פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות לאורך תהליכים דינמיים בנמטודות בוגרות בתנאים סביבתיים מבוקרים למעקב אחר תגובות התנהגותיות של תולעים וקינטיקה של ביטוי גנים של תולעים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי האופן שבו בעלי חיים מסתגלים לשינויים בסביבתם, כולל הבדלים בהתנהגויות הליבה, ביטוי גנים, זיכרון ולמידה. טכניקה זו מאפשרת תצפית אורכית מרובה של בעלי חיים בודדים בסביבות מבוקרות דינמית, כמו גם דגימה בו זמנית של היבטים מרובים של הסתגלות ברזולוציה גבוהה.

ההשלכה של טכניקה זו משתרעת לעבר הבנה כמותית של הסתגלות בעלי חיים, שכן רכישת נתונים קינטיים ברמת דיוק גבוהה יכולה להקל על מודלים מתמטיים וניסוח ובדיקה של השערות מורכבות. כדי להגדיר את המכשיר להליך, חבר תחילה את קצה מזרק היציאה לחתיכת צינור מזרק בגודל 50 סנטימטר. כדי ליצור מחט מתאם, השתמש בצבת כדי למשוך את פיר המחט מרכזת המחט של מחט בגודל 20 על חצי אינץ' והשתמש במבער Bunsen כדי להסיר את שאריות הפלסטיק שנותרו.

החזק את שני קצוות המחט בעזרת צבת, כופף את מחט המתאם בהתאם לגיאומטריה של מערך הניסוי וחבר את המחט באמצע הדרך לקצה השני של צינור מזרק היציאה. לאחר מכן, חבר קצה מזרק כניסת חיץ אחד ישירות לשסתום תלת כיווני וחבר מזרק כניסת חיץ לחתיכת צינור מזרק באורך מטר אחד. הכנס את מחט המתאם באמצע הדרך לקצה הפתוח של הצינור, חבר את מזרק החלפת החיץ לחתיכת צינור מזרק בגודל 50 ס"מ דרך קצה המזרק.

חבר את צינור המזרק ליציאה הנותרת של השסתום התלת-כיווני וסגור את השסתום. בעזרת מחט מתאם, חבר את מזרק כניסת התולעת לחתיכת צינור מזרק באורך מטר אחד כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, שטפו את כל החומרים פעמיים עם S-medium ומלאו את המזרקים והצינורות השטופים ב-S-medium טרי, תוך הקפדה על הסרת בועות אוויר.

כעת, חבר את צינור מזרק השקע לשקע המכשיר וחבר את מחט המתאם בקצה צינור מזרק היציאה ליציאת היציאה. הזרקו נפח קטן של S-medium דרך השקע כדי למלא את המכשיר עד ש-S-medium יוצא הן מכניסות המאגר והן מכניסת התולעת. חבר את צינור מזרק כניסת החיץ ליציאת כניסת החיץ של המכשיר וחבר את כניסת התולעת עם סיכת דיבל מנירוסטה בקוטר שלושים שניות של אינץ'.

התקן את המכשיר המיקרופלואידי על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם במה ממונעת והדביק משאבת מזרק לשייקר ליד המיקרוסקופ כך שהמשאבה לא תתנועע בזמן הטלטול. לאחר מכן, טען את מזרק כניסת החיץ על משאבת המזרק והגדר את המשאבה לספק זרימה רציפה של מדיום S לתוך המכשיר בקצב זרימה של שלושה מיקרוליטר לדקה. כדי להעמיס את החיידקים למכשיר המיקרופלואידי, טען תחילה מזרק חדש עם תרחיף בצפיפות גבוהה של E.coli OP50.

סובב את המזרק אנכית, והקש על הקנה מספר פעמים כדי לאסוף את כל בועות האוויר בחלק העליון של המזרק. כבה את שייקר המסלול וסגור את השסתום התלת-כיווני של מזרקי כניסת החיץ. החלף את מזרק כניסת החיץ במזרק העמוס בחיידקים ודחף החוצה את כל האוויר שנאסף בחלק העליון של המזרק עד שמעט מהתרחיף החיידקי נכנס למערכת חילופי החיץ ולא נשארות בועות במזרק הטעון OP50 או בשסתום.

