מספר 31572626).

ניסויים בבעלי חיים כל הוצאו להורג בדרישות ההנחיות הרלוונטיות כל, תקנות וגופים רגולטוריים. פרוטוקול להיות הפגינו בוצעה תחת הדרכה ואישור של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של טקסס A & M המכון ללימודי רפואה גנומית.
1. פתרון הכנה
<ol><li>לדלל תמיסת מלח מאוזנת של האנק x 10 ל- x 1 עם כפול מזוקקים H2O, ולאחסן ב 4 º C.</li>
	<li>הכינו את הפתרון בידוד על-ידי הוספת HEPES (10 מ מ), MgCl2 (1 מ מ) וגלוקוז (5 מ מ). להתאים את ה-pH ל 7.4 ולשמור על קרח.</li>
	<li>להכין את הפתרון collagenase מן collagenase Type 4. הערה: באופן ספציפי, collagenase Type 4 מכיל 160 U לכל מ ג של משקל יבש. 1 גר' collagenase Type 4 הוא מדולל 5 מ"ל כפול מזוקקים H2O עם ריכוז של 200 מ"ג/מ"ל. 2 מיליליטר Collagenase מדולל מתווסף 30 מ ל הקרח בידוד קר פתרון, 6 מ של פתרון collagenase מועבר שפופרת 50 מ עבור כל עכבר.</li>
	<li>הכינו את הפתרון שטיפת על-ידי הוספת 1 מ"מ CaCl2 הפתרון בידוד.</li>
	<li>הכינו את פתרון טיהור בעזרת פתרון diatrizoate polysucrose קר/נתרן (1.1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>להכין 500 מ"ל של איון תרבות בינוני על-ידי הוספת-גלוטמין (20 מ מ), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), סרום שור עוברית (FBS) (10%) לתוך RPMI בינונית.</li>
	<li>להכין את הפתרון DCFH-DA מניות על ידי המסת אבקה מים מזוקקים-200 מיקרומטר, חנות ב-20 ° C. הערה: האבחון מכתים הפתרון נעשה טרי על ידי דילול לפתרון מניות DCFH-DA הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר ב- RPMI. ריאגנט הזה צריך להיות מוגן מפני אור.</li>
</ol>2. ניתוח הכנה
<ol><li>Intraperitoneally להזריק (I.P.) עכבר עם avertin (2.5% avertin, 0.4 מ ל/20 גרם). אחרי העכבר הוא מורדם לחלוטין, כבר לא מגיב כדי הינד רגל צובט, המתת חסד בעכבר והזז מכסה המנוע ביולוגי.</li>
	<li>הנח את העכבר לאללה עם הצד הבטן פונה כלפי מעלה, לרסס את העור עם אתנול 70% עבור עיקור.</li>
	<li>פתיחת חלל הבטן עם 1 ס מ U-החתך על הבטן העליונה ומשכו את העור בכיוון rostral החזה כדי לחשוף את חלל הבטן.</li>
</ol>3. לבלב זלוף והסרה
<ol><li>כמופיע באיור1, למצוא את המיקום של ampulla. השתמש זוג מלקחיים מעוקל נכנעתי התריסריון קרוב המיקום של הסוגר של Oddi. להשתמש עוד זוג מלקחיים מעוקל תהדק את הקיר התריסריון כדי לחסום את המעבר מרה תריסריון. הערה: Ampulla לא הוכנס בשלב זה. שלב זה נועד לחסום את המעבר מרה תריסריון.</li>
	<li>למקם מחדש את העכבר עם הראש הפרוקסימלית ואת כפות הרגליים דיסטלי לגבי החוקר.</li>
	<li>למצוא את צינור המרה, לאט להזריק 3 מ"ל של collagenase פתרון בעזרת מזרק 5 מ ל ומחט 30 גרם. ודא שאת צינור המרה והלבלב הם בניפוח לאחר הזריקה.</li>
	<li>הסר את הלבלב נפוחה באמצעות מלקחיים מעוקל מספריים בסדר כדי להפרידו מן יורד קולון, המעיים, קיבה, טחול. למקם את הלבלב צינור 50-mL המכיל 3 מ"ל של פתרון collagenase ולשמור אותו בקרח.</li>
</ol>4. לבלב עיכול
<ol><li>מקם כל שפופרת 50-mL לתוך אמבט מים 37 º C. תקופת דגירה של 15-20 דקות (זמן משתנה עם זן, הגיל של העכברים).</li>
