טיטור אליסה כשיטה לקבוע את קבוע דיסוציאציה של קולטן ליגנד אינטראקציה
15 בפברואר 2018
פרוטוקול מפורט לביצוע טיטור אליסה מתואר. יתר על כן, באלגוריתם הרומן מוצג כדי להעריך טיטור ELISAs וכדי להשיג קבוע דיסוציאציה של איגוד של ליגנד מסיסים לקולטן צלחת. מרותק למיטה microtiter.
המטרה הכוללת של טיטרציית ELISA זו היא לקבוע את קבוע הזיקה של שני שותפים מחייבים בצורה מחזורית ויעילה באמצעות אלגוריתם חדש. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מרכזיות לא רק בתחום האינטראקציה של חלבון לליגנד ומחקר קולטנים, אלא גם במדעי החיים המיושמים כגון מחקר פרמצבטי ופרמקולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבוע בקלות את קבוע הזיקה של אינטראקציה בין קולטן לליגנד על ידי טיטור של קולטן עם ליגנד בצלחת ELISA ובאמצעות אלגוריתם הערכה חדש.
התחל את ההליך הזה על ידי דילול תמיסת האחסון של Integrin Alpha 2 A Domain לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למ"ל במאגר TBS מגנזיום כלורי. שני סוגי Integrin Alpha 2 A Domain, סוג טבעי ומטאנטי, ישמשו בהדגמה זו. מלאו כל באר של שורה על צלחת מיקרוטיטר בחצי שטח עם 50 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי Integrin Alpha 2 A Domain.
בצעו כל שורת טיטורציה לפחות בכפיליות. בדוגמה זו, כל שורת טיטורציה מתבצעת ברביעיות. אטמו את הצלחת בנייר כסף והשאירו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
ביום שלמחרת, הסירו את תמיסת הציפוי ומלאו כל באר עם 15 מיקרוליטר של מאגר TBS מגנזיום כלורי. הסירו את תמיסת השטיפה ומלאו את הבארות עם תמיסת שטיפה חדשה. השטיפות יסירו מולקולות קולטן מסיסות שלא נייצבו למשטח הפלסטיק על ידי ספיגה פיזית.
השלב הבא הוא לחסום אתרי קישור לא ספציפיים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של תמיסת BSA אחוז אחד במאגר TBS מגנזיום כלורי לכל באר. אטמו את הצלחת שוב וחממו בטמפרטורת החדר למשך שעה. בעת חסימת הבארות של צלחת המיקרוטיטר עם BSA, הכינו דילול סדרתי של הליגנד Rhodocetin.
במקרה זה משתמשים בריכוז התחלתי של 243 רודסטין מרוח באמייל וגורם דילול של 2.3. לשמונה עקומות הטיטורציה בניסוי זה, הכינו 920 מיקרוליטר של תמיסת רודסטין בריכוז הגבוה ביותר באחוז אחד BSA ב-TBS מגנזיום כלורי בצינור מספר אחת. פיטרו 520 מיקרוליטר של תמיסת BSA אחוז אחד ב-TBS מגנזיום כלורי לכל אחד מעשרת הצינורות האחרים המסומנים שניים עד אחד עשר.
העבירו 400 מיקרוליטר מתמיסת הרודסטין מצינור לצינור מספר שתיים. ערבבו את שתי התמיסות באמצעות ערבוב והעבירו 400 מיקרוליטר מהתערובת הזו לצינור מספר שלוש. המשכו בדילול הסדרתי עד צינור מספר אחד עשר.
להצלחת ההליך הזה, חשוב להמליא כל באר במהירות עם תמיסה כדי לוודא שהבארות לא מתייבשות. בסיום חממו למשך שעה, הסירו את תמיסת החסימה מבארות צלחת המיקרוטיטר. מיידית, הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת רודסטין מצינור מספר אחד לבארות של עמודה אחת, את התמיסה מצינור מספר שתיים לבארות של עמודה שתיים, והמשיכו דרך עמודה אחת עשרה.
הוסיפו 50 מיקרוליטר של BSA אחוז אחד ו-TBS מגנזיום כלורי כבקרה ללא ליגנד לבארות של עמודה שתים עשרה. אטמו את הצלחת שוב וחממו בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי. כדי להסיר מולקולות ליגנד לא מחוברות, הסירו את תמיסת הקישור ומלאו כל באר עם 50 מיקרוליטר של מאגר HBS מגנזיום כלורי.
לאחר מכן, הסירו את מאגר ה-HBS והוסיפו מאגר HBS חדש. כדי לתקן כימית את הקולטן והליגנד הקשור, מלאו כל באר של צלחת המיקרוטיטר עם 50 מיקרוליטר של תמיסת גלוטראלדהיד 2.5 אחוז במאגר HBS מגנזיום כלורי. חממו את צלחת המיקרוטיטר בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות.
