הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבצע שינויים גנומיים ממוקדים במגוון תאים ואורגניזמים באמצעות קומפלקסים ריבונוקלאופרוטאין CRISPR/Cas9. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות ביולוגיות בסיסיות על ידי מתן הכוח לחוקרים ליצור הוספות, מחיקות והחלפות בהתאמה אישית בגנומים שלא שונו אחרת של אורגניזמים מודלים ולא מודלים. היתרון העיקרי בשימוש במתחמי ריבונוקלאופרוטאין או RNP במקום DNA פלסמיד הוא שהיעילות גבוהה יותר, ואירועים מחוץ למטרה מצטמצמים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפולים מחוץ לגוף כדי להילחם בדברים כמו סרטן, HIV או מחלות גנטיות. הסיבה לכך היא שניתן להשתמש בעריכת גנום כדי לתקן מוטציות מזיקות או אפילו לשפר את יכולתם של תאים להילחם במחלות מזיקות. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תאים אנושיים ראשוניים, C.elegans ו-Parhyale hawaiensis.

ניתן ליישם אותו כדי לבצע שינויים גנטיים במאות מערכות אחרות, כולל אורגניזמים שבעבר היו עקשניים. התחל הליך זה בתכנון והכנה של RNA מנחה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הרכיבו קומפלקס RNP על ידי ערבוב כמות מולרית פי אחת עד פעמיים של RNA מנחה עם 200 פיקומולים של חלבון Cas9 בנפח כולל של 10 מיקרוליטר.

לאט מאוד, הוסיפו Cas9 מרוכז ל-RNA המנחה למשך כ-30 שניות, וצרו עיגולים מהירים עם הפיפטה. מביא את ריכוז ה-Cas9 הסופי ל-20 מיקרומולר. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר RNP לכל קובטה.

לאחר הכנת HSPCs כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ספרו את התאים עם המוציטומטר והעבירו 150,000 עד 200,000 תאים לקובטה לצינור צנטריפוגה. סובב את הצינור בכוח הכבידה פי 100 למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים. שאפו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה או ואקום, והסירו בועות.

השעו בעדינות את התאים עם 20 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה לכל קובטה. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של התאים המכילים 150,000 עד 200,000 HSPCs לכל באר קובטה שכבר מכילה 10 מיקרוליטר של RNP וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מבלי ליצור בועות. לבסוף, אלקטרופורציה של הקובטות לאחר הנחתן בנוקלאופקטור.

עבור HSPCs, השתמש בקוד הדופק ER-100. התחל בהכנת C.elegans ברפידות אגרוז כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הנח כרית הזרקת אגרוז והחלקת כיסוי על משקף דיסקציה.

השתמש בפיק תולעים כדי להניח מסלול קטן של שמן הלוקרביון לאורך קצה אחד של הרפיד. לאחר מכן, השתמש במכוש התולעים המצופה בשמן כדי להרים מספר תולעים מצלחת האגר של NG לתוך מסלול השמן. עם שיער דק המחובר לפיפטה, כגון ריס או שפם חתול, מקם את התולעים במקביל, ודחף בעדינות את התולעים לתוך כרית האגרוז.

עד שנוח עם הליך המיקרו-הזרקה, הרכיב רק תולעת אחת בכל פעם. לאחר שהן במקומן ומחוברות לכרית, כסו את התולעים בכמה טיפות נוספות של שמן הלוקרבון מקצה מכוש התולעים. הנח את החלקת הכיסוי עם התולעים המותקנות על מיקרוסקופ ההזרקה.

בהגדלה נמוכה, מקם את התולעים בניצב למחט ההזרקה שמולאה בתמיסת RNP, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עבור להגדלה גבוהה ומקם מחדש את המחט הסמוכה לזרוע בלוטת המין, המתאימה לאזור ליד הגרעינים באמצע עד מאוחר פצ'יטן. בעזרת המיקרומניפולטור, הזיזו את המחט כנגד התולעת, ולחצו מעט על הציפורן.

לאחר מכן, ביד אחת, הקש על הצד של שלב המיקרוסקופ כדי לטלטל את המחט דרך הציפורן. לחץ על משוט ההזרקה או כפתור, מלא לאט את זרוע בלוטת המין בתערובת ההזרקה והסר את המחט. חזור על השלב עם זרוע בלוטת המין השנייה.

לאחר הזרקת התולעים, הסר את החלקה של הכיסוי ואת כרית האגרוז והנח אותה מתחת למיקרוסקופ מנתח. בעזרת פיפטה נימית משוכה, העבירו את השמן מהתולעים על ידי פיפטינג מאגר M9 מעליהן. בצע טיפול זה כדי לשחרר את התולעים מהאגר.

לאחר 10 דקות, כאשר התולעים מתרוצצות במאגר, העבירו אותן לצלחת אגר NG עם חיידקי OP50 באמצעות פיפטה נימית משוכה. מניחים את הצלחת על 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש עד שהתולעים מתאוששות ומסתובבות. לאחר ההתאוששות, העבירו את התולעים בנפרד לצלחות אגר NG עם OP50.

