Name: בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: למד שיטה לבידוד נימים מוחיים אנושיים מרקמות טריות לחקר מחסום הדם-מוח. הפרוטוקול כולל הומוגניזציה, סרכוז בגרדיאנט צפיפות וסינון לקבלת נימים טהורים לניסויים פרמקולוגיים ומולקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ואנו מכירים ד ר פיטר נלסון, סוניה אנדרסון מהבנק רקמת המוח בבריטניה-ADC למתן כל המוח האנושי דגימות רקמה (NIH להעניק מספר: P30 AG028383 מן המכון הלאומי לזיקנה). אנו מודים האזרד מאט, טום דולאן, שירותי טכנולוגיית מידע, טכנולוגיה אקדמי, סגל האירוסין, אוניברסיטת קנטאקי לסיוע גרפי. פרויקט זה נתמך על ידי מענק 1R01NS079507 מספר מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו (כדי B.B.) ועל ידי גרנט 1R01AG039621 מספר מן המכון הלאומי לזיקנה (כדי A.M.S.H.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את ההשקפות הרשמי של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו או המכון הלאומי על הזדקנות. המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

המידע שלהלן מבוסס על תקני הרגולציה ב אוניברסיטת קנטאקי, בלקסינגטון, KY, ארה ב ובטיחות הנוכחי. כאמצעי בטיחות, עיין תוכנית בטיחות ביולוגית של המוסד ועל תקנות העדכני ביותר ואת המלצות לפני שעבדה עם רקמה אנושית.
התראה: רקמה אנושית יכולה להיות מקור של נישא בדם פתוגנים, כולל וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), וירוס הפטיטיס B (HBV), וירוס הפטיטיס C (בזכות) ואחרים. עבודה עם רקמה אנושית מהווה את הסיכון של הידבקות נישא בדם פתוגנים. לכן, שיקולים מסוימים התקינה והבטיחות הם הכרחי בעת עבודה עם רקמה אנושית כדי להגן על עובדי מעבדה. עבודה עם רקמה אנושית בארה ב דורשת מעבדה רמה 2 אבטחה, כמו גם אמצעי זהירות והדרכה בהתאם NIH חלק IV-B-7, OSHA מעשה 1970 הסעיף 5(a)(1) ותוכנית בטיחות ביולוגית מוסדיים של המשתמש. באופן כללי, יש להשיג אישור ועדת אבטחה מוסדיים ו/או מוסדיים המנהלים לפני כל מחקר מעורבים חומרים אנושיים (רקמות, נוזלי גוף). ההכשרה נדרשת עבור כל העובדים לעבוד עם חומרים אנושיים וכולל הדרכות בנושאי בטיחות מעבדה בסיסית, למשל, היגיינה כימי בטיחות מעבדה, וכן הכשרה ספציפית על בטיחות ביולוגית, פסולת מסוכנת, אדם נישא בדם פתוגנים. כל אנשי הצוות עובד עם חומרים אנושיים מומלץ מאוד לקבל חיסונים הפטיטיס B, עובדים עם חומרים אנושיים. אנשי נדרשות ללבוש ציוד מגן אישי ספציפי תוך כדי עבודה עם חומרים אנושיים, למשל., חלוק מעבדה קשורים באזיקים ופנים מגן, ללבוש כפפות בכל עת. כל העבודה מתבצעת ב- cabinet אבטחה (שיעור 2). כל הציוד מגיע מגע עם חומרים אנושיים, יותר פסולת מחומרים האדם מטופל כראוי כדי למנוע זיהום ו/או זיהום של כוח אדם. כל ציוד ומשטחים מנוקים עם 10% מלבין ו- 75% אתנול בעקבות כל הליך מעורבים חומרים אנושיים. נזילה עם חומרים אנושיים יש לנקות מיד. כלי זכוכית היא בלוק אחרי כל שימוש. פסולת, כולל רקמה אנושית מבולבל, הוא נאסף בתוך שק פסולת חומרים מסוכנים שכותרתו בלוק. שרפ נאספים במיכל פנצ'רים - והוא עמיד בפני נזילה שכותרתו כמו ותברואה. כל פסולת מחומרים האנושי מושלך על פי תקנות הבטיחות הביולוגי של המוסד.
הערה: המעבדה שלנו משיג החזיתית טריים דוגמאות מאנשים המנוח דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ'). קריטריוני ההכללה הם: הרשמה במחקר עוקבה הנתיחה האורך של בריטניה-ADC ו ≤4 פוסט-מורטם מרווח (PMI) של h64. נתיחות שלאחר המוות בצע פרוטוקול תקני, כל הפרוצדורות לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. PMI קצרה של פחות מ- 4 h יש חשיבות הגבוהה ביותר כדי להבטיח הכדאיות נימי לאחר בידוד. ניתן להשתמש רקמות טריים וקפואים. אם הקפאה זה נחוץ, רקמת המוח האנושי טרי צריך להיות הלם-קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. רקמות טריים או המופשרים צריך להיות מאוחסן במאגר בידוד (ראה להלן), לעבד במהירות. אנו מוצאים את 10 גרם של רקמה אנושית טריים התשואות בערך 100 מ ג של נימי הדם במוח (משקל רטוב).
