Name: פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למד הדמיה מיקרופלואידית לאורך זמן של תהליכים דינמיים ב-Caenorhabditis elegans. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות ותיעוד ביטוי גנים ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מענקים PHY-1205494 ו- MCB-1413134 (EL) ועל ידי 2017R1D1A1B03035671 המענק של קרן המחקר הלאומי של קוריאה (KSL).

להלן הפרוטוקול משתמשת WormSpa5, מכשיר microfluidic שתואר קודם לכן עבור הדמיה האורך של תולעים. פבריקציה נוספת של WormSpa (החל עם קבצי CAD שניתן להשיג מן המחברים על פי בקשה) היא פשוטה אך דורש מומחיות כלשהי. ברוב המקרים, פבריקציה נוספת יכול בקלות להיעשות באמצעות מתקן ליבה או באמצעות חברה מסחרית המספק שירותים כאלה. כאשר בדיית המכשיר, הקפד לציין הגובה של התכונות הם 50 מיקרומטר.
1. הגדרת הניסוי
<ol><li>לטעון את המכשיר microfluidic על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך עם שלב ממונע.</li>
	<li>המקום של תפקודי לב / נשימה קרוב המיקרוסקופ, אך לוודא שהרטט מהמכשיר ניעור אינה משפיעה ישירות המיקרוסקופ. לדוגמה, לשים ניעור על מדף קבוע על הקיר שגורם שום קשר עם השולחן האופטי.</li>
	<li>במקום מזרק משאבה על ניעור מסלולית. קלטת את המשאבה על אהבת בשייקר כך זה לא מנענעת תוך טלטול.</li>
</ol>2. הכנת הסביבה Microfluidic
הערה: במהלך הניסוי, מזרקים ארבעה מחוברים למכשיר microfluidic דרך צינורות מזרק, כמתואר באיור1. שלב זה מתאר את הכנת מזרקים אלה. אלא אם צוין אחרת, לשמור על הצינורות מזרק קצר ככל האפשר מבלי לבצע אותם מתוח.
<ol><li>להכין מזרק עודפים של צינור מזרק. המזרק (S1 באיור1) מאוחר יותר להיות מחובר לשקע של המכשיר דרך הצינורית מזרק, המשמשים לאחסון זמני של נוזל יוצא המכשיר.<ol>
<li>להפוך את המחט מתאם על-ידי הסרת חלקי פלסטיק של קצה המזרק 20 G x 1/2 אינץ ', להשאיר רק את המחט (החלק מתכת). לעשות זאת באמצעות החזקת חלקי פלסטיק, מתכת עם צבת ומושך אותם בנפרד. שאריות פלסטיק הנותרים המחט יכול להיות נשרפו בעזרת מבער בונזן.</li>
		<li>לכופף את המחט לפי הצורה הגיאומטרית של ההתקנה ניסיוני תוך החזקת שני הקצוות שלה עם צבת. עיצוב המתוארים כאן, כיפוף המחט במרכזו בזווית של ° ~ 110 הוא הנוח ביותר.</li>
		<li>חבר את המחט מתאם בחצי הדרך ברכבת התחתית. החצי השני מאוחר יותר להיות פקוק לתוך המכשיר. הצינור מזרק צריך להיות תואם עם טיפ מזרק 20 גרם ללא דליפה (לדוגמה, אבובים עם הקוטר הפנימי של 0.86 מ מ, הקוטר החיצוני של 1.32 מ מ). אורך צינור המומלץ הוא ~ 50 ס מ.</li>
		<li>להתחבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (פתוח) בצד השני של הצינור מזרק דרך tip מזרק 20 G x 1/2 אינץ '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מאגר-כניסת מזרקים, מזרק צינורות. אחד אלה מזרקים (S2 באיור1) משמש מאגר נוזל נכנס לתוך המכשיר, כדי לשלוט בזרימה הזרקה. המזרק אחרים (S3 באיור1) דרוש עבור מאגר exchange, כפי שהוסבר ב 3.2 שלב.<ol>
