דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה
August 10th, 2018
כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.
שיטה זו יכולה לאפשר לחוקרים לרכוש מספר מספיק של סוגי תאים כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה ההתפתחותית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסתמכת על כמה סמנים נבחרים כדי לבודד מספר גדול של תאים שנמצאים באופן מסורתי במספרים נמוכים ex vivo. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על השתלת מח עצם טיפולית, מכיוון שהיא מאפשרת בידוד של מספר רב של אבות.
כדי להתחיל את הפרוטוקול, יש להרוות את הרגליים האחוריות ואת פלג הגוף העליון של עכבר שהוכן בעבר באתנול של 75%, ולבצע חתכים רדודים דרך העור סביב מפרק הירך בעזרת מספריים מעוקלות לרקמות. לאחר מכן, הסר והפשיט את הרגליים האחוריות. בעזרת מלקחיים, משוך בחוזקה את העור מהמותן כלפי מטה לכיוון הקרסול, חושף את השריר, והשתמש במספריים כדי להסיר את דש העור.
חותכים ממש מעל מפרק הירך והירך, ומסירים את כל הרגל האחורית על ידי חיתוך דרך העצם. בעבודה בארון בטיחות ביולוגית סטרילי, העבירו את הרגליים לאחת מצלחות הפטרי שהוכנו בעבר. השתמש במספריים כדי לחתוך ממש מתחת לקרסול, והסר בזהירות כמה שיותר מהשריר ורקמת החיבור האלסטית.
מעבירים את העצם הנקייה לצלחת הפטרי המוכנה השנייה. לאחר מכן, הפרד את עצם הירך, הברך והשוקה. בעזרת מלקחיים יש להחזיק את הרגל בברך ולאתר את המח, קו אדום קלוש בתוך חלל העצם בחלק העליון של עצם הירך ולקראת קצה השוקה.
בעזרת מספריים, חותכים את השוקה ממש מעל המקום שבו נראה שהמח מסתיים. חותכים ממש מתחת למפרק הברך, חותכים ממש מעל מפרק הברך. לאחר מכן, יש לשטוף את מח העצם מעצם הירך והשוקה.
מלאו מזרק של 10 מיליליטר במדיה שלמה מהצינור החרוטי של 50 מיליליטר, וכסו את המזרק במחט בגודל 23. החזק את העצם עם מלקחיים מעל צלחת הפטרי המוכנה השלישית, הכנס את המחט לתעלת העצם, ודחף את המדיה דרכה, שוטף החוצה את התאים. חזור על שלב זה עד שלא ניתן לראות יותר צבע דרך העצם.
המשך בהליך על ידי ריסוק האפיפיזה. בעודכם בצלחת הפטרי השנייה, החזיקו את פיקת הברך בחוזקה בעזרת מלקחיים, ומועכים את הברכיים בקצה המזרק. המשך עד שהאפיפיזה כבר לא אדומה.
בעזרת המזרק, העבירו את התאים מצלחות הפטרי השנייה והשלישית לצינור של 50 מיליליטר. פרק גושים על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה, ונסה להימנע מהיווצרות בועות. צנטריפוגה התאים.
לאחר מכן הסר את הסופרנטנט עם הפיפטה הסרולוגית, עקר את הכדור על ידי תנועה, ולייז כדוריות דם אדומות על ידי דגירה שלהן במיליליטר אחד של אמוניום כלוריד אשלגן או מאגר ליזה ACK, למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפטה סרולוגית, הוסף 40 מיליליטר של מאגר HBSS. בעזרת פיפטה סרולוגית, סננו את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה את התאים.
בעזרת פיפטה סרולוגית, הסר את הסופרנטנט ותרבית את תאי מח העצם במדיה שלמה עם 10 ננוגרם למיליליטר של עכבר רקומביננטי GM-CSF בצפיפות של אחד כפול 10 עד 6 תאים למיליליטר. בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו את התאים לצלחות תרבית רקמה, ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני, עד שהם מוכנים להמשיך בצביעה. בעדינות, אך ביסודיות, פיפטה את התאים למעלה ולמטה כדי לעקור תאים דבוקים באופן רופף.
בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו תאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה את התאים. שפכו בעדינות את הסופרנטנט, ושטפו את התאים הגלולים על ידי הוספת 30 מיליליטר של מאגר כביסה FACS, או SFWB, עם הפיפטה הסרולוגית. ואז צנטריפוגה את התאים וחזור על הכביסה.