	<li>רטט הצינור באמצעות מערבולת.</li>
	<li>בריכה 4-5 הלבלב מתעכל במסננת גדולה כיור סטרילי והשתמש סקופ כדי להפוך הלבלב להתפרק ביסודיות. להשתמש בכוח pipette התאים מתעכל מהמסך 23 גרם 10 מ"ל ומחט המזרק המכיל שטיפת פתרון. לאסוף את הפתרון לשטוף בצינור 50-mL.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x 97 ב 4 ° C עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 25 מ של פתרון לשטיפת צינורות, מחדש להשעות את הרקמה על ידי עדין vortexing. ספין לאורך הרקמות ב g x 97 ב 4 ° C עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע. חזור על 3 פעמים. להיזהר לא להוציא את הרקמה pelleted.</li>
</ol>5. טיהור של איים קטנים
<ol><li>להוסיף 10 מ של פתרון טיהור בגדר רקמות שטף, resuspend בעדינות את התוכן.</li>
	<li>בעדינות כשכבת-על 5 מ של בידוד פתרון על הפתרון טיהור. הקפד לשמור על ממשק נוזלי חדה בין שני הפתרונות.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור 560 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם האצה איטית, בלי בלמים. להוסיף את פיפטה לתוך הממשק ולאסוף את השכבה איים קטנים לתוך צינורות 50 מ ל חדש.</li>
	<li>לשטוף את איונים כפי שמתואר בשלב 3.5.</li>
</ol>6. ציפוי וטיפול של תאי איון
<ol><li>Resuspend ע ב 10 מ"ל של איים קטנים תרבות פתרון מערבבים היטב ובעדינות במקום 100 µL טוב עם פיפטה רב-ערוצי על צלחת 96-ובכן. במקום כ 5 איים לכל 96. טוב.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה תרביות רקמה במשך 12 שעות.</li>
	<li>Centrifuge (112 x g) של צלחת 96-ובכן ולהסיר המדיום תרבות.</li>
	<li>לדלל כימיקלים סביבתיים במדיום תרבות איונים. להוסיף 100 µL של כל אחד מדלל כימי לתוך בארות נפרדים של הצלחת. Resuspend איים על כל היטב, תקופת דגירה של 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס (הריכוז משתנה לחומרים סביבתיים שונים).</li>
</ol>7. ROS מכתים ומדידה
<ol><li>לאחר הטיפול איונים, לשטוף עם PBS 1 x (200 µL עבור כל 96-ובכן). הערה: ריכוז הכימיקלים הוא כדלקמן: AFB1: 3 מיקרומטר, מסוג אטרזין: 100 מיקרומטר, BaP: 10 מיקרומטר, BPA: 100 מיקרומטר, β-אסטרוגן, PCB126: 10 מיקרומטר, Nonylphenol ו BPA: 100 מיקרומטר.</li>
	<li>השתמש N-אצטיל ציסטאין (NAC) כ נוגד חמצון כדי להרוות ROS. להוסיף 5 מ מ של NAC מדלל כימיות הנוצרות על-ידי ROS, תקופת דגירה של 12 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>Centrifuge את הצלחת 96-ובכן ב g 112 x, דגירה עם 5 מיקרומטר פתרון של בדיקה פלורסנט (H2-DCFH-DA מומס RPMI מדיה) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים איון שטופלו 3 פעמים עם PBS ולמדוד את זריחה עם קורא microplate-488 ננומטר. הערה: ההצטברות של DCF בתאים יכול להימדד על-ידי עלייה בזריחה ב- 530 ננומטר כאשר המדגם הוא נרגש-488 ננומטר.</li>
	<li>מבצע אינסולין הגלוקוז-גירוי הפרשת (GSIS) assay9 xenobiotic בתדר ROS מטופלים איונים ושל לא מטופל כדי למדוד את ההשפעות xenobiotic על תפקיד פיזיולוגי באיי לנגרהנס.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