<li>חבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S2) ישירות ל- 3-דרך שסתום וחבר אחר מזרק (S3) לשסתום באותה דרך צינור מזרק (איור 1): להתחבר S3 הצינור דרך tip מזרק, לחבר הצינור לשסתום באמצעות מזרק עצה נוספת. הערה: לא משנה הסדר שבו חומרים אלה מחוברים.</li>
		<li>חבר צינור מזרק ליציאת הנותרים של השסתום 3-way. להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2, ולחבר את המחט במחצית הדרך השני (פתוח) של הצינור מזרק.</li>
		<li>להגדיר את השסתום כך הצינור מזרק שלב 2.2.2, S2 מחוברים בזמן S3 סגורה (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מזרק תולעת-כניסת צינור מזרק. המזרק (S4 באיור1) משמש עבור טעינת תולעים לתוך המכשיר.<ol>
<li>חבר צינור ארוך מזרק מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S4). לקבוע את אורך הצינור הזה מאמצעי האחסון של נוזל ישמש עבור טעינה; לדוגמה, 100 ס מ של אבובים תומך מעל 2 מ ל נוזל (ראה גם שלב 4.2).</li>
		<li>להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2 וחבר אחד חצי של המחט לקצה השני (פתוח) של הצינור מזרק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף כל מזרקים, אבובים עם S-בינוני12 פעמיים. למלא את המזרקים, הצינורות S-בינוני, מקפיד להסיר את כל הבועות אוויר.</li>
	<li>לחבר את הצינור מזרק עודפים שקע המכשיר.<ol>
<li>חברו את המחט מתאם בסוף הצינור מזרק ליציאת ה-outlet.</li>
		<li>להזריק נפח קטן של S-בינוני עד ששקע כדי למלא את המכשיר, עד S קטן-בינוני יוצא לים מאגר והן לים תולעת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתחבר הצינור מזרק מאגר-כניסת יציאת מאגר-כניסת של המכשיר, תוך חיבור לים-התולעת עם סיכה (סיכת פינים נירוסטה בקוטר 1/32 אינץ).</li>
	<li>מזריקים זרם קבוע של מאגר לתוך המכשיר. לטעון את המזרק מאגר-כניסת S2 אל משאבת מזרק13, והגדר את המשאבה כזה כי המדיום ב S2 ברציפות מוזרק לתוך המכשיר בקצב הזרימה של µL 3/min.</li>
</ol>3. להעמיס את חיידקים לתוך המכשיר Microfluidic
<ol><li>להכין OP50 Escherichia coli מושעה S-בינוני12.<ol>
<li>בעקבות פרוטוקול תקני, לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב30 מ"ל של S-בינוני.</li>
		<li>לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. למדוד את ריכוז חיידקים על ידי צפיפות אופטית שלה ב 600 nm (OD600), ולהתאים את ריכוז יתר600 של 3. צפיפות גבוהה זו נדרשת כדי לשמור את התולעים מוזן היטב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חילופי המאגר את ההתקן עם המתלה OP50.<ol>
<li>להכין מזרק נקי (S5) מלא את המתלים OP50. . תחזיק את המזרק אנכית, הקש על זה מספר פעמים כדי לאסוף את כל הבועות אוויר בחלק העליון.</li>
		<li>סובב את השסתום 3-way מזרקים מאגר-כניסת לסגור את החיבור להתקן, וחבר את שתי מזרקים, S2, S3. ולהיבלע S2 משאבת מזרק.</li>
		<li>נתק S2 השסתום וחבר S5 לשסתום. לדחוף את כל האוויר הנאסף בחלק העליון של S5 כדי S3 דרך השסתום עד קצת המאגר OP50 נכנס S3. בעשותו כן, ודא כי אין בועת האוויר נשאר S5 או את השסתום.</li>
		<li>להפוך את השסתום אסידו בחזרה למיקום המקורי כדי לסגור את חיבור בין S3 S5 ולהתחבר S5 המכשיר. העומס S5 לתוך למשאבה מזרק. הפעל את תפקודי לב / נשימה שמחזיק את המשאבה. הגדר את מהירות חזק כ 200 סל"ד.</li>
