מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים
21 במרץ 2018
פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי בו זמנית של נוירוני הריח שלו. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של תפקוד מעגל הריח ומשלימה מחקרים על האופן שבו תפקוד מעגל הריח מתורגם לתגובת התנהגות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הספציפיות והשליטה הזמנית שלה על ידי שימוש באור במקום בשיפועי ריח מסורתיים להפעלת נוירוני ריח בודדים.
כדי להתחיל את הניסוי, בנו זירת התנהגות חסרת אור. בנה קופסה בגודל 89 על 61 על 66 סנטימטרים, עשויה יריעות אקריליק פרספקס בצבע שחור, בעובי שלושה מילימטרים. הנח את הקופסה על שולחן בחדר ההתנהגות.
לאחר מכן, התקן מצלמת USB 3.0 CCD מונוכרום המצוידת במסנן IR Longpass 830 ננומטר ועדשת תושבת F1.4 C של שמונה מילימטר במרכז תקרת הקופסה השחורה. הנח שני פסי LED אינפרא אדום על השולחן כדי להאיר את הזחלים בזירה החשוכה. לאחר מכן, השג לוח אלומיניום בגודל 22 ס"מ על 22 ס"מ מרובע לבניית פלטפורמת LED.
במרכז הצלחת, השתמש בחותך מתכת כדי לחתוך חור גדול מספיק כדי להתאים סביב מצלמת ה-CCD. מכסים את לוחית המתכת בנורות LED אדומות. הלחמו את חוטי פס תאורת ה-LED בסדרה, והזינו את חוטי הרצועה לממסר מצמד אופטי הנשלט על ידי מיקרו-מעבד Raspberry Pi 2B.
לאחר מכן, התקן את פלטפורמת ה-LED סביב מצלמת ה-CCD. לאחר מכן התקן והגדר מערכת הפעלה מבוססת Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux במעבד Raspberry Pi לפני חיבור ממסר המצמד האופטי לרצועות ה-LED. חבר ספק כוח להפעלת פסי ה-LED והמצמד האופטי.
ודא שיש קרינה הומוגנית בנקודות שונות סביב מצלמת ה-CCD בזירת ההתנהגות. ודא את הקרינה המוחלטת על פני הזירה בעזרת ספקטרומטר וקבע שהיא תהיה בערך 1.3 וואט למטר בריבוע על פני הזירה. שמרו על הזבובים על מזון זבובים רגיל בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 50 עד 60% לחות יחסית במחזור אור/חושך של 12 שעות ו-12 שעות.
על מנת לבטא את CsChrimson בזוג יחיד של ORNs, חצו את הנקבות הבתולות מקו UAS-IVS-CsChrimson לזכרים מקו ORX-GAL4. לאחר שזכרים ונקבות זבובים בהכלאה הורשו להזדווג ולהטיל ביצים במשך 48 שעות, העבירו את הבוגרים לבקבוקון טרי. על פני בקבוקון המזון המכיל ביצים, הוסיפו 400 מיקרוליטר של תערובת המכילה 400 מיקרו-מולרית אול-טרנס-רטינל, או ATR, מומסת בדימתיל סולפוקסיד, או DMSO, בסוכרוז 89 מילי-מולרי מומס במים מזוקקים.
לאחר הוספת ATR לבקבוקוני המזון המכילים ביצים, דגרו את הבקבוקונים בחושך למשך 72 שעות נוספות. לאחר הדגירה, חלץ זחלי כוכב שלישי מפני השטח של מזון זבובים על ידי הצפתם באמצעות תמיסת סוכרוז בצפיפות גבוהה של 15%. בעזרת מיקרו-פיפטה P1000, הפרד את הזחלים הצפים על פני תמיסת הסוכרוז לכוס זכוכית של 1,000 מיליליטר.
שטפו את הזחלים ארבע פעמים על ידי החלפת 800 מיליליטר מים מזוקקים טריים בכוס הזכוכית בכל פעם. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו לזחלים לנוח במשך 10 דקות לפני שתכפיפו אותם למבחן ההתנהגות. לבדיקת ההתנהגות, שמור על טמפרטורה ולחות עקביים בחדר ההתנהגות.
