דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

שיטה זו יכולה לאפשר לחוקרים לרכוש מספר מספיק של סוגי תאים כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה ההתפתחותית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסתמכת על כמה סמנים נבחרים כדי לבודד מספר גדול של תאים שנמצאים באופן מסורתי במספרים נמוכים ex vivo. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על השתלת מח עצם טיפולית, מכיוון שהיא מאפשרת בידוד של מספר רב של אבות.

כדי להתחיל את הפרוטוקול, יש להרוות את הרגליים האחוריות ואת פלג הגוף העליון של עכבר שהוכן בעבר באתנול של 75%, ולבצע חתכים רדודים דרך העור סביב מפרק הירך בעזרת מספריים מעוקלות לרקמות. לאחר מכן, הסר והפשיט את הרגליים האחוריות. בעזרת מלקחיים, משוך בחוזקה את העור מהמותן כלפי מטה לכיוון הקרסול, חושף את השריר, והשתמש במספריים כדי להסיר את דש העור.

חותכים ממש מעל מפרק הירך והירך, ומסירים את כל הרגל האחורית על ידי חיתוך דרך העצם. בעבודה בארון בטיחות ביולוגית סטרילי, העבירו את הרגליים לאחת מצלחות הפטרי שהוכנו בעבר. השתמש במספריים כדי לחתוך ממש מתחת לקרסול, והסר בזהירות כמה שיותר מהשריר ורקמת החיבור האלסטית.

מעבירים את העצם הנקייה לצלחת הפטרי המוכנה השנייה. לאחר מכן, הפרד את עצם הירך, הברך והשוקה. בעזרת מלקחיים יש להחזיק את הרגל בברך ולאתר את המח, קו אדום קלוש בתוך חלל העצם בחלק העליון של עצם הירך ולקראת קצה השוקה.

בעזרת מספריים, חותכים את השוקה ממש מעל המקום שבו נראה שהמח מסתיים. חותכים ממש מתחת למפרק הברך, חותכים ממש מעל מפרק הברך. לאחר מכן, יש לשטוף את מח העצם מעצם הירך והשוקה.

מלאו מזרק של 10 מיליליטר במדיה שלמה מהצינור החרוטי של 50 מיליליטר, וכסו את המזרק במחט בגודל 23. החזק את העצם עם מלקחיים מעל צלחת הפטרי המוכנה השלישית, הכנס את המחט לתעלת העצם, ודחף את המדיה דרכה, שוטף החוצה את התאים. חזור על שלב זה עד שלא ניתן לראות יותר צבע דרך העצם.

המשך בהליך על ידי ריסוק האפיפיזה. בעודכם בצלחת הפטרי השנייה, החזיקו את פיקת הברך בחוזקה בעזרת מלקחיים, ומועכים את הברכיים בקצה המזרק. המשך עד שהאפיפיזה כבר לא אדומה.

בעזרת המזרק, העבירו את התאים מצלחות הפטרי השנייה והשלישית לצינור של 50 מיליליטר. פרק גושים על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה, ונסה להימנע מהיווצרות בועות. צנטריפוגה התאים.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט עם הפיפטה הסרולוגית, עקר את הכדור על ידי תנועה, ולייז כדוריות דם אדומות על ידי דגירה שלהן במיליליטר אחד של אמוניום כלוריד אשלגן או מאגר ליזה ACK, למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפטה סרולוגית, הוסף 40 מיליליטר של מאגר HBSS. בעזרת פיפטה סרולוגית, סננו את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה את התאים.

בעזרת פיפטה סרולוגית, הסר את הסופרנטנט ותרבית את תאי מח העצם במדיה שלמה עם 10 ננוגרם למיליליטר של עכבר רקומביננטי GM-CSF בצפיפות של אחד כפול 10 עד 6 תאים למיליליטר. בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו את התאים לצלחות תרבית רקמה, ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני, עד שהם מוכנים להמשיך בצביעה. בעדינות, אך ביסודיות, פיפטה את התאים למעלה ולמטה כדי לעקור תאים דבוקים באופן רופף.

בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו תאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה את התאים. שפכו בעדינות את הסופרנטנט, ושטפו את התאים הגלולים על ידי הוספת 30 מיליליטר של מאגר כביסה FACS, או SFWB, עם הפיפטה הסרולוגית. ואז צנטריפוגה את התאים וחזור על הכביסה.