כשהשסתום סגור, חבר את המזרק העמוס בחיידקים למשאבת המזרק והפעל את שייקר המסלול. הגדר את מהירות הרעידות לכ-200 סל"ד ואת קצב הזרימה ל-100 מיקרוליטר לדקה. לאחר שמאגר ה-OP50 התפשט בכל המכשיר, הגדר את קצב הזרימה בחזרה לשלושה מיקרוליטר לדקה.

כדי להעמיס את המכשיר בנמטודות, מלאו תחילה צינור מיקרו-צנטריפוגה בעל קשירה נמוכה בנפח 650 מיקרוליטר ב-100 מיקרוליטר של תרחיף OP50 טרי, והשתמשו בפיק תולעים כדי להעביר בנפרד 20 עד 30 תולעים בוגרות צעירות המסונכרנות עם הגיל מצלחת אגר בינונית לגידול נמטודות לצינור. מלאו את מזרק כניסת התולעת וצינור המזרק בתרחיף OP50 טרי והזריקו כ-500 מיקרוליטר של תרחיף לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, משוך את תרחיף התולעת לתוך צינור מזרק כניסת התולעת וחבר את מזרק כניסת התולעת לכניסת התולעת.

הזריק את כל התולעים דרך צינור מזרק כניסת התולעת לתוך המכשיר המיקרופלואידי ונתק את מזרק כניסת התולעת ואת צינור המזרק. חבר את כניסת התולעת בעזרת סיכה ונתק את מזרק כניסת החיץ מהמשאבה המכנית. השתמש במזרק כניסת החיץ כדי להזיז ידנית את התולעים לתוך התעלות, ובמזרק היציאה כדי להפוך את תנועת התולעת לפי הצורך.

העמסת החיות דורשת תיאום מסוים. השתמש בלחיצות עדינות על בוכנות המזרק כדי ליישר קו יחד עם התעלה ודחיפה מעט חזקה יותר כדי להניע את התולעת עד הסוף. לאחר מכן, תנו לתולעים להסתגל לסביבה החדשה שלהן במשך שעתיים-שלוש לפני תחילת הניסוי.

התולעים מוגבלות לתעלות שלהן, אך הן אינן משותקות. רוב התולעים יישארו בערוצים שלהן למשך הניסוי, אך חלקן עשויות לברוח או להסתבך במיקרו-סדקים. כאן ניתן לצפות בתמונות שדה בהירות של תולעת בודדת מייצגת במשך עשר שעות במכשיר.

באמצעות תולעים טרנסגניות המבטאות GFP תחת מקדם התגובה החיסונית 1, לאחר זיהום P.Aeruginosa, PA14, ביטוי GFP נצפה באמצע הגוף ובזנב של התולעת במהלך חמש השעות הראשונות של החשיפה לפתוגן, ועולה לביטוי חזק של כל הגוף במהלך חמש השעות הבאות. שרטוט הקרינה הכוללת של כל תולעת כפונקציה של הזמן שלאחר ההדבקה ממחיש את הדינמיקה של השראת גן התגובה החיסונית הראשון, כמו גם את השונות בין תולעת לתולעת בתזמון ובהיקף האינדוקציה. הדמיית טיים לאפס של הביצים שהטילו התולעים בכל ערוץ מאפשרת לשרטט את המספר המצטבר של הביצים שהטילה כל תולעת כפונקציה של הזמן שלאחר ההדבקה ולוכדת את השונות של בעל החיים לבעלי חיים כמו גם את הירידה הנגרמת על ידי פתוגן בהטלת הביצים ככל שהזיהום מתקדם.

לאחר השליטה, ניתן להכין את המכשיר המיקרופלואידי ולהעמיס אותו תוך שעה. לאחר טעינת המכשיר והתולעים מתאקלמות, ניתן להעביר לתולעים ריאגנטים אחרים כגון תרופות ספציפיות או רמזים כימיים מעניינים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי שליטה במערכות עצביות וגנטיות של נמטודות. לאחר פיתוחה, אנו ומשתפי הפעולה שלנו השתמשנו בטכניקה זו כדי לנתח התנהגויות האכלה של נמטודות כמו גם תגובות גנטיות של תולעים לזיהום בהלם חום ורעב במגוון סביבות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתמש במכשיר מיקרופלואידי לביצוע מאמרים אורכיים.