		<li>הגדר את קצב הזרימה כדי להיות µL 100/min. הזמן שהדרוש עבור מאגר חדש להגיע תולעים המכשיר תלויה אורך הצינור מזרק מאגר-כניסת (בסביבות 5 דקות עם הצנרת שתוארו לעיל). יכול להיות מועסק קצב זרימה גבוהה יותר אם נדרשת החלפת מאגר מהר יותר.</li>
		<li>ברגע המאגר OP50 מתפשטת על כל רחבי המתקן, להגדיר את קצב הזרימה לחזור µL 3/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. להעמיס את התולעים לתוך המכשיר Microfluidic
<ol><li>הכן צינור microcentrifuge קטן קשירה נמוכה (650 µL) ולמלא אותו µL 100 OP50 השעיה. העבר מסביב יאנג מסונכרן בגיל 20-30 תולעים בוגרות (46 שעות לאחר מעצר זחל L1 25 ° c) של צלחת אגר NGM (מדיום הגידול נמטודות) לשפופרת הזו על-ידי בחירת אותם אחד אחד עם תולעת לבחור. גיל-סנכרון יכול להיעשות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי12.</li>
	<li>למלא את התולעת-הים מזרק, מזרק צינור (S4 באיור1) עם המתלה OP50. להזריק ~ 500 µL של הנוזל לתוך הצינור microcentrifuge עם תולעים. לצייר את הבולם עם תולעים לתוך מזרק תולעת-כניסת הצינור. ודא כי הצינור מזרק מספיק זמן (> 1 מ') מצויירות וורמס להישאר בצינור מזרק והוא לא להפוך כל הדרך אל המזרק S4.</li>
	<li>להתחבר S4 לים-התולעת. להזריק את כל התולעים בצינור מזרק תולעת-כניסה לתוך המכשיר microfluidic. נתק S4 ואת הצינור מזרק. חבר את התולעת-הים עם סיכה.</li>
	<li>. נתק את המזרק מאגר-כניסת S2 מהמשאבה מכני ( איור 1), לשלוט ידנית S1 ו- S2 לדחוף את כל התולעים לתוך ערוצים נפרדים. הקשה על S2 להעביר תולעים הערוצים, בזמן לחיצה על S1 יזיז אותם בכיוון ההפוך. פעם ערוץ נטען, התולעת בכל אחד מהערוצים יחסום את הכניסה של תולעים אחרים.</li>
	<li>תן תולעים להסתגל לסביבה חדשה עבור 2-3 שעות.</li>
</ol>5. הגדרת פרוטוקול הדמיה
<ol><li>למצוא את כל התולעים המצויות באופן מאובטח המכשיר וקבע עמדה הדמיה עבור כל אחד מהם בהתמונה רכישת התוכנה המפקחת שלך מיקרוסקופ. שימו לב כי במקרים מסוימים (למשל כאשר הגדלה גבוהה יותר היא הרצויה, או כאשר באמצעות מצלמות עם חיישן CCD קטן יותר) מספר עמדות הדמיה נדרשים לכל ערוץ. הערה: אמנם ניתן לבצע זאת באופן ידני, כמה חבילות תוכנה רכישה ניתן לטעון קובץ הטקסט המפרט את העמדות איפה צריך לקחת תמונות. מאז תפקידים אלה מסודרות באופן קבוע ב- WormSpa, משתמש יכול לכתוב סקריפט קטן (למשל, פיתון או תוכנה מסחרית) באופן אוטומטי יוצר רשימה כזו. התבנית המדויקת של קובץ script זה תלוי בתבנית הקובץ צפוי על ידי רכישת התוכנה (ראה למשל 1 חומר משלים).</li>
	<li>להגדיר את התדירות הנדרשת הדמיה בצילום מואץ. לדוגמה, נעשית הדמיה של ג'ין המערכת החיסונית בתגובה לזיהום בתדר של 10 דקות לכל מסגרת. ודא כי כל הערוצים הדרושים (למשל בהיר שדה, על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP) נרכש בכל נקודת זמן.</li>
</ol>6. מארח בתגובה Pseudomonas זיהום
הערה: שלב זה הוא ספציפי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. לחלופין, אחד יכולים להכין מאגר המכיל רמזים סביבתיים אחרים עניין (ביוטיים, והאביוטיים לחצים, סמים, איתות מולקולות, וכו ').