1. הגדרת
<ol><li>
הכנת מאגר הערה: הנפח של מאגר הדרושים תלוי כמות הרקמה. כל אמצעי האחסון מאגר בפרוטוקול הבאים מבוססים על 10 גרם של רקמת קליפת המוח האנושי.<ol>
<li>L מאגר בידוד: להשתמש 1.5 ליטר תמיסת מלח של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS; מ מ 2.7 אשלגן כלורי, מ"מ 1.47 אינץ ח'2PO4, 136.9 מ מ NaCl, 8.1 מ"מ נה2HPO4, 0.9 מ"מ CaCl2, 0.49 מ מ MgCl2) והשלמה עם 5 מ מ D-גלוקוז (1.35 g ) ו פירובט נתרן 1 מ מ (0.165 g). לאחר הוספת הסוכר ו פירובט, להתאים את ה-pH 7.4 עם נתרן הידרוקסידי. מגניב ולאחסן את המאגר כדי 4 ° C לפני השימוש.</li>
		<li>אלבומין שור (BSA): להוסיף 10 גרם של אבקת BSA 1 ליטר בידוד המאגר כדי ריכוז BSA הסופי של 1%. מערבבים לאט כדי להימנע בועות, להתאים את ה-pH 7.4 לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מיד לפני השימוש, מערבבים בעדינות; הימנע ויוצרים בועות כדי למנוע דנטורציה אלבומין.</li>
		<li>צפיפות בינונית הדרגתיות: שוקל 18 גרם צפיפות בינונית הדרגתיות לתוך בקבוק זכוכית, להוסיף פס מגנטי מערבבים. להוסיף 60 מ של בידוד מאגר ומנערים נמרצות במשך 5 דקות עד כל אבקת מושהה. חנות בן לילה ב 4 ° C כדי לאפשר המדיום הדרגתיות צפיפות להתמוסס. מערבבים במשך 10 דקות לפני השימוש.</li>
		<li>לאחסן כל מאגרי ב 4 ° C; שמור כל מאגרי בקרח וכלים במהלך ההליך כולו בידוד. מוסיפים את כל מאגרי לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגדרת הניסוי
	<ol>
<li>לטעון את שהעקב של מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem על גבי קדירות תקורה אלקטרונית. המקום פוטר-Elvehjem רקמות מטחנות, את מהמגן דאונס עם המרוסקים על קרח מתחת למכסה המנוע. הכנת רשת סינון מיקרומטר 300 (5 x 5 ס מ2), קפלו אותו לחצי קונוס, ולא להוסיף ולחבר אותו 50 מ ל בז צינור עם קלטת (איור 1 א').</li>
		<li>המקום מחברים הטבעות וסלולרי המתח מסננים (גודל הנקבוביות: 30 מיקרומטר) על צינורות בז 50 מ ל. להכין שקיות פסולת ותברואה. הכנס כל נדרש ציוד אבטחה ארון (ראה טבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. המוח הכנת הדוגמא
הערה: איור 1A מציג את התרשים זרימת עבודה הליך הבידוד כולה המתוארים להלן. רקמת המוח האנושי יכולה לנבוע מכל חלק של קליפת המוח, והוא יכול לשמש טרי או קפוא. יכול להיות הקרת רקמת מוח קפוא בטמפרטורת החדר (אין מאגר; ~ 30 דקות עבור 10 גרם). כדי להשיג תוצאות דומות, רקמת המוח צריכה להתקבל מאזור המוח זהה עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה ממוטבת עבורו טריים (PMI < 4 h) קליפת אדם זה לא מוקפא.
<ol><li>הכנה של רקמת המוח האנושי: לתעד את המשקל של רקמת המוח. כל המספרים בפרוטוקול הבא מתאימים עבור 10 גרם של רקמת המוח האנושי טריים. מקם את רקמת המוח 100 מ מ פטרי. הסר בזהירות את כל קרומי המוח עם מלקחיים. השתמש באזמל כדי לחתוך את החומר הלבן.</li>
	<li>הא של רקמת המוח האנושי: בזהירות לחתוך את רקמת המוח, מינצ זה עם אזמל. האוהב למשך בערך 5 דקות (מ מ 2-3 חתיכות). להעביר את רקמת המוח מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem. להוסיף 30 מ של מאגר בידוד. הערה: חתיכות רקמה טחון קשים מאז רקמת המוח הופך לדייסה בתהליך mincing.</li>
</ol>3. המגון
<ol><li>מטחנות רקמות פוטר-Elvehjem (סיווג: 150-230 מיקרומטר): Homogenize כל מדגם במשיחות 100 במהירות מהמגן של 50 סל ד. המסמך הזמן כל 25 ומילוי הזמן הכולל הדרוש עבור 100 קווים. ראה טבלה 1 עבור פרוטוקול המגון המוצע; הזמן הכולל עבור homogenizing 10 גרם של קליפת האדם הוא כ- 22 דקות. לא לעורר באוויר כדי למנוע בועות.</li>