הסירו ופעלו את עודף הגלוטראלדהיד על ידי הסרת תמיסת הקיבעון ומילוי כל באר עם 50 מיקרוליטר של מאגר TBS מגנזיום כלורי. הסירו את מאגר השטיפה והוסיפו מאגר שטיפה חדש לכל באר. כדי להתחיל את הבדיקה, הסירו את מאגר השטיפה מכל באר של צלחת המיקרוטיטר והוסיפו לכל באר 50 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדן העיקרי, מדולל אחד לאלפיים בא
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לביצוע טיטרציה ELISA לקביעת קבוע הזיקה של אינטראקציות קולטן-ליגנד. מוצג אלגוריתם חדש להערכת התוצאות ביעילות, המסייע במחקר אינטראקציות חלבון ופרמקולוגיה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביוכימיה
- פרמקולוגיה
רקע
- הבנת אינטראקציות קולטן-ליגנד חיונית בתחומים ביולוגיים שונים.
- שיטות מסורתיות עשויות לחסר ביעילות ובשיחזוריות.
- טיטרציה ELISA מציעה גישה שיטתית למדידת זיקות הקישור.
- אלגוריתם חדש משפר את הערכת הנתונים לדיוק טוב יותר.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לקביעת קבועי זיקה.
- להקל על מחקר באינטראקציות חלבון-ליגנד.
- לספק כלי ליישומים פרמצבטיים.
שיטות ששימשו
- דילול של תחום A של Integrin Alpha 2 במאגר TBS magnesium chloride.
- ציפוי צלחות מיקרוטיטר בתמיסת הקולטן.
- שימוש באלגוריתם הערכה חדש לניתוח נתונים.
- השוואה בין תחום A של Integrin Alpha 2 מסוג wild type ומסוג mutant.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת קביעה קלה של קבועי זיקה.
- התוצאות מדגימות שיחזוריות בין ניסויים שונים.
- האלגוריתם החדש מספק הערכות מדויקות של אינטראקציות הקישור.
- התובנות שהושגו יכולות להשפיע על מחקר פרמצבטי ומחקרים על קולטנים.
מסקנות
- שיטת הטיטרציה ELISA יעילה לחקר אינטראקציות קולטן-ליגנד.
- האלגוריתם החדש משפר משמעותית את יעילות ניתוח הנתונים.
- גישה זו יכולה לקדם מחקר במדעי החיים היישומיים השונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate determination of receptor-ligand dissociation constants is essential for target validation and lead optimization in drug discovery. This titration ELISA method, enhanced by a novel non-linear regression algorithm, enables reproducible affinity measurements without graphical estimation, supporting data-driven go/no-go decisions. The approach improves predictive confidence in early discovery by quantifying binding strength across ligand variants and receptor mutants.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables quantitative comparison of ligand binding affinity to wild-type and mutant receptors, supporting hypothesis testing of structure-activity relationships.
- Operational Value: Provides direct dissociation constant output from raw signal data, reducing variability in affinity ranking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized titration curves for multiple ligands simultaneously, enabling parallel screening of compound libraries against immobilized targets.
- Operational Value: Uses ELISA-compatible detection, allowing integration into existing immunoassay platforms for scalable affinity profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures binding-active receptor concentration alongside Kd, informing target engagement predictions in disease-relevant systems.
- Operational Value: Delivers statistically evaluable parameters from replicate titration curves, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative affinity data informs prioritization and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying how mutations or modifications alter ligand binding affinity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative binding signals that enable reliable compound evaluation across concentration ranges.
- Analytics: Outputs dissociation constant and receptor concentration via non-linear regression, providing comparable readouts for structure-activity analysis.
- Translational Research: Connects in vitro binding data to preclinical continuity by characterizing affinity shifts in mutant receptors relevant to drug resistance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for affinity profiling across diverse protein-ligand pairs, reducing reliance on low-throughput alternatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions through accurate, algorithm-driven Kd determination.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of affinity measurements across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid affinity ranking of ligands and mutants, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of drug candidates based on quantitative binding data and receptor engagement potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, ELISA techniques, and non-linear regression analysis using software such as GraphPad Prism.
- Dependent on access to microtiter plate readers, pipetting systems, and incubation controls for reproducible ligand titration.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, blocking agents, and fixation protocols to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different receptor-ligand pairs, particularly regarding immobilization efficiency and ligand stability.
- Includes practical limitations such as potential epitope disruption from glutaraldehyde fixation, which must be empirically validated for each target pair.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Immobilization of the Receptor (Integrin α2A-domain) to a Microtiter Plate
2:09
Preparation of a Serial Dilution Row of the Ligand (Rhodocetin)
3:25
Binding of Ligand at Different Concentrations to Immobilized Receptor
5:03
Quantification of Receptor-bound Ligand by ELISA
7:06
Evaluation of the Titration Signals
10:58
Conclusion
9:30
Results: Rhodocetin Binds with Lower Affinity to Mutant Integrin α2A-domain