לצבירת ראיות מציע כי החשיפה לכימיקלים סביבתיים ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות של T2DM. ROS ואינטראקציות-induced הוכר כגורם etiological פוטנציאליים, תורם להתפתחות של T2DM. בני אדם חשופים למגוון רחב של כימיקלים xenobiotic, ויש צורך גדול עבור מחקר חדשניים טכניקות לזיהוי ביעילות את הלבלב חשיפה לרעלים, לחקור את המנגנון של רעילות ספציפיים בתאי הלבלב.
במחקר זה, המבוסס על הנהלים שפורסמו14, פיתחנו פרוטוקול כדי לבודד לנגרהנס של עכבר ומסך התאים בכימיקלים xenobiotic עבור נזק חמצוני מפגינ...

עולה השכיחות של T2DM הפכו משבר הבריאות העולמי בשנים האחרונות פוזות איום רציני לבריאות הציבור1. גורמים רבים נמצאו להיות מקושר סיבתי הפיתוח של T2DM, ביניהם, חוזרות ממצאים מראים כי נקודה מתכנסת אחת נפוצה עבור גורמים אלה הוא אינדוקציה של סטרס חמצוני, מה שמוביל הדור של ROS מופרז2 , 3.
מגוון רחב של כימיקלים סביבתיים לרבות Pcb, דיוקסינים BaP נמצאה לזירוז סטרס חמצוני, אשר עלול לפגום את תפקוד תאי β בלבלב, להוביל תנגודת לאינסולין ו- T2DM4. למרות הרמה פיזיולוגיים של ROS ממלא תפקיד חשוב בתאיים, חשיפה ROS שחורג הקיבולת של המערכת נוגד חמצון מתבטא הנזק לרקמות/תאים ומוביל מחלות5. תאי β בלבלב אקספרס רמה נמוכה של אנזימים נוגדי חמצון, ולכן הם מטרה רגיש ביותר נזק בתיווך סטרס חמצוני6,7. חשיפה כרונית רמות גבוהות של ROS הוכח לגרום תאי הלבלב מפגינות תפקוד5 וכן לאינסולין בכבד, רקמת שומן8.
המטרה הכוללת של הפרויקט הזה היא לפתח הנועד מבוססת תא כימיקלים המסך שלהם פוטנציאל diabetogenic מבוסס על אינדוקציה שלהם של ROS בתאי הלבלב. הלבלב חסר רעלים מטבוליים, הוא מטרה רגיש הנזק הנגרמת xenobiotic6,7. לכן, על ידי מדידת ישירות את האבחון שנוצר בתאי הלבלב, וזמינותו הזה צריך לספק הערכה ישירה של הפגיעה הנגרמת כימית בלבלב. כדי לפתח שיטה זו, אנחנו מבודדים לנגרהנס עכבר תרבותי של איון מבודד בתנאי התרבות תאים עם כימיקלים, מנוצל הדור ROS כימית-induced כמו המדידה. ההליך זה פשוטה ויעילה בזיהוי בתדר ROS חומרים כימיים איון מבודדים; זה יכול להיות פיתוח נוסף לחקירה על מנגנוני רעילות ספציפיים הלבלב חוץ גופית בתוך.

<table><tbody><tr><td>10 פעמים; האנק' תמיסת מלח מאוזנת&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פוליסוכרוז/נתרן דיאטריזואט&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין עכברוש/עכבר ערכת ELISA</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>לצנטריפוגה צלחת 96 בארות</td></tr><tr><td>קורא Microplate</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>לקריאת פלואורסצנטיות</td></tr></tbody></table>

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון diabetogenic כימיקלים סביבתיים

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

חשיפה לכימיקלים סביבתיים מסוימים של האדם ובעלי חיים נמצאה לגרום נזק תאי של תאי β בלבלב אשר יוביל להתפתחות של סוכרת סוג 2 (T2DM). למרות המנגנונים על הנזק תאי β כימית-induced היה לא ברור, עשוי להיות מורכב, ממצא חוזרות אחד היא כי חומרים אלה זירוז סטרס חמצוני שמוביל הדור של מינים חמצן תגובתי מוגזמת (ROS) לגרום נזק התא β. כדי לזהות פוטנציאל diabetogenic כימיקלים סביבתיים, בודדנו תאי הלבלב איון של עכברים C57BL/6 ואיון בתרבית תאים ב 96-ובכן תא תרבות לוחות; לאחר מכן, התאים איון היו עצומות עם כימיקלים, הדור ROS אותרה על ידי 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) הפלורסנט. באמצעות שיטה זו, אנו נמצא כי ביספנול A (BPA), Benzo [א] pyrene (BaP) ולאחר polychlorinated biphenyls (PCBs), עלול לגרום לרמות גבוהות של ROS, רומז כי הם פוטנציאלי עלול לגרום נזק תאי איון. שיטה זו צריכה להיות שימושית עבור הקרנת diabetogenic ואינטראקציות. בנוסף, התאים בתרבית איון עשוי גם להיות מותאם לניתוח במבחנה רעילות כימית-induced בתאי הלבלב.