	<li>מהמגן דאונס (סיווג: 80-130 מיקרומטר): להעביר את homogenate מהמגן דאונס על קרח. Homogenize התליה במשיחות 20 (~ 6 s/קו, סך ~ 2 דקות). להימנע בועות.</li>
</ol>4. צנטריפוגה
<ol><li>להפיץ את homogenate המוח באופן שווה לתוך ארבעה צינורות צנטריפוגה 50 מ ל, המסמך הנפח הכולל של homogenate. להפיץ 50 מ של מאגר הדרגתיות צפיפות לתוך הצינורות צנטריפוגה (מ"ל למחזור). השתמש 10 מ"ל של בידוד מאגר לשטוף את שהעקב ואת מהמגן, ולהפיץ לתוך צנטריפוגה ארבעה הצינורות (~2.5 mL למחזור).</li>
	<li>סגור בחוזקה את צינורות צנטריפוגה עם כמוסות. מערבבים את homogenate צפיפות בינונית הדרגתיות, מאגר ע י ניעור נמרצות הצינורות. צנטריפוגה ב x 5,800 g למשך 15 דקות ב 4 ° C (זווית קבועה רוטור); בחר מהירות בינונית ההאטה לשמור בגדר לחבר את הצינור. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה ב 2 מ של 1% BSA.</li>
</ol>5. סינון
הערה: כדי להפריד בין הנימים לבין תאי דם אדומים ופסולת תאים אחרים, מספר פעולות סינון נחוצים.
<ol><li>רשת מיקרומטר 300: לאחר מחדש השעיית בגדר, לסנן את המתלים מבעד לרשת מיקרומטר 300. נימים מסוננים דרך הרשת, ואילו כלי גדול ופסולת המוח גדולים יותר להישאר על רשת השינוי. לשטוף היטב את רשת השינוי עם עד 50 מ של 1% BSA. למחוק את רשת השינוי. הערה: שלב סינון זה מנקה את המתלה נימי מכל כלי גדול יותר או נתחי המוח פסולת.</li>
	<li>
מסנן מתח התא 30 מיקרומטר הערה: שלב סינון זה מפריד נימים של כדוריות דם אדומות ושרידים נוספים במוח.<ol>
<li>להפיץ את פילטרט של נימי מהשלב 6.1 על המסננים זן תא חמש 30 מיקרומטר (בערך 10 מ"ל של פילטרט של נימי לכל תא המתח מסנן). נימים מתקיימים בחזרה על ידי מסנן זה, בעוד תאי דם אדומים, אחרים תאים בודדים, ופסולת מוח קטן לעבור דרך המסנן ולאחר שנאספו ב פילטרט.</li>
		<li>לשטוף כל מסנן עם 25 מ של 1% BSA. לאחר מכן שופכים filtrates כל המסנן השישי כדי להגדיל את התשואה. לשטוף כל מסנן עם 50 מ של BSA 1%; לשמור התא המתח מסננים עם המכיל הנימים וזורקים את פילטרט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. אוסף נימי
<ol><li>הפוך את המסננים ולשטוף את נימי הדם עם 50 מ של BSA 1% עבור כל מסנן לתוך צינורות 50 מ. בעדינות הפעילו לחץ עם קצה pipet pipettor מ ל ולהעביר אותה על פני המסנן כדי לשטוף את נימי הדם במוח.</li>
	<li>ודא לשטוף את כל הנימים המוח, במיוחד מן השפה של המסנן. להימנע בועות מאז זה מקשה תהליך הסינון, מגדילה את הסיכוי לאובדן נימי.</li>
</ol>7. כביסה
<ol><li>לאחר איסוף הנימים, centrifuge כל דוגמאות ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C (מנופף דלי רוטור). הסר את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות את צניפה כ 3 מ"ל של מאגר בידוד. לשלב את כל כדורי resuspended מהדגימה אחד צינור חרוטי 15 מ"ל ולמלא אותו מאגר בידוד. צנטריפוגה שוב ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C, לשטוף פעמיים נוספות.</li>
	<li>המסמך טוהר נימי עם מיקרוסקופ (100 X הגדלה), המצלמה (איור 1B). הערה: המוח התשואה נימי מ- 10 גרם של רקמת המוח האנושי הוא בדרך כלל כ- 100 מ ג. הנימים המוח מבודדים יכול כעת לשמש לניסויים, מעובד (למשל., lysate, בידוד קרום), או להיות קפואה, המאוחסנת ב- 80 ° C ב- cryotubes למשך תקופה מינימלית של 6 – 12 חודשים (למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של נימי הדם במוח האדם ללא שינוי בר -קיימא מרקמות טריים. בסעיף זה, נדון בפירוט את הפעולות הבאות: 1) שינויים בפרוטוקול, 2) פתרון בעיות של שגיאות נפוצות, 3) מגבלות של הטכניקה, 4) המשמעות של המודל ביחס הקיימת לבין מודלים חלופיים שיטת, ו- 5). יישומים אפשריים עבור המוח האנושי מבודד נימים.
הפרוטוקול המתואר כאן ממוטב 10 גרם של רקמת טריים החזיתית אנושי. עם זאת, היא פשוטה יחסית לשנות הליך זה: 1) פחות או יותר מ- 10 גרם של רקמת, רקמת המוח 2) קפוא או רקמת המוח 3) מאזור המוח ...