לאחר מכן, השעו והכתים תאים לפי הוראות יצרן הנוגדנים. השעו מחדש חמש פעמים 10 לתאים השביעיים במיליליטר אחד של FWB, והוסיפו שני מיקרוגרם כל אחד של אנטי Ly-6C ואנטי CD115, המסומנים בפלואורופורים. כדי להבדיל עוד יותר בין CMP ל-MODC, הוסף שני מיקרוגרם של נוגדנים נגד CD11C.
דגרו את הדגימות למשך 30 דקות על קרח. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להוסיף 10 מיליליטר FWB, וצנטריפוגה את התאים. שפכו בעדינות את הסופרנטנט, ושטפו את התאים הגלולים על ידי הוספת 30 מיליליטר FWB עם פיפטה סרולוגית.
צנטריפוגה את התאים וחזור על הכביסה. לפני השעיית התאים, החלק את הצינור ביסודיות כדי לעקור את הגלולה. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להשעות תאים בבת אחת 10 עד 7 תאים למיליליטר FWB, וסנן אותם דרך מסנן תאים של 35 מיקרומטר.
השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים המסוננים לתוך צינור פוליפרופלין, והנח את הצינור על קרח עד שהם מוכנים למיון. הפעל את הבקרה הלא מוכתמת דרך סדרן התאים, והחל שער כדי לא לכלול פסולת קטנה וחלקיקים גרגירים מאוד. הפעל את דגימות הבקרה הפלואורסצנטיות הבודדות דרך סדרן התאים, והתאם את הפיצוי לפי הצורך.
הפעל דגימה של המדגם מרובה התוויות, והתבונן בארבע אוכלוסיות נפרדות. החל שער כדי לבודד כל אחת מארבע האוכלוסיות העיקריות. הכן צינורות איסוף על ידי הוספת מספיק סרום עגל עוברי, או FCS, כדי להשיג לפחות 20% ריכוז סופי כשהוא מלא.
לדוגמה, אם משתמשים בצינורות של חמישה מיליליטר, הוסף מיליליטר אחד של FCS לפני המיון, והסר את הצינור כשהוא מגיע לנפח כולל של חמישה מיליליטר. כדי למנוע תחלופת ממברנה וספיגת נוגדנים, שמור את כל הדגימות בארבע מעלות צלזיוס לאורך כל המיון. לאחר איסוף מספר התאים הרצוי, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים לצינור חרוטי חדש, וצנטריפוגה את התאים.
הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של FWB, וצנטריפוגה שוב את התאים. חזור על מתלה FWB בסך הכל שתי כביסות. לבסוף, הסר את הסופרנטנט לאחר הכביסה השנייה, והמשך על סמך תכנון הניסוי.
כדי לשמור על כמה שיותר ערוצים זמינים לניתוח, נבחרו באופן שגרתי תאים ברי קיימא, בהתבסס על פיזור קדימה וצדדית, למעט אירועים קטנים מאוד וגרגירים מאוד. כדי לקבוע אם אסטרטגיית שער זו שללה תאים מתים באופן מהימן, הדגימות נצבעו ב-7-Aminoactinomycin D. לתאים שנותחו מיד לאחר הקציר היו כ-10% מהתאים החיוביים ל-7-AAD, כאשר שער SSC טיפוסי של FSC הוחל על תאים מבודדים טריים ממח העצם. שיעור דומה של תאים מתים היה נוכח גם בשהייה 1 ובשהייה 3 של התרבית.
ביום החמישי, מספר התאים המתים בתוך השער הצטמצם ל-5%, ולכן שימוש בשער כדאיות כזה מתאים בדרך כלל למיון ביום החמישי ולאחריו. ציטומטריית זרימה גילתה כי בתוך אוכלוסיית Ly6C שלילית, CD115, תאים חיוביים CD3, CD45R המשיכו חזק עד יום האפס עד שלוש. ביום הרביעי נותרו רק כמה תאים חיוביים ל-CD3, CD45R, וביום החמישי והשישי לא היו תאים מבטאים CD3, CD45R; לפיכך, תוך ארבעה ימים מהתרבית ב-GM-CSF, תאים חיוביים לשושלת נעדרו למעשה, ולא זוהו כלל בימים החמישי והשישי של התרבית.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהרכב התאים תלוי באורך התרבית. מיון שלושה ימים לאחר הקטיף מניב מספרים גבוהים של שלבים מוקדמים ומעט שלבים מאוחרים, ולהיפך עבור תרביות הממוינות לאחר חמישה ימים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לבידוד אוכלוסיות גדולות של תאי מיאלואידי מונעים על ידי GM-CSF באמצעות מיון תאים במהירות גבוהה. הטכניקה מאפשרת זיהוי של חמש אוכלוסיות תאים נפרדות המבוססות על סמנים ספציפיים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה תאית
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- GM-CSF הוא קריטי להתפתחות תאים מיאלואידיים.
