Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

אנו מתארים את השימוש optogenetics והקלטות אלקטרופיזיולוגיות עבור מניפולציות סלקטיבי התנודות תטא בהיפוקמפוס (5-10 Hz) בעכברים להתנהג. היעילות של entrainment הקצב נעשה באמצעות שדה מקומי פוטנציאל. שילוב של באופטו - וניגוד pharmacogenetic מטפל מדידה efferent הסינכרון בהיפוקמפוס.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירופיזיולוגיה, כגון תפקיד סיבתי של תנודת תטא בניווט מיוחד והתנהגויות נלוות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת שליטה בזמן אמת על התדירות והסדירות של תנודות תטה בהיפוקמפוס בעכברים מתנהגים. תדגים את ההליך ד"ר פרנציסקה בנדר, סטודנטית לשעבר לתואר שני במעבדה שלי.

התחל עם העכבר המורדם לחלוטין המאובטח במסגרת הסטריאוטקסית. קדחו חור מעל המחיצה המדיאלית. טבלו את קצה מחט ההזרקה בטיפת וירוס על פיסת סרט פרפין ושרטטו בזהירות את הנגיף במהירות של כ-500 ננוליטר לדקה תוך התבוננות ברמת הנוזל.

כדי למנוע כניסת אוויר למחט ההזרקה, הפסק את הגמילה לפני שהנגיף נספג במלואו. נקו את המחט בעזרת טישו נייר. בדוק שהנגיף והשמן מופרדים על ידי בועת אוויר וסמן את רמת הנגיף על הצינור.

מקם את המחט מעל הגולגולת והכניס אותה לאט למוח בנקודת ההזרקה הראשונה. הזרקת 450 ננוליטר של הנגיף בקצב של 100 עד 150 ננוליטר לדקה. לאחר ההזרקה יש להמתין 10 דקות.

לאחר 10 דקות הזיזו בזהירות את המחט 0.1 מילימטרים והמתינו עוד חמש דקות. השתמש במיקרו חשפנית כדי להסיר 125 מיקרומטר של חיפוי מסיב אופטי רב-מצבי בזמן שהסיב עדיין מחובר לסליל הסיבים. לאחר מכן, השתמש בסכין יהלום כדי לחתוך את הסיב לאורך של כשניים עד שלושה סנטימטרים.

הכנס את הסיב האופטי לתוך טבעת מקל קרמיקה זירקוניה בקוטר פנימי של 126 מיקרון. כ- 0.5 עד מילימטר אחד מהסיב צריך לבלוט מהצד הקמור של הטבעת. בעזרת מחט מרחו טיפה אחת של דבק אפוקסי על שני קצוות הטבעת, אך לא על דפנות הטבעת.

לאחר הייבוש השתמש בסרט ליטוש סיבי יהלום עם שלושה גריסים מיקרון כדי ללטש את הצד הקמור של הטבעת. כדי להכין את מערך חוטי הטונגסטן, הדביקו תחילה כמה מכווני צינור סיליקה של 100 מיקרון לצד הדביק של פיסת סרט. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להשחיל חוטי טונגסטן מבודדים של 45 מיקרון דרך צינורות המדריך.

לאחר מכן השתמש באזמל כדי להפשיט את הבידוד משני הקצוות של שישה חוטי קשירה נחושת עדינים מבודדים אמייל באורך של כחמישה מילימטרים. ואז הפשיט את הבידוד משני קצוות חוט הארקה באורך של כשניים עד שלושה סנטימטרים. הלחמו כל חוט שהופשט לפיני הננו-מחבר.

חבר כל חוט מליטה לחוט טונגסטן אחד באמצעות טיפה אחת של צבע מוליך כסף. לאחר הייבוש יש למרוח כמות קטנה של מלט כדי לכסות את חוטי הנחושת. הימנע ממריחת מלט על החלק העליון של הננו-מחבר.

לאחר שאפשרת למלט להתייבש במשך 30 דקות לפחות, השתמש במספריים קהים מנירוסטה כדי לחתוך את חוטי הטונגסטן בזווית של חמש עד 20 מעלות. התחל בקידוח ארבעה חורים בקוטר 0.8 מ"מ בגולגולת הנקייה של החיה המורדמת. קדחו שני חורים רוסטרליים לתפר העטרה, ושניים מעל המוח הקטן.

לאחר מכן, הנח ברגי עצם מנירוסטה להארקה וייצוב השתל. מקם את בורג ההארקה המחובר לחוט נחושת מעל המוח הקטן. מכסים את בורג הקרקע לחלוטין במלט כדי למנוע חפצי שריר במהלך ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות.

בנה טבעת צמנט המחברת את כל הברגים. בצע קרניוטומיה מעל אתר ההשתלה, ולאחר מכן מרח כמיקרוליטר אחד של מי מלח סטריליים על פני רקמת המוח. השתמש בסטריאוטקס כדי להוריד לאט את מערך החוטים לתוך הגולגולת.

לאחר מכן יש למרוח כחמישה מיקרוליטרים של שעווה נוזלית חמה מעל אתר ההשתלה כדי להגן על רקמת המוח. מרחו מלט סביב מערך החוטים וכסו את הגולגולת במלט. מרחו טיפת שטף אחת על חוט ההארקה המולחם מראש או על החוט המולחם מראש המחובר לבורג ההארקה, ומזגו את החוטים באמצעות מכונת הלחמה.

לבסוף, מכסים את כל חוט האדמה במלט. בדוק את תפוקת האור מכבל התיקון. אם קצב השידור של הסיב המושתל היה 50%, ודא שתפוקת האור בקצה כבל התיקון היא 20 מילי-וואט.

חבר את מגבר שלב הראש למחבר המושתל, וחבר את כבל תיקון הסיב האופטי לסיב ההיפוקמפוס המושתל לגירוי אופטוגנטי. רשום את אופן הפעולה הבסיסי למשך הזמן המתאים לפרמטרים הנמדדים. פתח את התוכנה כדי לשלוט במחולל הגירויים.

לחץ על קובץ, פתח ובחר את קובץ הפרוטוקול לבחירתך. לחץ על הורד והתחל כדי להתחיל את גירוי האור. התבונן בשליטה בקצב התטא על ידי פעימות האור.

פוטנציאל השדה המקומי של ההיפוקמפוס במהלך תנודות תטא ספונטניות נראה כאן. שימו לב למעטפות הגמא, אינדיקטור לקצב תטה פיזיולוגי. פוטנציאל השדה המקומי של ההיפוקמפוס בשבעה הרץ במהלך ההשתלבות האופטוגנטית נראה כאן.

פסים כחולים מציינים את חלונות הזמן של יישום האור. שימו לב לאיפוס הפאזה על ידי דופק האור המצוין כאן על ידי חץ. פוטנציאל השדה המקומי של ההיפוקמפוס ב-10 הרץ משקף אינטגרציה אופטוגנטית.

שימו לב למעטפות גמא נעולות פאזה והיפוך הפאזה בין אוריאנים של סטרטהם לשכבה רדיאטום נשמר גם במהלך ההתאמה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו בארבע שעות של זמן ניסוי, בתוספת שישה שבועות לביטוי ויראלי. בעת ניסיון הליך זה, חיוני לזכור להבטיח העברה ויראלית יעילה.

חבר כראוי את שתל הסיבים האופטיים לכבל התיקון, וקבל איכות טובה של תנודות תטא פוטנציאליות ספונטניות בשדה המקומי.