מחסום הדם - מוח הוא ממשק פיקוח הדוק בין הדם לבין המוח שקובע מה נכנס ומה יצא המוח. מבחינה אנטומית, תאי אנדותל להלחין את מחסום הדם - מוח וצורות מורכבות, רציף לרשת הנימים. מבחינה פיזיולוגית, רשת נימי זו מספקת את המוח עם חמצן וחומרים מזינים בזמן בו זמנית חיסולו של פחמן דו-חמצני, חומרי פסולת מטבולית. חשוב לציין, ראיה תומכת כי השינויים המכשול לתרום פתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר, אפילפסיה, שבץ מוחי1,2,3,4,5 , 6 , 7. המוח תאי אנדותל גם לשמש מחסום לטיפול על ידי חסימת ספיגת התרופה לתוך המוח, למשל., כימותרפיה של גליובלסטומה בעקבות הגידול כריתה8,9, 10. בהקשר זה, המוח האנושי מבודד נימים מייצגים ייחודי שמחוץ מחסום הדם - מוח מודל הדומה מכשול מאפיינים ויוו, מה שמאפשר עבור המחקר של המכשול ותפקוד לקוי בבריאות ומחלות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול לבודד נימים המוח של המוח האנושי באיכות נימי בעקביות גבוהה, תשואה ללמוד את מחסום הדם - מוח.
בשנת 1969, Siakotos et al. 11 היו הראשונים לדווח את ניתוקה של נימי הדם במוח של רקמת המוח שור ואנושי שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה וזכוכית חרוז עמודה ההפרדה. גולדשטיין. מאוחר יותר, et al. 12 חל שיפור בשיטה זו על-ידי הוספת שלבים מרובים סינון כדי להקטין את כמות רקמת צריך ללמוד נימים המוח מבודד חולדות, תוך שמירה על פעילות חילוף החומרים של הגלוקוז תחבורה. מאז, חוקרים אופטימיזציה ההליך בידוד נימי פעמים רבות, שיפור המודל נימי שיטת והמוח עם כל איטרציה13,14,15. לדוגמה, Pardridge et al. 16 מבודד שור נימים באמצעות עיכול אנזימטי במקום מכני המגון ולאחר מכן עברה השעיה נימי דרך מסנן רשת מיקרומטר 210 ו עמודה חרוז זכוכית. לבצע שינויים אלה משופרת הכתם הדרה trypan blue של נימי הדם במוח מבודד, לפיכך, גדלה הכדאיות תא אנדותל. בתחילת שנות התשעים, Dallaire et al. 17 מבודדים נימים שור, חולדה היו ברורות של זיהום עצביים ומתוחזק פעילות חילוף החומרים של γ-glutamyl transpeptidase (וγ-GTase), אלקליין פוספטאז. בשנת 2000, מילר ואח. 18, המשמש עכברוש מבודד, המוח חזירי נימים בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית להראות ההצטברות של סובסטרטים תחבורה לתוך לומן של נימים. לאחר מכן, המעבדה שלנו ממשיכה לייעל את ההליך בידוד נימי המוח, הקמנו מבחני תחבורה כדי לקבוע P-גליקופרוטאין (P-gp)19,20,21, סרטן השד ההתנגדות חלבון (BCRP)22,23, ו רב תרופתיים חלבון 2 (Mrp2) פעילות תחבורה24 . בשנת 2004, פרסמו שני דוחות כאן היינו מבודדים עכברוש המוח נימים לחקור איתות המסלולים השונים. ב- Hartz ואח. 21, מצאנו כי ה-פפטיד endothelin-1 במהירות, הפיכה צמצם P-gp תחבורה פונקצית נימים המוח על ידי משחק דרך endothelin קולטן B (ETB) קולטן, תחמוצת החנקן סינתאז (NOS), חלבון קינאז C (PKC). ב. באוור et al. 19, להדגים ביטוי של הקולטן pregnane X קולטן גרעיניים (PXR), הראה PXR-אפנון של P-gp הביטוי ואמצעי התחבורה פונקציה של נימי הדם במוח. בניסויים עם העכברים הטרנסגניים PXR humanized, אנחנו הרחיבה את הקו הזה של מחקר והראו ויוו הידוק של המכשול באמצעות upregulating קולטני P-gp באמצעות הפעלת hPXR25. בשנת 2010 Hartz ואח. 26 להשתמש בגישה זו לשחזר P-gp חלבון ביטוי ולהעביר פעילות בעכברים חלבון (מא) הטרנסגניים קודמן עמילואיד אנושי זה overexpress בשמחה. יתר על כן, שחזור P-gp ב מא עכברים הקטינה באופן משמעותי עמילואיד ביתא (Aβ)40ו- Aβ42המוח רמות.
בנוסף למדתי איתות המסלולים, נימים המוח מבודדים ניתן לקבוע שינויים בחדירות נימי אשר אנו מתייחסים כאל זליגת נימי. בפרט, וזמינותו זליגת טקסס האדום משמש כדי להעריך את דליפת הפלורסנט טקסס האדום של לומן נימי לאורך זמן נתונים אלה משמשות לאחר מכן לנתח את זליגת המחירים. המחירים זליגת נימי מוגברת בהשוואה לאלו של שליטה נימים מצביעים על שינויים שלמות פיזית מחסום הדם - מוח2. זה חשוב כי יש מצבי מחלה רבים הקשורים עם מחסום הפרעה, למשל., אפילפסיה, טרשת נפוצה, אלצהיימר, מוח טראומטית פציעה27,28,29, 30. קבוצות אחרות גם נעזרו נימים מבודד להבחין איתות המסלולים המווסתים ביטוי חלבון ופעילות התחבורה של חלבונים31,32,33,34, 35,36,37. בסופו של דבר, המשכנו למטב את שיטה זו עבור בידודו של המוח האנושי נימים ו, לאחרונה, הראנו ביטוי מוגבר של P-gp-האדם מחסום הדם - מוח בחולים עם אפילפסיה בהשוואה לאנשים ללא פרכוס שליטה38 . התפתחויות אלה יחדיו, מדגימים כי המוח מבודדים נימים יכול לשמש מודל רב תכליתי ללמוד מכשול פונקציה.
שונים ויוו, ex-vivo, ומודלים במבחנה מחסום הדם - מוח שימשו מחקר בסיסי, תעשייתי והתרופות הקרנה, בעיקר עם המטרה של בדיקת משלוח הסמים המוח39,40,41 ,42,43,44. בנוסף מבודד שמחוץ נימים המוח, המודלים הנוכחיים של מחסום הדם - מוח כוללים סיליקו מודלים, במבחנה תרבית תאים של תאי אנדותל נימי המוח מבודדים או שורות תאים מונצחים מ שונים מינים, in vitro לקשרי תרבות של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) כי להבדיל לתוך תאי אנדותל נימי המוח, ומודלים microfluidic על שבב.
אין סיליקו מודלים משמשים בדרך כלל פיתוח תרופות לבחירת המועמדים סמים המבוסס על הקליטה החזוי, הפצה, חילוף החומרים ומאפיינים הפרשה (גלית נחמני). שיטות כגון מבנה כמותית-מאפיין יחסים (QSPR) מודלים ודגמים היחסים (QSAR) מבנה כמותית-פעילות הן השיטות הפופולריות בשימוש תפוקה גבוהה ההקרנה של ספריות לחזות המוח חדירה של מועמדים סמים 45 , 46. מודלים אלה שימושיים מסך מולקולות למאפייני חדירה מכשול.