מיקרוסקופ של איון מבודד בריא מוצג באיור 2, שבה יש איים קטנים עגולים או אליפטיים צורה עם מדים יחסית לגודל (למרות אחידות הגודל יכול להשתנות זן זן). חקרנו את הפונקציות הלבלב איון assay במבחנה הבא מאת לבודד את איון והמרצת הפרשת אינסולין בלבלב ע תרבות. איור 3 מראה את ניתוח טיפוסי וזמינותו GSIS מ- C57BL/6 איונים העכבר מבודדת הנגרמת על ידי גלוקוז 3.3 מ מ ו- 16.7 מ מ9.
<p class="jove_content" fo:keep-...

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

תאי הלבלב הם מטרה רגישה לנזקים הנגרמים על ידי ROS, הקשורים להתפתחות סוכרת מסוג 2. בדיקות מבוססות תאי לבלב יסייעו בזיהוי כימיקלים הגורמים ל-ROS. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שימוש בתאי אי לבלב מבודדים לזיהוי פשוט ויעיל של הכימיקלים הגורמים ל-ROS שעשויים להיות בעלי פוטנציאל סוכרתי נוסף.שיטה זו יכולה לשמש גם לניתוח חוץ גופי על השפעות כימיקלים על תפקוד פיזיולוגי של הלבלב כגון הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז. השתמש בזוג מלקחיים מעוקלים כדי להדק את התריסריון קרוב למיקום הסוגר של אודי. בעזרת זוג נוסף של מלקחיים מעוקלים, מהדקים את דופן התריסריון כדי לחסום את נתיב המרה.מצא את צינור המרה המשותף ובעזרת מחט בגודל 30 ומזרק של חמישה מיליליטר, הזריק לאט שלושה מיליליטר של תמיסת קולגנאז. לאחר מכן, מקם מחדש את העכבר כשהראש פרוקסימלי וכפות הרגליים דיסטליות. ודא שצינור המרה המשותף והלבלב מנופחים לאחר ההזרקה.בעזרת המלקחיים המעוקלים והמספריים העדינים, הסר את הלבלב הנפוח כדי להפריד אותו מהמעי הגס היורד, המעיים, הקיבה והטחול. לאחר מכן, הניחו את האיבר בשפופרת של 50 מיליליטר המכילה שלושה מיליליטר של תמיסת קולגנאז ושמרו אותו על קרח. הכניסו כל צינור של 50 מיליליטר לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו עליהם למשך 15 עד 20 דקות.מערבל את הצינורות, ואז אסוף ארבעה עד חמישה איברים מעוכלים במסננת כיור סטרילית גדולה והשתמש בכף כדי לפרק היטב את הלבלב. בעזרת מחט בגודל 23 ומזרק של עשרה מיליליטר המכיל תמיסת שטיפה, הסר במרץ את התאים המעוכלים מהמסך. לאחר מכן, אספו את תמיסת הכביסה בצינור של 50 מיליליטר.צנטריפוגה של הצינורות ב-97 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ושפכו את הסופרנטנט. הוסף 25 מיליליטר תמיסת כביסה לצינורות, והשהה מחדש את הרקמה על ידי מערבולת עדינה. לאחר מכן, סובב את הרקמה ושפך את הסופרנטנט.חזור על הכביסה שלוש פעמים, הקפד לא לעקור את הרקמה הגלולה. כדי לטהר את האיים, הוסף עשרה מיליליטר של תמיסת טיהור לגלולת הרקמה השטופה והשהה בעדינות את התוכן. שכבו בעדינות חמישה מיליליטר של תמיסת בידוד על תמיסת הטיהור.ודא שנשמר ממשק נוזלי חד בין שני הפתרונות. צנטריפוגה של הצינור ב-560 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, עם תאוצה איטית וללא הפסקה. לאחר מכן, הכנס את הפיפט לממשק ואסוף את שכבת האי.העבירו את התמיסה לצינורות חדשים של 50 מיליליטר לפני שטיפת האי כפי שהודגם זה עתה. לאחר הסרת הכביסה הסופית, הוסיפו עשרה מיליליטר תמיסת תרבית איים וערבבו בעדינות וביסודיות כדי להשעות מחדש את האיים. לאחר מכן, באמצעות צינור רב ערוצי העבירו 100 מיקרוליטר לבאר לבארות של צלחת 96 בארות.דגרו את הצלחת בחממת תרבית רקמות למשך 12 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב-112 גרם והסר את מדיום התרבית. לדלל את הכימיקלים הסביבתיים במדיום גידול איים.הוסף 100 מיקרו ליטר מכל אחד מהמדללים הכימיים לבארות נפרדות של הצלחת. השעו מחדש את האיים בכל באר ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לאחר טיפול כימי באיים, השתמש ב-1x PBS כדי לשטוף את הדגימות.לאחר מכן, הוסיפו חמישה מילי-מולארי N-אצטיל ציסטאין או NAC לבארות, כנוגד חמצון כדי להרוות ROS ולדגור את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות במשקל 112 גרם לאחר מכן, הוסף תמיסה מיקרוטולרית של בדיקה פלואורסצנטית ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את תאי האי המטופלים שלוש פעמים והשתמש בקורא מיקרו-פלטות ב-480 ננומטר כדי למדוד את הקרינה.לבסוף, בצע את הפרשת האינסולין המעוררת גלוקוז, או בדיקת GSIS, על איים שטופלו בקסנוביוטיקה ולא טופלו על ידי ROS, כדי למדוד את ההשפעות הקסנוביוטיות על התפקוד הפיזיולוגי של איי הלבלב. מוצגים כאן איי לבלב בריאים, מבודדים מעכברי C57 Black/6, שצורתם עגולה או אליפסה וגודלם אחיד יחסית. בבדיקת GSIS זו, תוך שימוש באיים מבודדים המגורים בגלוקוז להפרשת אינסולין, נצפתה תגובה תלוית מינון.כאשר איים מבודדים טופלו בקסנוביוטיקה המפורטת כאן, מספר כימיקלים כולל אטרזין, BaP, BPA ו-PCB גרמו לאינדוקציה משמעותית של מיני חמצן תגובתיים. עם זאת, התוספת של NAC הצליחה להרוות את ייצור ה-ROS על ידי הטיפולים הכימיים. בנוסף, איי הלבלב שטופלו מראש ב-PCB126 ו-BPA הראו ירידה משמעותית בהפרשת האינסולין בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמאשר את התפקיד החשוב של ROS בגרימת נזק לתפקוד הפיזיולוגי של תאי בטא בלבלב שמוביל ל-T2DM.לאחר השליטה, ניתן לבצע את בידוד איי הלבלב תוך שעתיים אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה חשוב להשתמש בצנטריפוגה שיפוע כדי לטהר את האיים הרחק מפסולת הלבלב האחרת. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז על מנת לענות על שאלות נוספות כמו השפעות הכימיקלים על התפקודים הפיזיולוגיים של איי הלבלב.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטוקסיקולוגיה לחקור את הפוטנציאל הסוכרתי של הכימיקלים הסביבתיים בתאי אי לבלב מבודדים של עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את איי הלבלב של העכבר ולהשתמש בתאי האי הללו לזיהוי.