לאחר מכן, השעו והכתים תאים לפי הוראות יצרן הנוגדנים. השעו מחדש חמש פעמים 10 לתאים השביעיים במיליליטר אחד של FWB, והוסיפו שני מיקרוגרם כל אחד של אנטי Ly-6C ואנטי CD115, המסומנים בפלואורופורים. כדי להבדיל עוד יותר בין CMP ל-MODC, הוסף שני מיקרוגרם של נוגדנים נגד CD11C.

דגרו את הדגימות למשך 30 דקות על קרח. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להוסיף 10 מיליליטר FWB, וצנטריפוגה את התאים. שפכו בעדינות את הסופרנטנט, ושטפו את התאים הגלולים על ידי הוספת 30 מיליליטר FWB עם פיפטה סרולוגית.

צנטריפוגה את התאים וחזור על הכביסה. לפני השעיית התאים, החלק את הצינור ביסודיות כדי לעקור את הגלולה. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להשעות תאים בבת אחת 10 עד 7 תאים למיליליטר FWB, וסנן אותם דרך מסנן תאים של 35 מיקרומטר.

השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים המסוננים לתוך צינור פוליפרופלין, והנח את הצינור על קרח עד שהם מוכנים למיון. הפעל את הבקרה הלא מוכתמת דרך סדרן התאים, והחל שער כדי לא לכלול פסולת קטנה וחלקיקים גרגירים מאוד. הפעל את דגימות הבקרה הפלואורסצנטיות הבודדות דרך סדרן התאים, והתאם את הפיצוי לפי הצורך.

הפעל דגימה של המדגם מרובה התוויות, והתבונן בארבע אוכלוסיות נפרדות. החל שער כדי לבודד כל אחת מארבע האוכלוסיות העיקריות. הכן צינורות איסוף על ידי הוספת מספיק סרום עגל עוברי, או FCS, כדי להשיג לפחות 20% ריכוז סופי כשהוא מלא.

לדוגמה, אם משתמשים בצינורות של חמישה מיליליטר, הוסף מיליליטר אחד של FCS לפני המיון, והסר את הצינור כשהוא מגיע לנפח כולל של חמישה מיליליטר. כדי למנוע תחלופת ממברנה וספיגת נוגדנים, שמור את כל הדגימות בארבע מעלות צלזיוס לאורך כל המיון. לאחר איסוף מספר התאים הרצוי, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים לצינור חרוטי חדש, וצנטריפוגה את התאים.

הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של FWB, וצנטריפוגה שוב את התאים. חזור על מתלה FWB בסך הכל שתי כביסות. לבסוף, הסר את הסופרנטנט לאחר הכביסה השנייה, והמשך על סמך תכנון הניסוי.

כדי לשמור על כמה שיותר ערוצים זמינים לניתוח, נבחרו באופן שגרתי תאים ברי קיימא, בהתבסס על פיזור קדימה וצדדית, למעט אירועים קטנים מאוד וגרגירים מאוד. כדי לקבוע אם אסטרטגיית שער זו שללה תאים מתים באופן מהימן, הדגימות נצבעו ב-7-Aminoactinomycin D. לתאים שנותחו מיד לאחר הקציר היו כ-10% מהתאים החיוביים ל-7-AAD, כאשר שער SSC טיפוסי של FSC הוחל על תאים מבודדים טריים ממח העצם. שיעור דומה של תאים מתים היה נוכח גם בשהייה 1 ובשהייה 3 של התרבית.

ביום החמישי, מספר התאים המתים בתוך השער הצטמצם ל-5%, ולכן שימוש בשער כדאיות כזה מתאים בדרך כלל למיון ביום החמישי ולאחריו. ציטומטריית זרימה גילתה כי בתוך אוכלוסיית Ly6C שלילית, CD115, תאים חיוביים CD3, CD45R המשיכו חזק עד יום האפס עד שלוש. ביום הרביעי נותרו רק כמה תאים חיוביים ל-CD3, CD45R, וביום החמישי והשישי לא היו תאים מבטאים CD3, CD45R; לפיכך, תוך ארבעה ימים מהתרבית ב-GM-CSF, תאים חיוביים לשושלת נעדרו למעשה, ולא זוהו כלל בימים החמישי והשישי של התרבית.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהרכב התאים תלוי באורך התרבית. מיון שלושה ימים לאחר הקטיף מניב מספרים גבוהים של שלבים מוקדמים ומעט שלבים מאוחרים, ולהיפך עבור תרביות הממוינות לאחר חמישה ימים.