<ol><li>להכין PA14 Pseudomonas aeruginosa מושעה SK-בינוני14.<ol>
<li>לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>לחסן את הבקבוק עוד 250 מ עם 50 מ של ליברות, על aliquot של התרבות, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב 10 מ ל SK-בינוני. למדוד את ריכוז חיידקי ולהתאים את ריכוז יתר600 = 4.</li>
		<li>להעביר את המתלים בקבוקון נקי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ו- 25 ° c לעוד 24 שעות תוך כדי טלטול. שלב זה מחקה את הצעד צלחת-הדגירה בתקן הורג assay14.</li>
		<li>לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. זה כדי למנוע אגרגטים חיידקי וסותם את המכשיר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להחליף את הבולם OP50 במכשיר המתלה PA14, באותו ההליך כמו 3.2 שלב. לשמור על הדמיה במשך 10 שעות.</li>
</ol>

<ol><li>Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+gene+expression+to+changing+environments%3A+from+rapid+responses+to+evolutionary+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).</li>
<li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+gene+expression+in+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Controlling gene expression in response to stress.</a> Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+Streamlining+discovery+in+worm+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology.</a> Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li>
<li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+Responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Grisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+spectroscopy+of+single+sub-nL+ova+with+inductive+ultra-compact+single-chip+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes.</a> Sci Rep. 7, 44670(2017).</li>
<li>Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-enabled+phenotyping%2C+imaging%2C+and+screening+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms.</a> Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).</li>
<li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HandKAchip+-+Hands-free+killing+assay+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip.</a> Sci Rep. 6, 35862(2016).</li>
<li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin-dependent+kinetics+of+feeding+bursts+underlie+a+graded+response+to+food+availability+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans.</a> Nat Commun. 8, 14221(2017).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sisweb.com/lc/new-era-ne1000.htm">NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps</a>. , New Era Pump Systems Inc. (2017).</li>
<li>Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2 (11), 183(2006).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
<li>Chalancon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+gene+expression+noise+and+regulatory+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture.</a> Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).</li>
<li>Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in gene expression.</a> Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).</li>
<li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Switching+of+Cell+Fate+in+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).</li>
<li>Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+genetic+networks+and+identifying+compound+mode+of+action+via+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling.</a> Science. 301 (5629), 102-105 (2003).</li>
<li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li>
<li>Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malate+and+Fumarate+Extend+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58345(2013).</li>
<li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19997/">C. elegans II</a>. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+method+for+automatically+measuring+pharyngeal+pumping+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans.</a> J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).</li>
<li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Microfluidic כלים מספקים יתרונות רבים בלימוד תולעים. התקן דימות in PDMS מציע איכות הדמיה גבוהה יותר לעומת צלחת אגר NGM סטנדרטי. ניתן לקחת תמונות מרובות של תולעת יחיד, לעומת שיטות מסורתיות שבו בעלי חיים הרים מהצלחת והוקמה בשקופית מיקרוסקופ עבור הדמיה. בנוסף, ניתן לשמור את microenvironment שבו שוכנים תולעים קבוע או מאופנן לפי הצורך, המתיר מדויק מיפוי בין ההרכב של הסביבה ואת התגובה של בעלי החיים.