Betz. et al. 47 נוסדה monolayers של תאי אנדותל נימי המוח מתורבתות כמו מערכת מודל מחסום הדם - מוח במבחנה . במבחנה תא תרבות מודלים באמצעות רקמות טריים או קווים מונצחים תא אנדותל כגון תאי אנדותל microvessel במוח האנושי (hCMECs) יכול להיות עוד כלי ההקרנה תפוקה גבוהה עבור המוח חדירה או מחקרים מכניסטית. עם זאת, של התרבות תאי אנדותל נימי מוח חסר גזירה הפיזיולוגיות של זרימת הדם בתוך נימי לומן מוגבלים בסיבוכיות הכולל וחיסונים, עוברים שינויים בביטוי, לוקליזציה של רכיבים חשובים מכשול כגון חלבונים צומת חזק, קולטנים משטח, שנאים, אנזימים, יון ערוצי48,49,50. לעומת זאת, monolayers אנדותל נגזר hPSCs, יש חדירות נמוכה סוכרוז לעומת תרבויות hCMEC/D3, מכילים את הביטוי מקוטב של מובילי מחסום הדם - מוח מסוימים, מולקולות אדהזיה צמתי צר51, 52. עם זאת, תאים אלה קיימת גם שינוי מאפיינים בתרבות, המערכת יש לאמת עבור שלה רפריזה ויוו מכשול מאפיינים52.
מגמות חדשות בחקר מחסום הדם - מוח כוללים ניצול מערכות תרביות רקמה תלת-ממד כדי ליצור נימים מלאכותי, באמצעות הטכנולוגיה איברים על שבב לייצר מכשירים microfluidic, או ניצול הטכנולוגיה הולופייבר53, 54 , 55. נימים מלאכותיים, עם זאת, יש קטרים גדולים משמעותית (200-100 מיקרומטר) מאשר המוח נימים (3-7 מיקרומטר). לפיכך, ההטיה כוחות במבחנה לא לגמרי דומים המצב ויוו . זה נשלח בהתקנים microfluidic "blood-brain-barrier-on-a-chip", שבו שאוב ממברנות מלאכותיות טופס "דם", "המוח" תאים ונוזלים דרך התקנים אלה לייצר כוחות גזירה microfluidic. באופן דומה, תרבויות המשנה של תאי אנדותל בשילובים שונים עם האסטרוציטים ותאים השריר החלק בכלי הדם היו בשימוש גם עם הטכנולוגיה הולופייבר ליצור מחדש נוכח תחת ויוו תנאים56 rheological פרמטרים , 57 , 58. עם זאת, לא ברור עד כמה המודל הזה משקף מאפיינים נוספים של מחסום הדם - מוח כגון תחבורה, חילוף החומרים, איתות, ואחרים. מודלים מלאכותיים אלה נים ו- chip מתאימים להקרנה תפוקה גבוהה של סמים, אבל התאים המשמש ליצירת מודלים אלה הם גם עשויים להשתנות במהלך תרבות.
פרוסות המוח מוקפאים ולא קבוע או מוח ראשוניים תא אנדותל נימי שהתרבויות דגמים נוספים יכול לשמש כדילחקור את microvasculature האנושית5,59,60,61. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה של רקמת המוח קבוע משמש לקביעת חלבון לוקליזציה, ביטוי בריא לעומת רקמות חולות.
בנוסף רקמת פרוסות הדגמים במבחנה המוח תוארו לעיל, טרי מבודד נימים יכול להיות מנוצל כדי לחקור פונקציה מחסום הדם - מוח. מגבלות של מודל נימי מבודד זה כוללים את הקושי להשיג רקמת המוח האנושי טריים, היעדר האסטרוציטים הנוירונים ואת תהליך בידוד יחסית זמן רב. יתרון של המודל נימי המוח מבודדים היא כי מודל זה הדומה המצב ויוו , לפיכך, יכול לשמש כדי לאפיין את מחסום ותפקוד לקוי. חשוב, זה יכול לשמש גם להבחין מנגנוני איתות באמצעות שפע של מבחני ו טכניקות מולקולריות3,19,62,63.
המעבדה שלנו יש גישה אל רקמת המוח האנושי טריים וקפואים שני דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ')64. בהקשר זה, בצע נתיחות שלאחר המוות פרוטוקול תקני, המוח מתקבלים ב < 4 שעות ולאחר כל ההליכים לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. בהתחשב גישה ייחודית זו רקמת המוח האנושי, אנו נוסדה, אופטימיזציה פרוטוקול לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי שתוצאתו תשואה גבוהה של נימי הדם במוח האדם ללא פגע, מעשית. שתי נקודות הקצה נפוץ עניין הן לקבוע את ביטוי חלבון ופעילות. בהקשר זה, אנו ואחרים הקימו מבחני שונות, יכול לשמש עם נימים המוח מבודדים ללמוד ביטוי חלבון ו רמות הפעילות. מבחני אלה כוללים סופג המערבי, מערביים פשוטים assay, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), zymography, מבחני פעילות תחבורה, ו מבחני זליגת נימי. מבחני אלה לאפשר לחוקרים ללמוד שינויים בתפקוד מכשול בתנאים פיפטות האדם לקבוע מסלולים המפקחים על ביטוי חלבון ופעילות, לזיהוי מטרות תרופתי לטיפול של מחסום הדם - מוח הקשורים מחלות.
נלקח יחד, טרי המוח מבודדים נימים יכולים לשמש כמודל לשחזור ועמיד של מחסום הדם - מוח. במיוחד, מודל זה יכול להיות משולב עם מבחני שונות רבות כדי לקבוע מגוון רחב של נקודות קצה ללמוד מכשול פונקציה.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד מגן אישי (PPE)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אחיזת יהלום בתוספת כפפות לטקס, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>PPE</td></tr><tr><td>מעילי מעבדה מגן חד פעמיים</td><td>VWR, Radnor, PA, ארה"ב</td><td>470146-214</td><td>PPE; בשל אופיו של חומר המקור האנושי, מומלץ להשתמש במעיל מעבדה חד פעמי</td></tr><tr><td>מגן פנים, חד פעמי</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>19460102</td><td>PPE; בשל אופיו של חומר המקור האנושי, מומלץ להשתמש במגן פנים חד פעמי</td></tr> חומרי <tr><td>בטיחות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies שקיות חיטוי בטמפרטורה גבוהה 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>נייר ספסל יבש Versi 18 אינץ' x 20 אינץ'</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>14-206-32</td><td>לכיסוי אזורי עבודה</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>75800-272</td><td>לאזמל משומש</td></tr><tr><td>אקונומיקה 8.2% קוטל חיידקים קלורוקס 64 אונקיות.