מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים
21 במרץ 2018
פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי בו זמנית של נוירוני הריח שלו. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של תפקוד מעגל הריח ומשלימה מחקרים על האופן שבו תפקוד מעגל הריח מתורגם לתגובת התנהגות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הספציפיות והשליטה הזמנית שלה על ידי שימוש באור במקום בשיפועי ריח מסורתיים להפעלת נוירוני ריח בודדים.
כדי להתחיל את הניסוי, בנו זירת התנהגות חסרת אור. בנה קופסה בגודל 89 על 61 על 66 סנטימטרים, עשויה יריעות אקריליק פרספקס בצבע שחור, בעובי שלושה מילימטרים. הנח את הקופסה על שולחן בחדר ההתנהגות.
לאחר מכן, התקן מצלמת USB 3.0 CCD מונוכרום המצוידת במסנן IR Longpass 830 ננומטר ועדשת תושבת F1.4 C של שמונה מילימטר במרכז תקרת הקופסה השחורה. הנח שני פסי LED אינפרא אדום על השולחן כדי להאיר את הזחלים בזירה החשוכה. לאחר מכן, השג לוח אלומיניום בגודל 22 ס"מ על 22 ס"מ מרובע לבניית פלטפורמת LED.
במרכז הצלחת, השתמש בחותך מתכת כדי לחתוך חור גדול מספיק כדי להתאים סביב מצלמת ה-CCD. מכסים את לוחית המתכת בנורות LED אדומות. הלחמו את חוטי פס תאורת ה-LED בסדרה, והזינו את חוטי הרצועה לממסר מצמד אופטי הנשלט על ידי מיקרו-מעבד Raspberry Pi 2B.
לאחר מכן, התקן את פלטפורמת ה-LED סביב מצלמת ה-CCD. לאחר מכן התקן והגדר מערכת הפעלה מבוססת Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux במעבד Raspberry Pi לפני חיבור ממסר המצמד האופטי לרצועות ה-LED. חבר ספק כוח להפעלת פסי ה-LED והמצמד האופטי.
ודא שיש קרינה הומוגנית בנקודות שונות סביב מצלמת ה-CCD בזירת ההתנהגות. ודא את הקרינה המוחלטת על פני הזירה בעזרת ספקטרומטר וקבע שהיא תהיה בערך 1.3 וואט למטר בריבוע על פני הזירה. שמרו על הזבובים על מזון זבובים רגיל בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 50 עד 60% לחות יחסית במחזור אור/חושך של 12 שעות ו-12 שעות.
על מנת לבטא את CsChrimson בזוג יחיד של ORNs, חצו את הנקבות הבתולות מקו UAS-IVS-CsChrimson לזכרים מקו ORX-GAL4. לאחר שזכרים ונקבות זבובים בהכלאה הורשו להזדווג ולהטיל ביצים במשך 48 שעות, העבירו את הבוגרים לבקבוקון טרי. על פני בקבוקון המזון המכיל ביצים, הוסיפו 400 מיקרוליטר של תערובת המכילה 400 מיקרו-מולרית אול-טרנס-רטינל, או ATR, מומסת בדימתיל סולפוקסיד, או DMSO, בסוכרוז 89 מילי-מולרי מומס במים מזוקקים.
לאחר הוספת ATR לבקבוקוני המזון המכילים ביצים, דגרו את הבקבוקונים בחושך למשך 72 שעות נוספות. לאחר הדגירה, חלץ זחלי כוכב שלישי מפני השטח של מזון זבובים על ידי הצפתם באמצעות תמיסת סוכרוז בצפיפות גבוהה של 15%. בעזרת מיקרו-פיפטה P1000, הפרד את הזחלים הצפים על פני תמיסת הסוכרוז לכוס זכוכית של 1,000 מיליליטר.
שטפו את הזחלים ארבע פעמים על ידי החלפת 800 מיליליטר מים מזוקקים טריים בכוס הזכוכית בכל פעם. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו לזחלים לנוח במשך 10 דקות לפני שתכפיפו אותם למבחן ההתנהגות. לבדיקת ההתנהגות, שמור על טמפרטורה ולחות עקביים בחדר ההתנהגות.
הכן מדיום זחילת זחלים על ידי יציקת 150 מיליליטר של 1.5% אגרוז מומס לתוך צלחת פטרי מרובעת בגודל 22 ס"מ על 22 סנטימטר. הניחו לאגרוז להתמצק ולהתקרר במשך שעה עד שעתיים בצלחות הפטרי לפני השימוש בהם במבחן ההתנהגות. לאחר שהאגרוז התמצק, העבירו לא יותר מ-20 מזחלי הכוכב השלישי המוכנים למרכז צלחת הפטרי וכסו את צלחת הפטרי במכסה.
הנח את צלחת הפטרי בזירת ההתנהגות מתחת למצלמת ה-CCD. הפעל את מקור אור ה-LED האינפרא אדום בגודל 850 ננומטר כדי לדמיין זחלים בסרטון. הפעל את מצלמת ה-CCD כדי להקליט את תנועת הזחלים.
לבסוף, עברו לעיבוד וניתוח נתונים. כאשר ORN 7a המבטא CsChrimson מגורה על ידי אור, הייתה ירידה משמעותית באורך הריצה בהשוואה לחיות ביקורת. לעומת זאת, כאשר ORN 42a המבטא CsChrimson מגורה על ידי אור, הייתה עלייה משמעותית באורך הריצה בהשוואה לחיות ביקורת.
