ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור קו דג זברה טרנסגני המאפשר התבוננות בשינויים חשמליים תאיים במהלך האמבריוגנזה, תנועת הזחלים ובהיווצרות הגידול. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית, הפיזיולוגיה והביולוגיה של תאי הסרטן כגון מהם התפקידים הבסיסיים של איתות חשמלי תאי במהלך אמבריוגנזה ובתאי גידול? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לעקוב אחר איתות חשמלי סלולרי in vivo ובזמן אמת.

לאחר הכנת ה-mRNA של טרנספוזאז Tol2 ותמיסת הזרקה על פי פרוטוקול הטקסט, אחר הצהריים לפני ההזרקה, הקימו ארבעה עד שישה מיכלי רבייה עם לפחות שני זכרים ושתי נקבות. כדי להפחית את כמות פסולת הדגים ולגרום לתגובת רבייה, הימנעו מהאכלת הדגים בשעות אחר הצהריים. למחרת בבוקר, הוציאו את תמיסת ההזרקה המוכנה מהמקפיא השלילי של 80 מעלות צלזיוס והניחו אותה על קרח.

משוך את המחיצות במיכלי גידול הדגים ואפשר לדגים להזדווג. באופן כללי, דגים מטילים ביצים תוך 20 עד 30 דקות. בזמן ההמתנה, בעזרת מושך מיקרופיפטה עם הפרמטרים הבאים, משוך מחטים מזכוכית נימית.

השתמש במגבון מעבדה כדי לשבור את קצה המחט וליצור קצה משופע. קוטר קטן יותר מועדף להפחתת תמותת עוברים. לאחר שהדגים הטילו ביצים, אספו אותן בצלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים.

מיד מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה, הסר את כל העוברים החריגים ופסולת הדגים. לאחר מכן פיפטה את העוברים המופרים לתבנית הזרקת אגרוז מוכנה של 3%. הסר עודפי מים כדי לעזור לשמור על העוברים במקומם.

לאחר שכל השורות מתמלאות בעוברים ברי קיימא, סדרו אותם כך שהתאים הבודדים כולם מכוונים בזווית אופקית של 45 מעלות ביחס למחט. זה יקל על ההזרקה הרבה יותר מאוחר יותר. לאחר מכן, תוך לבישת כפפות, השתמש בקצה פיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להסיר חמישה מיקרוליטר מהמבנה המוכן מהצינור על הקרח.

הכנס בזהירות את קצה הפיפטה לקצה האחורי של צינור הנימים השבור למקום שבו הוא מתחיל להתחדד כדי לקרב את המגיב לקצה ככל האפשר ולהוציא אותו לתוך הנימים. אם עדיין יש בועות אוויר, נער את המחט והקפד לא לשבור את הקצה. הכנס את המחט ישר למחזיק מחט הזרקת המיקרו והדק בזהירות עד שהמחט נשארת במקומה.

לאחר מכן התאם את הזווית לכ- 45 מעלות. לאחר הכנת המחט וחיבורה, הפעל את המיקרוסקופ ואת מיכל לחץ הגז. כוונן את עוצמת ההזרקה באמצעות כ-0.5 PSI לאחיזה ו-30 PSI לפליטה.

בדוק שהתמיסה נפלטת מהמחט בעת לחיצה על הדוושה. בעזרת מיקרומטר במה עם טיפת שמן מינרלי, התאם את נפח וזרימת התמיסה לקוטר של כ -10 מיקרומטר. ודא שהלחץ האחורי מאפשר לכמות קטנה של תמיסה לטפטף מהמחט.

אם אין מספיק לחץ אחורי, פעולה נימית תגרום לנוזל להיכנס למחט ולהרוס את ה-mRNA. לאחר כיול המחט, הכנס את המחט לתא הבודד של העוברים המופרים באמצעות קצה חריץ הג'ל כדי לספק גיבוי ששומר על העובר במקומו ומאפשר למחט להפעיל לחץ מבלי להזיז את העובר. ברגע שקצה המחט נמצא בתא הבודד, לחץ על הדוושה כדי לשחרר את כמות התמיסה הרצויה.