לאחר מכן, העבירו את הצלחות לחממה של 25 מעלות צלזיוס. אסוף את עוברי התא הבודד Parhyale באפס עד ארבע שעות לאחר ההפריה על ידי הרדמה ראשונה של נקבות גרביד עם 0.02% שמן ציפורן ומי ים. גרד בעדינות את העוברים מכיס הגחון שלה באמצעות פיפטת זכוכית מעוגלת ומשוכה להבה וזוג עמום של מלקחיים מספר שלוש.

באמצעות חנקן דחוס, הזריקו את עוברי Parhyale תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מיקרו-מזרק ומיקרומניפולטור. טען 1.5 מיקרוליטר מתערובת ההזרקה לחלק האחורי של צינור נימי משוך באמצעות קצה פיפטה של מיקרו-מעמיס. לאחר התקנת המחט על מכשיר ההזרקה, שברו את קצה המחט באמצעות זוג מלקחיים מתחת לטווח הניתוח.

כייל את הנפח המועבר על ידי הזרקה לשמן Halocarbon 700 ומדידת קוטר הבועה. חותכים שוקת מחומר הריפוי בעזרת סכין גילוח. מלאו אותו באמצע הדרך במי ים מעוקרים בפילטר וסדרו את עוברי פרהיאלה בשוקת להזרקה.

הזריק את העוברים באמצעות מערך המיקרו-הזרקה, וייצב כל עובר עם זוג מלקחיים במהלך ההזרקה. לאחר ההזרקה, השתמש בפיפטה להעברת זכוכית כדי להעביר את העוברים לצלחת תרבית טרייה של 60 מילימטר מלאה באמצע הדרך במי ים מעוקרים בפילטר לפני ניתוח וקיבוע העוברים בשלבים שונים. צור מחטי חיתוך על ידי השחלת חתיכה כפופה של חוט טונגסטן באורך של כ-0.5 אינץ' לקצה מחט אינסולין.

השתמש במזרק מיליליטר אחד כידית מחט הדיסקציה והשחיז את המחט בנתרן הידרוקסיד תחת זרם. מלאו באר אחת של צלחת זכוכית של שלוש בארות באמצע הדרך בתמיסה טרייה של תשעה חלקים מאגר PEM, חלק אחד 10X PBS וחלק אחד 32% PFA. הכניסו שלושה עד חמישה עוברים לתוך הצלחת ותקעו חור קטן בכל עובר בעזרת מחט טונגסטן חדה כדי לתקוע ומחט מעט עמומה כדי להתייצב, מה שמאפשר לחלמון לזרום החוצה ולקיבוע לזרום פנימה.

בעזרת זוג מחטי טונגסטן מחודדות, הקניטו בעדינות את שני הממברנות החיצוניות המקיפות את עובר Parhyale. נתחו אותם בקיבוע כדי להפוך את העוברים לחזקים יותר, אך עבדו במהירות כדי למנוע מהממברנה להתקבע לעובר, מה שמקשה על הסרת הממברנה. אפשר לעוברים לתקן למשך 15 עד 20 דקות בסך הכל עבור צביעת נוגדנים, או 40 עד 50 דקות עבור הכלאה באתר.

לפעמים, תוצאות של ניסוי עריכה מוערכות בצורה הטובה ביותר באמצעות מבחן ניסיוני. תוצאות מייצגות של תאי T מסוג פרא ותאי נוקאאוט CD25 מוצגות כאן. ציטומטריית זרימה מראה שתאים שלא נערכו עם Cas9 RNP מבטאים CD25.

עם זאת, תאים שבהם CD25 נוק אאוט אינם מבטאים את החלבון. עבור הפרעות בקנה מידה גדול, לתוצאות העריכה עשויים להיות פנוטיפים חזותיים ברורים. לדוגמה, לסוג הבר Parhyale hawaiensis יש בטן רגילה עם רגלי שחייה ועוגן.

שיבוש הגן Abd-B מחליף את רגלי השחייה והעוגן ברגלי קפיצה והליכה, שבדרך כלל קשורות רק לבית החזה. בנוסף לבדיקת פנוטיפים, על הנסיינים גם לנתח גנוטיפ כדי להעריך את יעילות העריכה הכוללת ולזהות שינויים גנטיים ספציפיים. עבור שיבוטים בודדים, ניתן להשיג זאת באמצעות ריצוף Sanger פשוט.

באוכלוסיות מעורבות של תאים, מומלץ ניתוח ריצוף מתקדם יותר. לדוגמה, TIDE יכול למפות את כל האינדלים השונים שהתרחשו בתאים בודדים בתוך מאגר ערוך RNP. כאשר אתה מנסה לראשונה הליך זה, נסה להשתמש באחד מהפקדים החיוביים שפירטנו בטבלה הראשונה.

שימוש ב-RNA מדריך מנוסה ואמיתי יכול לעזור לך להרגיש את העריכה עם RNP לפני תכנון הניסוי שלך.