- שיטות מסורתיות מניבות מספר נמוך של סוגי תאים ספציפיים.
- מיון תאים במהירות גבוהה משפר את יעילות בידוד התאים.
- הבנת אוכלוסיות תאים מיאלואידיים היא חיונית למחקר אימונולוגי.
מטרת המחקר
- לספק שיטה אמינה לבידוד תאים מיאלואידיים.
- להקל על מחקר באימונולוגיה התפתחותית.
- לתמוך ביישומים טיפוליים בהשתלת מח עצם.
שיטות ששימשו
- מיון תאים במהירות גבוהה על בסיס ביטוי של Ly6C ו-CD115.
- הכנת מודלי עכברים לבידוד תאים.
- שימוש בסמנים ספציפיים להבחנה בין אוכלוסיות תאים.
- הפרוטוקול כולל צעדים מפורטים להכנת רקמות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של חמש אוכלוסיות תאים מיאלואידיים נפרדות.
- הוכחת יעילות בבידוד תאים בעלי שכיחות נמוכה.
- יישומים פוטנציאליים בסביבות טיפוליות.
- הבנה משופרת של תפקידי תאים מיאלואידיים בחסינות.
מסקנות
- השיטה משפרת משמעותית את יכולות בידוד התאים.
- היא פותחת דרכים חדשות למחקר באימונולוגיה.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הטכניקה ליישומים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable isolation of developmentally distinct myeloid progenitor and dendritic cell precursor populations from murine bone marrow cultures, supporting mechanistic studies of immune cell differentiation. By providing sufficient quantities of rare cell subsets, it facilitates functional assays and pathway analysis relevant to immunology target validation. The approach addresses a key bottleneck in preclinical immunology research where low yields limit downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid lineage commitment and progenitor function through isolation of CMP, GMP, monocyte, moMac, and moDC subsets.
- Operational Value: Uses transient surface markers (Ly6C, CD115, CD11c, MHC-II) to define discrete developmental stages for hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking surface phenotype to functional responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs).
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified cell populations in sufficient numbers for downstream functional and developmental analyses.
- Reproducibility: Relies on standardized immunophenotyping and sorting strategy to ensure consistent isolation across experiments.
- Scalability: Enables production of large cell numbers from traditional low-yield ex vivo sources, supporting assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a murine model system to study monocyte-derived dendritic cell and macrophage differentiation pathways.
- Translational Continuity: Isolated precursors allow functional comparison to inform preclinical models of innate immunity.
- Risk-Adjusted Advancement: Differential PAMP responses across subsets enable mechanistic insight into immune activation thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of myeloid progenitors prior to functional screening or mechanistic follow-up in immunology-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on myeloid differentiation pathways by providing purified progenitor and precursor populations.
- Screening: Generates standardized cell inputs for assay development targeting innate immune responses.
- Analytics: Enables quantitative comparison of subset-specific responses to stimuli such as PAMPs.
- Translational Research: Connects ex vivo isolation to functional validation in disease-relevant immune contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reproducible immunophenotyping and sorting workflow applicable across murine myeloid studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in myeloid development by enabling isolation of transient progenitor stages.
- Operational Value: Standardizes isolation of low-abundance cells using defined surface marker panels.
- Strategic Value: Improves confidence in target validation by linking phenotype to function in immune cell subsets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets through mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow harvest and flow cytometry-based cell sorting.
- Dependent on access to high-speed cell sorter and fluorochrome-conjugated antibodies against Ly6C, CD115, CD11c, and MHC-II.
- Necessitates standardization of GM-CSF culture duration to enrich desired progenitor or precursor populations.
- Involves optimization of viability gating to exclude dead cells and ensure functional integrity of sorted subsets.
- Limited to murine systems; adaptation to human models would require validation of equivalent surface markers.