חשוב להזריק את התמיסה לתא, לא לחלמון, ליצירת דג זברה מהונדס. חזור על תהליך זה עבור כל העוברים. בסיום, השתמש בפיפטה העברה של 3.4 מיליליטר ומי מערכת דגים כדי להעביר את העוברים המוזרקים לכלי מסומן על ידי שטיפתם מחריץ האגרוז.

אחסן את העוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להם להתפתח. בדוק שוב במהלך היום כדי להסיר עוברי דגים מתים ולהחליף את המים ב-0.1% מתילן כחול במי דגים. כשש עד שמונה שעות לאחר ההזרקה, השתמשו ב-10 עוברי דגים שהוזרקו ובשיטת hotshot להכנת DNA גנומי.

למחרת בבוקר, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה עם מקור אור פלואורסצנטי כדי למיין את העוברים המראים GFP ברקמות שאינן חלמון. עוברים אלה צריכים להכיל את המבנה המוזרק. בצע בדיקת בלו Tol2 כדי לבדוק את פעילות הטרנספוזון כפי שתואר קודם לכן.

אם ניתן לזהות פלזמה שנכרתה, שמור את עוברי הדגים המוזרקים וגדל אותם. אחרת, חזור על סינתזת ה-mRNA של Tol2 ותהליך הזרקת המיקרו עד להשגת תוצאות חיוביות מבדיקת הבלו של Tol2. כדי לדמות עוברי דג זברה, הכלאה של דגי מייסד דור F2 מרובים עם דגי בר בזוגות בודדים.

אסוף עוברי דגים בשלבי התפתחות רצויים שונים על פי מדריך ההיערכות של דג הזברה. עבור עוברי דגים בשלב מוקדם במי מערכת הדגים, תחת טווח דיסקציה, השתמש בזוג מלקחיים כדי לקלף בזהירות ולהסיר את הכוריונים. השתמש בפיפטה להעברת סילוק כדי להעביר כמה עוברים למגלשת זכוכית קעורה עם 3% מתיל צלולוז.

לאחר מכן באמצעות מחט מתחת לטווח דיסקציה, התאם את העוברים למיקומים הרצויים כדי לראות את פעילות ה-GFP התאית. עבור עוברים בשלב של פחות מ-12 סומיטים, השתמש במיקרוסקופ תרכובת אפיפלואורסצנטי עם מצלמה ותוכנה תואמות להדמיה. עבור עוברים שעברו את שלב 12 הסומיטים, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטית.

כדי לדמות את מתח תאי הגידול, זהה תחילה דגים עם גידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים או MPNST. מניחים את הדג בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ ומבצעים הדמיה שלמה. לבסוף, לאחר ההדמיה, נתח את הגידול לפני צפייה בפעילות החשמלית של תאי הגידול.

בהזרקה מוצלחת, יותר מ-50% מהעוברים המוזרקים יציגו מידה מסוימת של GFP בתאים הסומטיים ורובם יראו תוצאה חיובית מבדיקת הבלו של טרנספוזון Tol2. כאן נבדקו שינויים פוטנציאליים בקרום לאורך מחזור התא במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת של דג הזברה. כפי שניתן לראות בסרטון זה, התאים עברו היפרפולריזציה לפני היווצרות תלם המחשוף.

יתר על כן, רקמות שונות הראו מגוון של פוטנציאל ממברנה בעוברי דגים בני יום עד שלושה ימים. לדוגמה, הסומיט והנוטוקורד היו בדרך כלל היפרפולריזציה בהשוואה לרקמות ולאיברים הסמוכים. בעובר דג זה בן יומיים, פעילויות חשמליות עצביות-שריריות מוצגות במהלך התנועה עם שינויים בצפיפות הצבע המתאימים להעברת האיתות החשמלי.

תכונות ביו-חשמליות של תאים סרטניים נבדקו בעוברים מהכלאות של דגים מדווחים ASAP1 עם מוטציה RPL35 הנוטה ל-MPNST ספונטני. בהשוואה לרקמות הסובבות, תאי הגידול היו מקוטבים יותר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקת הזרקת מיקרו זו תוך כשלוש שעות אם מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שעוברי דג הזברה צריכים להיות בשלב התא האחד לקבלת תוצאות אידיאליות. עם פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית וביולוגיה של התא לחקור שינויים באיתות חשמלי in vivo בדג הזברה ובאורגניזמים מודלים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור קו דג זברה טרנסגני על ידי הזרקת מיקרו.