כאן להדגים כיצד לבצע מדידה האורך של התגובה לארח זיהום חיידקי על ידי הדמיה התגובה של תולעים בודדים מרו...

השינויים בתנאי הסביבה עלולה להוביל ההפעלה של תוכניות גנטי בליווי אינדוקציה ודיכוי של הביטוי של גנים ספציפיים1,2. שינויים אלה קינטי עשוי להיות משתנה בין הרקמות החיות באותה, בין בעלי חיים שונים. מחקרים של תוכניות כאלה גנטי ולכן קוראים שיטות לאפשר הדמיה האורך של חיות בודדות ומספקים שליטה מדויקת דינמיות של תנאים סביבתיים.
בשנים האחרונות, microfabricated פלואידים שימשו ללמוד היבטים רבים של התגובה וההתנהגות חיות קטנות, כולל תולעים, זבובים, דובוני מים עוד3,4,5,6, 7. יישומים לכלול, לדוגמה, phenotyping עמוק, optogenetic הקלטה של פעילות. עצבית בתגובה לגירויים כימיים, ומעקב אחר של התנהגויות מוטוריות כגון גפיים ו-8,שאיבה9,10 , 11.
גישות Microfluidic להחזיק נכסים רבים יכול להועיל ארוכת טווח אורכי הדמיה של תגובה לאותות סביבתיים, לרבות שליטה מדויקת דינמיות של microenvironment המקומי, עיצוב גמיש המאפשר קיום חיות בודדות רבעים נפרדים, וכן תכונות חיוביות עבור הדמיה. אולם, שמירה על בעלי חיים בתוך תא microfluidic במשך זמן רב עם השפעה שלילית מינימלית על בני שלהם היטב הוא אתגר, המחייב טיפול מסוים בעיצוב של המכשיר microfluidic, כמו גם ביצוע הניסוי.
כאן אנחנו מדגימים את השימוש WormSpa, מכשיר microfluidic עבור הדמיה האורך של Caenorhabditis elegans. 5 תולעים בודדים מרותק צ'יימברס. שוטף נמוכה של השעיה נוזלי ובקטריאליות ערבויות כי תולעים הם מוזן היטב ופעיל מספיק כדי לשמור על בריאות טובה, להקל על הלחץ, המבנה של התאים מאפשר תולעים להטיל ביצים. הפשטות של העיצוב ואופן הפעולה של WormSpa צריך לאפשר חוקרים ללא נסיון ב מיקרופלואידיקה לשלב התקן זה תוכניות מחקר משלהם.

<table><tbody><tr><td>WormSpa</td><td>N/A N</td><td>/A</td><td>קובץ ה-CAD של WormSpa זמין במעבדת לוין.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מורכב</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם משאבת מזרק שלב ממונע</td></tr><tr><td></td><td>מערכות משאבות</td><td>עידן חדש NE-501</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>SCI Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.034 אינץ' (0.86 מ"מ) מזהה x 0.052 אינץ' (1.32 מ"מ) </td></tr><tr><td>קצה מזרק</td> OD <td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 מד x 1/2 אינץ' קצה קהה מסנן מזרק צינורית נירוסטה</td></tr><tr><td></td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc מסנן מזרק 32 מ"מ עם מזרק ממברנה 5 אום סופור</td></tr><tr><td></td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 מ"ל מזרק מנעול לואר זכר שסתום</td></tr><tr><td>תלת כיווני</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>בעל קדח גדול תלת כיווני, מנעול זכר, פקקים, 10/חבילה, </td></tr><tr><td>סיכת דיבל</td> לא סטרילית <td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 סיכות דיבל נירוסטה (1/32 אינץ' קוטר x 1/2 אינץ' Lg)</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה מחייב נמוך</td><td>קורנינג</td><td>CL S3206</td><td>0.65 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה כובע מחייב נמוך</td></tr></tbody></table>