</td><td>מרכז האספקה הבריטי, לקסינגטון, קנטקי, ארה"ב</td><td>323775</td><חזק>ציוד</חזק>4 &deg<td></td></tr><tr><td></td>;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> C מקרר</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 מד pH</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, ארה"ב</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscope</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, ארה"ב</td><td></td><td>משמש להסרת קרומי המוח</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td><td>Kinematica AG, לוצרן, שוויץ</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>קנה מידה P-403</td><td>Denver Instrument, בוהמיה, ניו יורק, ארה"ב</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>מיני Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks חנקן נוזלי Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>המשמש להקפאת הרקמה?</td></tr><tr><td>וויאג'ר פרו איזון אנליטי</td><td>OHAUS, פרסיפני, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, ארה"ב</td><td></td><td>משמש לבדיקת נימים מבודדים</td></tr> <tr><td><כלים חזקים>כלים וכלי זכוכית</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II פיפטה 1-5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>21377823T1</td><td>לשטוף נימים פילטר</td></tr><tr><td>Finnpipette II פיפטה 100-1,000 ומיקרו; L</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"</td>ב <td>21377821T1</td><td>להשעות גלולה ב- BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, הדסון, NH, ארה"ב</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות פלקון 25 / מתלה - 500 / cs</td><td>VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל EISCO</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"</td>ב <td>S95938C</td><td>לטחון רקמת מוח</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>52858-000</td><td>לכיסוי ובקבוק נפחי</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>21-377-304</td><td>לשטיפת נימים ממסנן</td></tr><tr><td>מזרק 60 מ"ל עם Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>BD309653</td><td>בשימוש עם טבעת מחבר לסינון נימים</td></tr><tr><td>ידית אזמל #4</td><td>כלי מדע עדין, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>10060-13</td><td>המשמש לטחינת</td></tr><tr><td>מלקחיים של דומונט #5</td><td>כלי מדע עדין, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>11251-10</td><td>המשמש להסרת קרומי המוח</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Potter-Elvehjem</td><td>תומאס סיינטיפיק, סוודסבורו, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>3431E25</td><td>נפח 50 מ"ל, חיסול: 150-230 &mu; m</td></tr><tr><td>Dounce הומוגנייזר</td><td>VWR, Radnor PA ארה"ב</td><td>62400-642</td><td>נפח 15 מ"ל, מרווח: 80-130 &mu; m</td></tr><tr><td>מסננים ארוגים ספקטרה/רשת (300 ומיקרו; m)</td> <td>מעבדות ספקטרום, רנצ'ו דומינגז, קליפורניה, ארה"ב</td><td>146424</td><td>משמש לסינון מתלים נימיים להסרת כל קרומי המוח שעלולים להישאר</td></tr><tr><td>פלורימסננים (גודל נקבוביות: 30 ומיקרו; m)</td><td>pluriSelect Life Science, לייפציג, גרמניה</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>טבעת מחבר</td><td>pluriSelect Life Science, לייפציג, גרמניה</td><td>41-50000-03</td><td>שימוש חוזר רב פעמי</td></tr><tr><td>1 ליטר בקבוק</td><td></td><td></td> נפחי <td>להכנת חוצץ בידוד</td></tr><tr><td>1 ליטר</td><td></td><td></td> להכנת <td></td></tr><tr><td>מוט</td><td></td><td></td> <td>ערבוב 1% BSAלהכנת 1% BSA ו-Ficoll&reg; בקבוק </td></tr><tr><td>Schott (60 מ"ל)</td><td></td><td></td> <td>להכנת Ficoll&reg; דלי </td></tr> <tr><td>קרח</td><td>כדי לשמור על הכל קר</td>צלחת פטרי 100 מ"מ לטחינת רקמת המוח מגרד תאים תרבית רקמות VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב 89260-222 להסרת סופרנטנט לאחר צנטריפוגה <חזק>כימיקלים < / חזק >BSA Fraction V, A-9647 סיגמא-אולדריץ', St.<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> לואי, מיזורי, ארה"</td>ב <td>A9647-500 גרם</td><td>מכינים ב-DPBS עם Ca2+ & Mg2+ יום קודם. הימנע מבועות במהלך ההכנה. מאחסנים במקרר. יש לערבב לאט במשך 10 דקות לפני השימוש.</td></tr><tr><td>DPBS עם Ca2+ & Mg2+</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - חלק ממאגר הבידוד</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>F4375</td><td>מדידה מדויקת חשובה כאן. שקלו בבקבוק עם מוט ערבוב. יש לנער במרץ לאחר הוספת DPBS. שומרים במקרר O/N. יהיה בהיר בבוקר. יש לערבב בעדינות במשך 10-15 דקות לפני השימוש. יש לשמור על קרח עד לשימוש.</td></tr><tr><td>גלוקוז (D-(+) דקסטרוז)</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>G7528</td><td>גלוקוז (D-(+) דקסטרוז) ריכוז: 5 מ"מ</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד תמיסה סטנדרטית</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>71474</td><td>להתאמת ה-pH של DPBS</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>P2256</td><td>ריכוז: 1 מ"מ</td></tr></tbody></table>

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

הבנת מחסום הדם - מוח הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological הוא קריטי עבור הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות להחזיק את ההבטחה לשיפור משלוח סמים המוח, לשפר את המוח הגנה, מתייחסים המוח הפרעות. עם זאת, לומד את הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח הוא מאתגר. לפיכך, יש צורך קריטי עבור מודלים המתאימים. בהקשר זה, נימים המוח מבודדים מרקמות המוח האנושי מייצגים כלי ייחודי כדי ללמוד מכשול לתפקד קרוב המצב האנושי ויוו ככל האפשר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד נימים מרקמות המוח האנושי-תשואה גבוהה ועם איכות עקבית וטוהר. נימים מבודדים מרקמות המוח האנושי טריים באמצעות המגון מכני, צפיפות-הדרגה צנטריפוגה סינון. לאחר הבידוד הנימים המוח האנושי יכול לשמש ליישומים שונים כולל מבחני דליפה, הדמיה תא חי המבוסס על החיסון מבחני ללמוד ביטוי חלבון, פונקציה, פעילות אנזים או איתות תאיים. המוח האנושי מבודד נימים הם מודל ייחודי התירי ברגולציה של הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח. מודל זה יכול לספק תובנות לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) פתוגנזה, אשר יסייע לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית.

ומשום מרקמות המוח האנושי תשואות השעיה מועשר בתמציות המוח האנושי נימים (איור 1B) עם כמויות קטנות של כלי שיט גדולים יותר, תאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת תאים מסוימים. כמה נימים מסתעפות, ו, בחלק, תאי הדם האדומים הם לכודים בתוך נימי לומן. נימי טיפוסי יש קוטר מיקרומטר 3 – 7 והוא כ 100-200 מיקרומטר הרבה זמן עם לומן פתוח; רוב קצוות נימי מכווצות. המוח האנושי מבודד נימים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, לחשוף מבנה צינורי, שלם עם מורפולוגיה. <strong class="xfig"...

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר מחסום דם-מוח, כגון תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח, דליפת מחסום ומסלולי איתות ספציפיים למחסום הדם-מוח האנושי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחקור נימי מוח אנושיים שלמים ופעילים פיזיולוגית שבודדו מרקמת מוח אנושית טרייה. כדי להתחיל בהליך זה, תעד את משקל רקמת המוח האנושית, שאמור להיות כ -10 גרם.מתחת למיקרוסקופ, הסר בזהירות את כל קרומי המוח בעזרת מלקחיים והשתמש באזמל כדי לחתוך את החומר הלבן. לאחר מכן חותכים בזהירות את רקמת המוח וטוחנים אותה בעזרת אזמל למשך כחמש דקות. העבירו את רקמת המוח למטחנת הרקמות והוסיפו 30 מיליליטר של מאגר בידוד.לאחר מכן, הומוגניזציה של כל דגימה ב-100 פעימות ב-50 סל"ד. אין לערבב באוויר כדי למנוע בועות. תעד את הזמן כל 25 פעימות ואת הזמן הכולל הדרוש ל-100 פעימות.לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט להומוגניזטור Dounce על קרח. הומוגניזציה של המתלה למשך כ -20 פעימות והימנע מבועות. לאחר מכן מחלקים את המוח באופן שווה לארבעה צינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר.ותעד את הנפח הכולל של ההומוגנאט. הקפד להוסיף את עוצמת הקול הנכונה של Ficoll. מעט מדי או יותר מדי Ficoll יגרום לצפיפות שגויה להפרדת נימים מפסולת תאית ובכך יפחית את לוח הנימים ויגביל את התפוקה.השתמש ב-10 מיליליטר של מאגר בידוד כדי לשטוף את העלי וההומוגנייזר ולהפיץ אותו לארבעת צינורות הצנטריפוגה. לאחר מכן, הפיצו 50 מיליליטר של מאגר שיפוע צפיפות לצינורות הצנטריפוגה. סגור היטב את צינורות הצנטריפוגה עם כובעים.לאחר מכן מערבבים את המדיום ההומוגני, שיפוע הצפיפות והמאגר על ידי ניעור נמרץ של הצינורות. צנטריפוגה בעוצמה של פי 5,800 מכוח הכבידה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש כל כדור בשני מיליליטר של 1% BSA.לאחר השעיית הגלולה, סנן את המתלה דרך רשת 300 מיקרומטר. נימים מסוננים דרך הרשת, בעוד שכלי דם גדולים יותר ופסולת מוח גדולה יותר נשארים על הרשת. שוטפים בזהירות את הרשת עם עד 50 מיליליטר של 1% BSA.לאחר מכן השליכו את הרשת. כדי להפריד את הנימים מתאי דם אדומים ופסולת מוחית אחרת, פזרו את תסנין הנימים על פני חמישה מסנני מתח תאים של 30 מיקרומטר. נימים מעוכבים על ידי מסנן זה, בעוד שתאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת מוחית קטנה עוברים דרך המסנן ונאספים במסנן.לאחר מכן שטפו כל פילטר עם 25 מיליליטר של 1% BSA. יוצקים את כל המסננים על המסנן השישי כדי להגדיל את התשואה. שוטפים כל פילטר עם 50 מיליליטר של 1% BSA.שמור על מסנני מתח התאים המכילים את הנימים והשליך את המסנן. לאחר מכן הפוך את המסננים ושטוף את הנימים עם 50 מיליליטר של 1% BSA לצינורות של 50 מיליליטר. הפעל בעדינות לחץ עם קצה הפיפטה והעבר אותו על פני המסנן כדי לשטוף את נימי המוח.הקפידו לשטוף את כל נימי המוח במיוחד משפת המסנן. הימנע מבועות, מכיוון שהדבר מקשה על תהליך הסינון ומגדיל את הסיכוי לאובדן נימים. לאחר איסוף הנימים, צנטריפוגה את כל הדגימות בכוח הכבידה פי 1,500 למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בכשלושה מיליליטר של מאגר בידוד. לאחר מכן שלב את כל הכדורים התלויים מדגימה אחת בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומלא אותו במאגר בידוד. שוב צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 1,500 למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ושטיפה פעמיים נוספות.תעד את טוהר הנימים במיקרוסקופ בהגדלה פי 100 ובמצלמה. נימי המוח המבודדים יכולים כעת לשמש לניסויים, לעבד או להקפיא בזק ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס בקריוטיובים למשך שישה עד 12 חודשים לפחות. איור זה מציג תמונת אור משודר מייצגת של נימי מוח אנושיים עם פריציט מחובר ותא דם אדום בלומן.נימי המוח האנושי המבודדים הוכתמו חיסונית ל-PGP באמצעות C219 כנוגדן העיקרי והגרעינים הוכתמו ב-DAPI. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מאובדן נימים במהלך שלבי פיפטינג וסינון כדי להבטיח תשואה נימית טובה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בנימי מוח אנושיים מבודדים למגוון רחב של מחקרים כגון מחקרים פרמקולוגיים ופיזיולוגיים, כמו גם מחקרים גנומיים, פרוטאומיים וצלומיים.טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחסום הדם-מוח לחקור את תפקוד המחסום בנימי מוח אנושיים קרוב ככל האפשר למצב האנושי in vivo. אל תשכח שעבודה עם רקמת מוח אנושית מהווה סיכון לזיהום מפתוגנים הנישאים בדם. יש לנקוט באמצעי בטיחות, כגון לבישת מעיל מעבדה, מגן פנים וכפפות, כמו גם טיפול בדגימות רקמה במצב BSL-2 בזמן ביצוע הליך זה.

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מציג את הבידוד של כלי דם זעירים ממוח חולדה באמצעות שילוב של צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות ומהוד עיכול אנזימטי. את כלי הדם המבודדים ניתן לגדל בתרבית בבקבוק תרבית המצופה מראש במטריצת קולגן ופיברונקטין כדי להשיג מושבות תאי אנדותל.

תרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה: הליך לבידוד ותרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה

בסרטון זה אנו מדגימים את ההליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום תאי אנדותל.

בידוד ותרבית של פריציטים ראשוניים במוח: הליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום בתאי אנדותל

סרטון זה מציג את הבידוד של נימי מוח מוחיים מרקמת מוח אנושית טרייה. לאחר מכן ניתן להשתמש בנימים המבודדים כדי ליצור מודל מחסום דם במוח ex vivo.

בידוד נימי מוח ממוח האדם: שיטה אופטימלית לחילוץ נימי מוח מרקמת מוח אנושית

סרטון זה מדגים בידוד של כלי דם שלמים ממוחו של עכבר המהווים את מחסום הדם-מוח (BBB) יחד עם תאי עצב ותאי גלייה. כלי הדם המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה כדי לחקור את תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס מוחי.

בידוד כלי דם במוח של עכבר: פרוטוקול לבידוד כלי דם שלמים מדגימת מוח מורין

סרטון זה מדגים את בידוד הנימים ממוחות חזיריים טריים. התהליך כולל הסרת קרומי המוח, בידוד החומר האפור מרקמת המוח, הומוגניזציה וסינון של החומר האפור כדי לבודד את הנימים, ולבסוף שימוש בעיכול אנזימטי כדי לטהר את הנימים עוד יותר.

טיהור נימים ממוח חזירי

סרטון זה מדגים את תהליך בידוד כלי הדם במוח מחולדות שעברו המתת חסד. הוא כולל דיסקציה של המוח, ניקוי הרקמה, ועיכול מכני, ואחריו צנטריפוגה חוזרת ונשנית כדי לבודד את החלק הטהור של microvessels.

שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.

טיהור של כלי מוח עכבר

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור לבידוד של עורקים תוך-מוחיים (קבוצת כלי דם הכוללת עורקים פרנכימליים, עורקים חודרים ועורקים קדם-נימיים) מעכברים, לשימוש במיוגרפיה בלחץ, אימונופלואורסצנטי, ביוכימיה ומחקרים מולקולריים.

בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

כתב היד הנוכחי מפרט כיצד לבודד היפובין ונימים ממוח העכבר וכיצד ללחוץ אותם על מיגרפיה ללחץ, immunofluorescence ביוכימיה, מחקרים מולקולריים.

Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

pericytes נימי המוח הם שחקנים חיוניים ברגולציה של תכונות מחסום דם - מוח וזרימת דם. פרוטוקול זה מתאר כיצד pericytes נימות המוח יכול להיות מבודד, תרבותי, מאופיין ביחס לסוג התא והגיש בקשה לחקירות של סידן תאי איתות עם בדיקות פלורסנט.

תרבות של פריציטים נומי מוח למדידות סידן ציטוסולית מחקרי הדמיית סידן

למד שיטה לבידוד נימים מוחיים אנושיים מרקמות טריות לחקר מחסום הדם-מוח. הפרוטוקול כולל הומוגניזציה, סרכוז בגרדיאנט צפיפות וסינון לקבלת נימים טהורים לניסויים פרמקולוגיים ומולקולריים.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

גלה סרטונים נוספים