a-murine-pancreatic-islet-cell-based-screening-for-diabetogenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הלבלב Murine איילט בידוד

מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

אנו מתארים שיטה בידודו של תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט ואחריו רצפי RNA בתא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח של השושלת האנדוקרינית הלבלב פיתוח, תא dynamics הטרוגניות, transcriptomic.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי הלבלב של עכברוש לואיס, המאפשר הכנות בעלות תפוקה גבוהה וטוהר לשימוש ישיר בהשתלות או במחקרים במבחנה .

בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

שיטת אבולוציה מכוונת רומן ספציפית לתחום הנדסת thermostability פותחה וכתוצאה מכך תוקפת לאנזימי bacteriolytic. לאחר סיבוב אחד בלבד של mutagenesis האקראי, אנזים bacteriolytic התפתח, PlyC 29C3, מוצג יותר מכפולה מפעילות שיורית בהשוואה לחלבון פרא מהסוג לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה.

שיטת הקרנה חדשה לאבולוציה המכוונת של אנזימי Bacteriolytic Thermostable

חקור שיטה לבידוד תאי איי הלבלב בעכברים לזיהוי כימיקלים משרים ROS ופוטנציאל סוכרתי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מעבדה של השפעות על הפרשת אינסולין מבוקרת גלוקוז.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

גלה סרטונים נוספים