פלטפורמה microfluidic הדמיה האורך ב caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

בעשור האחרון, microfluidic הוחלו ללמוד חיות קטנות, כולל את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, וטכניקות הוכיחו שימושי כמו פלטפורמה נוחה הדמיה חיה מתן יכולות לשליטה מדויקת של תנאים ניסיוני בזמן אמת. במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת WormSpa, מכשיר שפורסמו קודם לכן microfluidic מותאם אישית. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים. כדי להמחיש את היכולת, אנחנו ביצע ניסויים הוכחה של עקרון בו תולעים נדבקו את ההתקן עם חיידקים פתוגניים, וכל הדינמיקה של ביטוי גנים התגובה החיסונית ביצה הנחת נוטרו באופן רציף של הפרט בעלי חיים. פשוט העיצוב ואופן הפעולה של מכשיר זה הופכים אותו למתאים עבור משתמשים עם לא נסיון עם microfluidic מבוסס ניסויים. אנו מציעים כי גישה זו יהיה שימושי עבור חוקרים רבים מעוניינים תצפיות האורך של תהליכים ביולוגיים בתנאים מוגדרים היטב.

גיל-מסונכרנות צעיר תולעים בוגרות (46 שעות פוסט L1 מעצר זחל 25 ° c)12 היו הכניסו את המכשיר, כמפורט בפרוטוקול. . התולעים היו בנפרד ממוקם ערוצים נפרדים, המאפשרים מדידה האורך של התגובה של בעלי החיים לגורם המחלה. כאשר הניסוי המוצלח, מרבית התולעים נשארים ערוצי שלהם משך זמן הניסוי. במקרה זה, תמונות של תולעים בודדים נלקחים פשוט על-ידי הצבת את הערוץ שלהם בדרך הדמיה, ולהימנע מהצורך לאתר באופן פעיל את החיה. איור 2 A מציג את התמונ...

במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות לאורך תהליכים דינמיים בנמטודות בוגרות בתנאים סביבתיים מבוקרים למעקב אחר תגובות התנהגותיות של תולעים וקינטיקה של ביטוי גנים של תולעים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי האופן שבו בעלי חיים מסתגלים לשינויים בסביבתם, כולל הבדלים בהתנהגויות הליבה, ביטוי גנים, זיכרון ולמידה. טכניקה זו מאפשרת תצפית אורכית מרובה של בעלי חיים בודדים בסביבות מבוקרות דינמית, כמו גם דגימה בו זמנית של היבטים מרובים של הסתגלות ברזולוציה גבוהה.ההשלכה של טכניקה זו משתרעת לעבר הבנה כמותית של הסתגלות בעלי חיים, שכן רכישת נתונים קינטיים ברמת דיוק גבוהה יכולה להקל על מודלים מתמטיים וניסוח ובדיקה של השערות מורכבות. כדי להגדיר את המכשיר להליך, חבר תחילה את קצה מזרק היציאה לחתיכת צינור מזרק בגודל 50 סנטימטר. כדי ליצור מחט מתאם, השתמש בצבת כדי למשוך את פיר המחט מרכזת המחט של מחט בגודל 20 על חצי אינץ' והשתמש במבער Bunsen כדי להסיר את שאריות הפלסטיק שנותרו.החזק את שני קצוות המחט בעזרת צבת, כופף את מחט המתאם בהתאם לגיאומטריה של מערך הניסוי וחבר את המחט באמצע הדרך לקצה השני של צינור מזרק היציאה. לאחר מכן, חבר קצה מזרק כניסת חיץ אחד ישירות לשסתום תלת כיווני וחבר מזרק כניסת חיץ לחתיכת צינור מזרק באורך מטר אחד. הכנס את מחט המתאם באמצע הדרך לקצה הפתוח של הצינור, חבר את מזרק החלפת החיץ לחתיכת צינור מזרק בגודל 50 ס"מ דרך קצה המזרק.