הכן מדיום זחילת זחלים על ידי יציקת 150 מיליליטר של 1.5% אגרוז מומס לתוך צלחת פטרי מרובעת בגודל 22 ס"מ על 22 סנטימטר. הניחו לאגרוז להתמצק ולהתקרר במשך שעה עד שעתיים בצלחות הפטרי לפני השימוש בהם במבחן ההתנהגות. לאחר שהאגרוז התמצק, העבירו לא יותר מ-20 מזחלי הכוכב השלישי המוכנים למרכז צלחת הפטרי וכסו את צלחת הפטרי במכסה.
הנח את צלחת הפטרי בזירת ההתנהגות מתחת למצלמת ה-CCD. הפעל את מקור אור ה-LED האינפרא אדום בגודל 850 ננומטר כדי לדמיין זחלים בסרטון. הפעל את מצלמת ה-CCD כדי להקליט את תנועת הזחלים.
לבסוף, עברו לעיבוד וניתוח נתונים. כאשר ORN 7a המבטא CsChrimson מגורה על ידי אור, הייתה ירידה משמעותית באורך הריצה בהשוואה לחיות ביקורת. לעומת זאת, כאשר ORN 42a המבטא CsChrimson מגורה על ידי אור, הייתה עלייה משמעותית באורך הריצה בהשוואה לחיות ביקורת.
מצאנו כי עבור ORN 42a, דפוסים זמניים שונים של גירוי אור עוררו תגובות התנהגותיות שונות. בעוד שהדגמנו שיטה זו עבור נוירונים קולטני ריח מסדר ראשון, השיטה שלנו מאפשרת גם מגוון יישומים עתידיים, כגון מדידת ההשפעה של נוירונים במורד הזרם כגון נוירוני הקרנה ונוירונים מקומיים על התנהגות הזחלים. אנו מצפים שטכניקה זו תסלול את הדרך לניתוח מקיף של תפקוד מעגל הריח של הזחל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מנתח את התנהגות הניווט של זחלי Drosophila בתגובה לגירוי אופטוגנטי סימולטני של נוירוני הריח שלהם. הוא עושה שימוש באור באורך גל של 630 nm כדי להפעיל נוירוני ריח ספציפיים המבטאים channel rhodopsin עם הסטה לאדום, ובכך מאפשר מחקרים מפורטים של תפקוד מעגלי הריח ותגובות התנהגותיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח ההתנהגותיים
- אופטוגנטיקה
- גנטיקה של Drosophila
רקע
- מתודולוגיה זו מאפשרת לבחון כיצד תפקוד המעגל האולפקטורי (חוש הריח) נמצא במתאם עם תגובות התנהגותיות.
- היא מציעה בקרה זמנית על ההפעלה באמצעות אור במקום באמצעות מדרגי ריח מסורתיים.
- גישה זו מקלה על בחינת נוירונים ספציפיים במערכת האולפקטורית של ה-Drosophila.
מטרת המחקר
- לניתוח מדויק של תפקודי מעגלים ריחוניים.
- לתצפית על תגובות התנהגותיות של זחלים לגירוי עצבי ממוקד.
- לספק תובנות לגבי האופן שבו נוירונים ריחוניים בודדים משפיעים על בחירות ניווט.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- המחקר משתמש בזירת התנהגות שתוכננה במיוחד לצורך ניתוח תנועת זחלים.
- זחלי Drosophila המבטאים CsChrimson בנוירונים של קולטני ריח (ORNs) עוררו באמצעות אור.
- הבדיקה ההתנהגותית כוללת הכנת מצע זחילה מאגרוזה והקלטת וידאו של תנועות הזחלים.
- שלבים משמעותיים כוללים את בניית הזירה, התקנת הציוד והכנת זחלים תחת תנאים ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- גירוי אורו-אופטי של נוירונים ספציפיים בקולטני הריח הוביל לשינויים משמעותיים באורך הריצה של הזחלים, דבר המצביע על תגובות התנהגותיות נבדלות.
- דפוסים זמניים שונים של גירוי עוררו השפעות שונות על התנהגות הניווט.
- שיטה זו עשויה להקל על חקירה עתידית של השפעות נוירונליות במורד המסלול (downstream) על התנהגות הזחלים.
מסקנות
- המחקר מדגים גישה חדשנית לניתוח מעגלים רייחתיים והשלכותיהם ההתנהגותיות.
- הוא מאפשר לחוקרים לבחון את התפקידים הספציפיים של נוירונים ממוקדים בהקשר של אורגניזם חי.
- ממצאים אלו מעמיקים את הבנתנו לגבי המנגנונים הנוירונליים בעיבוד חושי ובהתנהגות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של תפקוד המעגל האולפקטורי על ידי החלפת גירויי ריח בבקרה אופטוגנטית, ובכך היא נותנת מענה לאתגר מרכזי בתיקוף מטרות (target validation) שבו יש לקשר בין תוצרי התנהגות לבין פעילות נוירונלית ספציפית. היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי בידוד תרומתם של נוירוני קולטן ריח בודדים להתנהגות ניווט, ובכך משפרת את הביטחון החיזוי בבחירת המטרה. גישה זו מחזקת את הרצף התרגומי מהמטרה המולקולרית ועד לפנוטיפ ברמת המעגל, דבר הרלוונטי להפחתת סיכונים של מטרות בתוכניות גילוי המתמקדות במדעי המוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור בין הפעלה ספציפית של נוירונים ריחניים לבין תפוקות התנהגותיות מוגדרות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות נוירונליות באמצעות גרייה מבוססת אור.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מניפולציה מבודדת של ORNs בודדים כדי להבהיר את תפקידם בהתנהגות ניווט של זחלים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדים התנהגותיים כמותיים (למשל, שינויים באורך הריצה) המאפשרים הערכה סטנדרטית של השפעות מודולציה נוירונלית.
- ערך תפעולי: מבסס פלטפורמת בדיקה ניתנת להרחבה לסריקת מודולטורים גנטיים או פרמקולוגיים של תפקוד מעגלים ריחוניים.
- ערך מדעי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי ביטול נדיפות חומרי הריח ושונות באספקתם באמצעות גרייה אופטוגנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטיות למחלות על ידי מתן אפשרות לניתוח של התרגום מגירוי חושי להתנהגות באורגניזם שניתן לשליטה גנטית.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה תואם לשלב הפרה-קליני להערכת השפעות של מטרות נוירונליות על התנהגות לפני תיקוף ביונקים.
- ערך מדעי: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת האופן שבו פעילות נוירונלית במעלה הזרם מתורגמת לפנוטיפים התנהגותיים במורד הזרם.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, תוך שהיא תומכת בתיקוף המטרה באמצעות פנוטיפינג התנהגותי ומספקת מידע לזיהוי מובילים על ידי הבהרת המטרות הנוירונליות המניעות פלטים מדידים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי תפקודן של נוירונים אולפקטוריים בודדים בהנחיית התנהגות ניווט של זחלים.
- סריקה: מספקת מדדים התנהגותיים כמותיים וניתנים לשחזור (אורך ריצה), המתאימים להערכה של תרכובות או מודולטורים גנטיים.
- אנליטיקה: מספקת תוצרי התנהגות שניתן לעקוב אחריהם והשוואות סטטיסטיות בין תנאי גירוי לתנאי ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פעילות של מעגלים נוירונליים לתגובות התנהגותיות, ובכך תומך בהסברה למודלים מסדר גבוה יותר.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לבדיקה שיטתית של מטרות נוירונליות במעגלים אולפקטוריים ובמעגלים תחושתיים אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת העמימות בקישור בין הפעלה עצבית לתוצאות התנהגותיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות בקרה אופטוגנטית המחליפה גירויי ריח משתנים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות של go/no-go על ידי אספקת קישורים מכניסטיים ברורים יותר בין מטרות לפנוטיפים התנהגותיים.
- השפעה על תיק המטרות: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על השפעה התנהגותית מתוקפת במערכת רלוונטית לתהליכי גילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, אופטוגנטיקה ותכנון בדיקות התנהגותיות.
- תלוי במכשור ייעודי הכולל זירת התנהגות, תאורת IR, מצלמת CCD ובקר גרייה מבוסס Raspberry Pi.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להכנת זחלים, הכנת מצע אגרוז ופרוטוקולי מעקב וידאו.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לסוגים שונים של נוירונים (למשל, נוירוני השלכה, נוירונים מקומיים) או לשלבי התפתחות שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בנגישות גנטית והזנה רטינלית במערכת המודל, דבר העלול להגביל את היכולת להרחיב את השימוש למערכות שאינן Drosophila.