מצאנו כי עבור ORN 42a, דפוסים זמניים שונים של גירוי אור עוררו תגובות התנהגותיות שונות. בעוד שהדגמנו שיטה זו עבור נוירונים קולטני ריח מסדר ראשון, השיטה שלנו מאפשרת גם מגוון יישומים עתידיים, כגון מדידת ההשפעה של נוירונים במורד הזרם כגון נוירוני הקרנה ונוירונים מקומיים על התנהגות הזחלים. אנו מצפים שטכניקה זו תסלול את הדרך לניתוח מקיף של תפקוד מעגל הריח של הזחל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מנתח את התנהגות הניווט של תולעת דרוסופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי סימולטני של נוירוני הריח שלה. הוא משתמש באור באורך גל של 630 ננומטר כדי להפעיל נוירוני ריח ספציפיים המבטאים תעלת רודופסין מוזזת לאדום, ומאפשר מחקר מפורט של תפקוד מעגל הריח ותגובת ההתנהגות.
רכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע התנהגותי
- אופטוגנטיקה
- גנטיקה של דרוסופילה
רקע
- מתודולוגיה זו מאפשרת חקירת הקשר בין תפקוד מעגל הריח לתגובות התנהגותיות.
- היא מציעה שליטה זמנית על הפעלה באמצעות אור במקום שיפועי ריח מסורתיים.
- הגישה מאפשרת את הבחינה של נוירונים ספציפיים במערכת הריח של דרוסופילה.
מטרת המחקר
- לנתח את התפקוד של מעגלי הריח בדיוק רב.
- לצפות בתגובות התנהגותיות של תולעים לגירוי נוירונלי ממוקד.
- לספק תובנות לגבי האופן שבו נוירוני ריח בודדים משפיעים על בחירות ניווט.
שיטות בשימוש
- המחקר משתמש בזירה ייעודית לניתוח תנועות תולעים.
- תולעי דרוסופילה המבטאות CsChrimson בנוירוני קולטן ריח (ORNs) עוררו באמצעות אור.
- ניסוי ההתנהגות כרוך בהכנת מדיום זחילה מאגרז ובהקלטת וידאו של תנועות תולעים.
- שלבים משמעותיים כוללים בניית הזירה, הרכבת ציוד והכנת תולעים בתנאים ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- גירוי אור של נוירוני קולטן ריח ספציפיים הוביל לשונות משמעותית באורך הריצה של תולעים, המצביעה על תגובות התנהגותיות מובחנות.
- תבניות זמניות שונות של גירוי הסבו השפעות שונות על התנהגות הניווט.
- שיטה זו צפויה להקל על חקירה עתידית של השפעות נוירונליות מושפעות על התנהגות תולעת.
מסקנות
- המחקר מדגים גישה חדשנית לניתוח מעגלי ריח והשלכותיהם ההתנהגותיות.
- הוא מאפשר לחוקרים לחקור את התפקידים הספציפיים של נוירונים ממוקדים בהקשר של אורגניזם חי.
- ממצאים אלה מגבירים את הבנתנו את המנגנונים הנוירונליים בעיבוד חושי והתנהגות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables precise dissection of olfactory circuit function by replacing odor stimuli with optogenetic control, addressing a key challenge in target validation where behavioral readouts must be linked to specific neuronal activity. It supports mechanistic de-risking in early discovery by isolating the contribution of individual olfactory receptor neurons to navigational behavior, improving predictive confidence in target selection. The approach enhances translational continuity from molecular target to circuit-level phenotype, relevant for de-risking targets in neuroscience-focused discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific olfactory neuron activation to defined behavioral outputs.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of neuronal targets using light-based stimulation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through isolated manipulation of individual ORNs to clarify their role in larval navigational behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative behavioral readouts (e.g., run length changes) that enable standardized assessment of neuronal modulation effects.
- Operational Value: Establishes a scalable assay platform for screening genetic or pharmacological modulators of olfactory circuit function.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by eliminating odorant volatility and delivery variability through optogenetic stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling dissection of sensory-to-behavior translation in a genetically tractable organism.
- Operational Value: Provides a preclinical-compatible workflow for evaluating neuronal target effects on behavior prior to mammalian validation.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by clarifying how upstream neuronal activity translates to downstream behavioral phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through behavioral phenotyping and informing lead identification by clarifying neuronal targets that drive measurable outputs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of individual olfactory neuron function in driving larval navigational behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible behavioral metrics (run length) suitable for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Provides trackable behavioral outputs and statistical comparisons between stimulated and control conditions.
- Translational Research: Connects neuronal circuit activity to behavioral responses, supporting extrapolation to higher-order models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for systematic interrogation of neuronal targets across olfactory and other sensory circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in linking neuronal activation to behavioral outcomes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through optogenetic control replacing variable odor stimuli.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clearer mechanistic links between targets and behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated behavioral impact in a discovery-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and behavioral assay design.
- Dependent on specialized instrumentation including behavior arena, IR lighting, CCD camera, and Raspberry Pi-based stimulation control.
- Necessitates cross-team standardization for larval preparation, agarose medium preparation, and video tracking protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types (e.g., projection neurons, local neurons) or developmental stages.
- Limited by the need for genetic accessibility and retinal feeding in the model system, which may constrain scalability to non-Drosophila systems.