חבר את צינור המזרק ליציאה הנותרת של השסתום התלת-כיווני וסגור את השסתום. בעזרת מחט מתאם, חבר את מזרק כניסת התולעת לחתיכת צינור מזרק באורך מטר אחד כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, שטפו את כל החומרים פעמיים עם S-medium ומלאו את המזרקים והצינורות השטופים ב-S-medium טרי, תוך הקפדה על הסרת בועות אוויר.כעת, חבר את צינור מזרק השקע לשקע המכשיר וחבר את מחט המתאם בקצה צינור מזרק היציאה ליציאת היציאה. הזרקו נפח קטן של S-medium דרך השקע כדי למלא את המכשיר עד ש-S-medium יוצא הן מכניסות המאגר והן מכניסת התולעת. חבר את צינור מזרק כניסת החיץ ליציאת כניסת החיץ של המכשיר וחבר את כניסת התולעת עם סיכת דיבל מנירוסטה בקוטר שלושים שניות של אינץ'.התקן את המכשיר המיקרופלואידי על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם במה ממונעת והדביק משאבת מזרק לשייקר ליד המיקרוסקופ כך שהמשאבה לא תתנועע בזמן הטלטול. לאחר מכן, טען את מזרק כניסת החיץ על משאבת המזרק והגדר את המשאבה לספק זרימה רציפה של מדיום S לתוך המכשיר בקצב זרימה של שלושה מיקרוליטר לדקה. כדי להעמיס את החיידקים למכשיר המיקרופלואידי, טען תחילה מזרק חדש עם תרחיף בצפיפות גבוהה של E.coli OP50.סובב את המזרק אנכית, והקש על הקנה מספר פעמים כדי לאסוף את כל בועות האוויר בחלק העליון של המזרק. כבה את שייקר המסלול וסגור את השסתום התלת-כיווני של מזרקי כניסת החיץ. החלף את מזרק כניסת החיץ במזרק העמוס בחיידקים ודחף החוצה את כל האוויר שנאסף בחלק העליון של המזרק עד שמעט מהתרחיף החיידקי נכנס למערכת חילופי החיץ ולא נשארות בועות במזרק הטעון OP50 או בשסתום.כשהשסתום סגור, חבר את המזרק העמוס בחיידקים למשאבת המזרק והפעל את שייקר המסלול. הגדר את מהירות הרעידות לכ-200 סל"ד ואת קצב הזרימה ל-100 מיקרוליטר לדקה. לאחר שמאגר ה-OP50 התפשט בכל המכשיר, הגדר את קצב הזרימה בחזרה לשלושה מיקרוליטר לדקה.כדי להעמיס את המכשיר בנמטודות, מלאו תחילה צינור מיקרו-צנטריפוגה בעל קשירה נמוכה בנפח 650 מיקרוליטר ב-100 מיקרוליטר של תרחיף OP50 טרי, והשתמשו בפיק תולעים כדי להעביר בנפרד 20 עד 30 תולעים בוגרות צעירות המסונכרנות עם הגיל מצלחת אגר בינונית לגידול נמטודות לצינור. מלאו את מזרק כניסת התולעת וצינור המזרק בתרחיף OP50 טרי והזריקו כ-500 מיקרוליטר של תרחיף לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, משוך את תרחיף התולעת לתוך צינור מזרק כניסת התולעת וחבר את מזרק כניסת התולעת לכניסת התולעת.הזריק את כל התולעים דרך צינור מזרק כניסת התולעת לתוך המכשיר המיקרופלואידי ונתק את מזרק כניסת התולעת ואת צינור המזרק. חבר את כניסת התולעת בעזרת סיכה ונתק את מזרק כניסת החיץ מהמשאבה המכנית. השתמש במזרק כניסת החיץ כדי להזיז ידנית את התולעים לתוך התעלות, ובמזרק היציאה כדי להפוך את תנועת התולעת לפי הצורך.