בניית Thioether/ויניל גופרתי-קשורה Hydrothiolation תיול-ene/yne הנוצרות על-ידי פפטידים הסליל באמצעות צילום

שיטות אלו מפשטות את היצירה של פפטידים מחזוריים הקשורים לתיאואתר עקב השימוש בכימיה של קליק תיו-אן או תיו-יין בעלת סובלנות קבוצתית פונקציונלית מעולה ותשואה טובה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שקשירה תיואתר מספקת אתר שינוי חסר עקבות, המרחיב משמעותית את המרחב הכימי של פפטידים יציבים לאחר שינוי סינתזת פפטידים. כדי להתחיל בהליך, חבר עמוד מלא ב-50 מיליגרם של שרף Rink Amide MBHA הן לסעפת ואקום שולחנית והן לקו גז חנקן או ארגון באמצעות תא עצירה תלת-כיווני.

הוסף מיליליטר אחד עד שניים של דיכלורומתאן למצע השרף, ונפח את השרף על ידי ערבוב עדין של התערובת בזרם בועות גז אינרטיות למשך 10 דקות. מסננים את השרף בעזרת נורת פיפטה גומי בסיום. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד עד שניים של תמיסת הגנה Fmoc N-terminal לשרף.

מערבבים בעדינות את התערובת על ידי בעבוע בגז אינרטי למשך 10 דקות, ואז מסננים את השרף בעזרת נורת פיפטה מגומי. שוטפים את העמוד עם מיליליטר עד שניים של DMF באותו אופן, ואחריו מיליליטר עד שניים של DCM. חזור על רצף הסרת ההגנה פעם אחת.

לאחר מכן, שלב 0.125 מילימול של חומצת אמינו מוגנת FMOC ו-50.5 מיליגרם של HCTU עם 0.5 מיליליטר DMF במיכל פוליפרופילן. נערו את התערובת במשך דקה כדי להמיס את המוצקים. לאחר מכן, הוסיפו 43.5 מיקרוליטר של DIPEA, ונערו את המיכל למשך דקה נוספת לקבלת תמיסת חומצת אמינו פעילה של 0.25 מולאר.

הוסף תמיסה זו לשרף השטוף, ומבעבע גז אינרטי דרך התערובת למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, יש להסיר את ההגנה ולשטוף את שאריות חומצות האמינו הקשורות. המשך לחבר חומצות אמינו לשרשרת הפפטידים בדרך זו ליצירת הפפטיד הליניארי.

השתמש בסינתזה של פפטידים בשלב מוצק להכנת שרף התומך בפפטיד ליניארי הכולל שאריות ציסטאין מוגנות טריטיל המופרדות בשלוש יחידות משאריות מונו-S-five. הוסף מיליליטר אחד עד שניים של תמיסת הגנה מפני טריטיל ל-50 מיליגרם של השרף הנושא פפטיד. מבעבעים גז חנקן דרך התערובת למשך 10 דקות.

מסננים את תמיסת ההגנה ושוטפים את השרף במנות של 1 עד 2 מיליליטר של DCM שלוש פעמים. חזור על הליך הסרת ההגנה שש פעמים או עד שהתמיסה כבר לא נראית צהובה כדי להסיר את ההגנה המלאה על הציסטאין. הגנה מלאה על קבוצת Trt של ציסטאין חשובה מאוד לשלב הפוטו-ריאקציה הבא.

שוטפים את השרף במנות של מיליליטר עד שני מיליליטר של DMF ו-DCM ברצף. לאחר מכן, השרו את השרף במיליליטר עד שניים של מתנול למשך שתי דקות כדי לכווץ את השרף. מסננים את המתנול ומייבשים את השרף בגז חנקן למשך חמש דקות.

מעבירים את השרף היבש לבקבוק תחתון עגול בנפח 10 מיליליטר באמצעות נייר שקילה. השעו את השרף בשני מיליליטר של DMF זרוע חנקן. לאחר מכן, הוסף 5.6 מיליגרם של MMP ו-38 מיליגרם של MAP כיוזמי פוטו

מניחים מוט ערבוב בבקבוק, ומכסים את הבקבוק במחיצת גומי. טהר את אטמוספירת הבקבוק בגז חנקן שלוש פעמים, למשך זמן טיהור כולל של כחמש דקות. תקן את בקבוק התגובה בכור צילום המצויד במנורות UVA, כניסת גז חנקן אינרטי וצלחת ערבוב.

התחל לערבב את התערובת, וסגור את הפוטו-ריאקטור. נקה את הפוטו-ריאקטור עם ארגון למשך 10 דקות. לאחר מכן, הגדר את קצב זרימת הארגון לליטר אחד לדקה, והקרין את התערובת באור UVA למשך שעה בטמפרטורת החדר.

עקוב אחר התגובה באמצעות HPLC. שטפו, חתכו וטהרו את הפפטיד המחזורי בסיום. הכן 50 מיליגרם שרף הנושא פפטיד ליניארי הכולל שאריות מונו-S-חמש המוחלפות בגמא.

שוטפים את השרף עם DMF ו-DCM ברצף. מכווצים את השרף עם מתנול, ומייבשים אותו בגז חנקן. לאחר מכן, בבקבוק תחתון עגול בנפח 10 מיליליטר, תלו את השרף בשני מיליליטר של DMF זרוע חנקן.

הוסף לתערובת 5.6 מיליגרם MMP, 3.8 מיליגרם MAP ו-25.7 מיליגרם ציסטאין מוגן Fmoc. הוסף מוט ערבוב לבקבוק, אטום אותו במחיצת גומי וטהר את אווירת הבקבוק בגז חנקן. לאחר מכן, הקרינו את התערובת באור UVA בפוטו-ריאקטור מלא בגז חנקן אינרטי תוך ערבוב בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים.

עקוב אחר התגובה באמצעות LC-MS. לאחר השלמת הפוטו-ריאקציה, שטפו את הפפטיד הקשור ובצעו את תגובת המקרולקטמיזציה. לאחר מכן, המשך את צימוד חומצות האמינו לפפטיד המחזורי ליצירת המבנה הרצוי.

יש לחתוך ולטהר את הפפטיד בסיום. הכן 50 מיליגרם שרף הנושא פפטיד ליניארי הכולל שאריות עם אלקין מסוף המופרד בשלוש יחידות משאריות עם תיול מסוף. חתכו את הפפטיד מהשרף, וזרזו אותו עם מיליליטר אחד של אתר דיאתיל קר.

צנטריפוגה את תערובת הפפטידים בחום של 12, 000 פעמים גרם למשך שתי דקות. שפכו בעדינות את הסופרנטנט, והוסיפו עוד מיליליטר של אתר דיאתיל קר. חזור על הכביסה פעמיים נוספות ולאחר מכן יבש את שאריות הפפטיד בוואקום.

ממיסים את השאריות ב-50 מיליליטר של DMF זרוע חנקן בבקבוק תחתון עגול. הוסף 3.2 מיליגרם DMPA לתמיסת הפפטיד, ומבעבע חנקן דרך תערובת התגובה למשך 10 דקות. אטמוספירה אינרטית נדרשת בהחלט לפוטו-ריאקציה יעילה בשלב תמיסה.

אחרת, ראינו חמצון של גופרית במהלך קרינת UV. לאחר מכן, הקרינו את התערובת באור UVA מבלי לערבב בפוטו-ריאקטור מלא בגז חנקן אינרטי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עד שעה. בודדו וטהרו את הפפטיד המחזורי בסיום.

מחזוריות על שרף של פפטיד זה ייצרה פפטיד אחד קשור לאתר, חמישה פפטידים מחזוריים עם משקל מולקולרי זהה לפפטיד הליניארי. זמן החזקת ה-HPLC של המוצר המחזורי היה קצר בשתי דקות מזה של הפפטיד הליניארי. המרה טובה נצפתה גם עבור מחזוריות על שרף של מספר פפטידים קצרים אחרים.

פפטידים ליניאריים נבדקו ליכולת לעבור הידוק פפטידים באמצעות הידרותיולציה של תיול-יין המושרה על ידי פוטו. התפוקה הנמוכה של שני c יוחסה להעדפה קונפורמציונית ללכידת רדיקל ה-thiyl בקצה ה-N במהלך התכווצות למקרו-מחזור בן 20 איברים. פפטידים אחד a ו-b אחד יצרו שניהם שני איזומרים עם קישור צולב ויניל גופרתי בן שמונה איברים.

לפפטידים של המוצר, שני a-A ושני a-b, היו זמני שמירה שונים והם הופקו ביחסים שונים בזמני הקרנה שונים. ספקטרוסקופיה של תמ"ג פרוטון הצביעה על כך ששני a-A הם איזומר ה-E של הוויניל גופרתי ושניים a-B הם איזומר Z. איזומר Z היה התוצר העיקרי בעת יצירת פפטידים שני d, שניים e ושני f, אשר יוחס להעדפת הקונפורמציה במהלך היווצרות הקישור הצולב של ויניל גופרתי בן שבעה איברים.

ספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי הראתה סליל אקראי לכל צורות הפפטידים שתיים a ושני b וקונפורמציה סלילית לפפטיד שני d. פיתחנו סדרה של פרוטוקולים כימיים לבניית פפטידים קשורים בתיאואתר וויניל גופרתי על ידי שימוש בכימיה של תיו-אן וקליק. אנו מאמינים שזה יעזור לקהילת המחקר.