העמסת החיות דורשת תיאום מסוים. השתמש בלחיצות עדינות על בוכנות המזרק כדי ליישר קו יחד עם התעלה ודחיפה מעט חזקה יותר כדי להניע את התולעת עד הסוף. לאחר מכן, תנו לתולעים להסתגל לסביבה החדשה שלהן במשך שעתיים-שלוש לפני תחילת הניסוי.התולעים מוגבלות לתעלות שלהן, אך הן אינן משותקות. רוב התולעים יישארו בערוצים שלהן למשך הניסוי, אך חלקן עשויות לברוח או להסתבך במיקרו-סדקים. כאן ניתן לצפות בתמונות שדה בהירות של תולעת בודדת מייצגת במשך עשר שעות במכשיר.באמצעות תולעים טרנסגניות המבטאות GFP תחת מקדם התגובה החיסונית 1, לאחר זיהום P.Aeruginosa, PA14, ביטוי GFP נצפה באמצע הגוף ובזנב של התולעת במהלך חמש השעות הראשונות של החשיפה לפתוגן, ועולה לביטוי חזק של כל הגוף במהלך חמש השעות הבאות. שרטוט הקרינה הכוללת של כל תולעת כפונקציה של הזמן שלאחר ההדבקה ממחיש את הדינמיקה של השראת גן התגובה החיסונית הראשון, כמו גם את השונות בין תולעת לתולעת בתזמון ובהיקף האינדוקציה. הדמיית טיים לאפס של הביצים שהטילו התולעים בכל ערוץ מאפשרת לשרטט את המספר המצטבר של הביצים שהטילה כל תולעת כפונקציה של הזמן שלאחר ההדבקה ולוכדת את השונות של בעל החיים לבעלי חיים כמו גם את הירידה הנגרמת על ידי פתוגן בהטלת הביצים ככל שהזיהום מתקדם.לאחר השליטה, ניתן להכין את המכשיר המיקרופלואידי ולהעמיס אותו תוך שעה. לאחר טעינת המכשיר והתולעים מתאקלמות, ניתן להעביר לתולעים ריאגנטים אחרים כגון תרופות ספציפיות או רמזים כימיים מעניינים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי שליטה במערכות עצביות וגנטיות של נמטודות. לאחר פיתוחה, אנו ומשתפי הפעולה שלנו השתמשנו בטכניקה זו כדי לנתח התנהגויות האכלה של נמטודות כמו גם תגובות גנטיות של תולעים לזיהום בהלם חום ורעב במגוון סביבות.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתמש במכשיר מיקרופלואידי לביצוע מאמרים אורכיים.

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך...

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה...

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

הדמיית התנהגות ופעילות עצבית לאורך זמן ארוך ללא קיבוע של החיה היא תנאי מוקדם להבנת התנהגות. ניתן להשתמש בהדמיית תאים מיקרופלואידיים של אגרוז (AMI) כדי לדמות פעילות עצבית והתנהגות עבור כל שלבי החיים של Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נמטודות בודדות על מדיה מוצקה למעקב אחר פרמטרים פיזיולוגיים לכל החיים וכימות פלואורסצנטי. מערכת תרבית זו כוללת מחסום חומצה פלמיטית סביב בארות תולעים בודדות כדי למנוע מבעלי חיים לברוח, ומאפשרת שימוש בהתערבויות מרתיעות, כולל חיידקים פתוגניים וגורמי עקה כימיים.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

פרוטוקול זה מתאר הדמיית דולג זמן מבוססת מיקרופלואידית על פני כל ההתפתחות הפוסט-עוברית.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans בכל שלבי הזחל

למד הדמיה מיקרופלואידית לאורך זמן של תהליכים דינמיים ב-Caenorhabditis elegans. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות ותיעוד ביטוי גנים ברזולוציה גבוהה.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים