Name: מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: למד ליצור פלטפורמה להגירה חשמלית של תאי גזע על פולימר מוליך ולהשתילם בחולדה. שיטה זו מאפשרת מחקר שבץ ואופטימיזציה של תאים לפני השתלה בגוף החי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Andreasson קטי ד ר (מחלקת נוירולוגיה ו נוירולוגיות המדע, אוניברסיטת סטנפורד) לשימוש של המכונה לרביעיית-PCR. העבודה נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08NS098876 (ל P.M.G.) בתר של סטנפורד הספר לרפואה דין (כדי ריח רע).

כל תאי גזע והתהליכים בעלי חיים, אושרו על ידי ועדת הפיקוח מחקר תאי הגזע של סטנפורד על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך (SCRO-616 ו APLAC-31909).
1. תחריט של זכוכית ITO
<ol><li>להכין את תחמוצת בדיל אינדיום (ITO)-שקופיות זכוכית מכוסה על ידי הנחת סוכן מיסוך בצד ואטימה של הזכוכית. הערה: מרבית הקלטות שקוף יכול לשמש כמסכה.<ol>
<li>להסיר את המסכה עודף באמצעות להב, להשאיר רק את הצורה הרצויה של העיצוב הסופי של איטו מכוסה על הזכוכית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשלב 5% (v/v) של חומצה חנקתית 45% (v/v) של HCl ב גביע זכוכית בתוך ברדס fume להכין את הפתרון תחריט.<ol>
<li>השתמש צלחת חמה, מד חום כדי להבטיח כי הטמפרטורה של תחריט הפתרון נשמר ב- 70 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מרגע שהתמיסה איכול 70 מעלות צלזיוס, למקם את השקופית רעולי פנים-ITO זכוכית בתוך תמיסת למשך 2 דקות להסיר את שכבת איטו עודף. הערה: הקלטת מיסוך מגן השכבה איטו החשיפה תמיסה חומצית.</li>
	<li>הסר את השקופית של הפתרון, לשטוף אותו עם יונים (DI) H2O.</li>
	<li>הסר בזהירות את ההתנגדות מסכת ולמדוד באמצעות multimeter על מנת להבטיח כי קריטון שנותרו ללא פגע. המפרט של חרוט באזור הרצוי צריך להיות כ 0 Ω.</li>
</ol>2. הכנת פירול פתרון
<ol><li>בבקבוק זכוכית 1000 מ ל, להמיס 70 גר' נתרן dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) ב- 600 מ"ל של DI H2O.</li>
	<li>ברגע NaDBS מחוסלת, להוסיף 14 מ"ל של פירול 0.2 מ' ו- mL 386 DI H2O הפתרון.</li>
	<li>לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 º C.</li>
</ol>3. electroplating של Polypyrrole על זכוכית ITO
<ol><li>לחמם את הפתרון פירול לטמפרטורת החדר עד NaDBS הוא redissolved באופן מלא. הערה: זה לוקח בערך 15-20 דקות.</li>
	<li>שופכים 25 מ של הפתרון פירול לתוך גביע.</li>
	<li>להתחבר הזכוכית איטו חרוט multimeter ויציפו את השקופית לתוך הפתרון פירול.<ol>
<li>ודא כי הצד בהתנגדות Ω 0 פונה לכיוון האלקטרודה הפניה רשת פלטינה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החל זרם חשמלי ליזום electroplating של PPy על פני השטח איטו באמצעות של multimeter (שוטף נשלטת על אמא/ס מ 32 למשך 4 שעות).</li>
	<li>הסר את הזכוכית איטו multimeter ואת כביסה electroplated-PPy DI H2O כדי להסיר שאריות חומרים פעילי שטח.</li>
	<li>ניתוק בעדינות את הצלחת electroplated PPy מהזכוכית איטו באמצעות סכין גילוח.<ol>
<li>אחסן את הצלחת PPy בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנת Polydimethylsiloxane (PDMS)
<ol><li>בעזרת מרית וקערית שוקלים, לערבב 18 גרם של סוכן הבסיס עם דור 2 של ריפוי סוכן, שופכים את התערובת לתוך תבניות זכוכית שני 10 ס"מ 8 ס"מ.</li>
	<li>הסר את הבועות התבניות באמצעות תא ואקום במשך 15-20 דקות.</li>
	<li>מניחים את התבניות בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.</li>
	<li>לאחר מקורר, להשתמש במרית שטוחה כדי להסיר את PDMS מן התבניות.</li>
</ol>5. ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה
<ol><li>אוטוקלב לוחות מתכת (WxL, 2.5 ס"מ x 12.5 ס"מ) ואת זרימת שסתומים ב 120 מעלות צלזיוס במשך שעה.</li>
	<li>באמצעות שקופית קאמרית כתבנית, לחתוך שתי חתיכות של PDMS. הערה: חתיכה אחת של PDMS משמש להיקף של התא לתא עם מגזרות של שני ריבועים צמודים מ בתוך תא התא. החלק השני PDMS היא חלוקה של השטח של התא.<ol>
<li>לחתוך החוצה הבתוך תא קאמרית כך שהוא מרובע בצורת ומתאימה את הצורה של התא לתא. ודא כי הצורה הכללית של שני החלקים של PDMS הוא מלבני המתאים של השקופית קאמרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שכבה של החומרים כמו הבאות מלמטה למעלה: (1), לוחית מתכת (2) PDMS (ללא עמלות), (3) PPy צלחת (בניצב PDMS), (4) PDMS (עם מגזרות), ו- (5) תא קאמרית.</li>
	<li>תהדק את המנגנון ביחד ברגע שיהיה מיושר לגמרי.</li>
	<li>לחתוך שתי פיסות 60 ס מ של חוט מתכת ולהשתמש הדבק כסף לחבר חוט אחד בכל קצה של צלחת PPy המגיחה מתוך החלק החיצוני של החדר. ודא החוטים מספיק זמן כדי להאריך מן המנגנון אל מחוץ אינקובטור.</li>
	<li>לאחר ההדבקה כסף הוא נרפא, לחזק, לאטום את החיבור חוט עם אפוקסי.<ol>
<li>להקליט את ההתנגדות משתמש multimeter כדי לוודא כי השדה יישומית הוא זהה בכל אחד.</li>
		<li>להשתלה, להסיר את החוטים; unclamp התאים תא, PDMS, ולאחר מכן אותם להפריד לגרדום מוליך. המימד של פיגומים מושתל הוא בערך 1 מ מ x 3 מ"מ x 0.25 מ"מ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ציפוי האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) ב- PPy
<ol><li>לעקר את התאים מורכבים תחת אור UV למשך שעתיים.<ol>
<li>לאחר שעה אחת, לסובב את שהורכב צ'יימברס 90°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר עיקור, מעיל השטח של PPy בחלק התחתון של החדר עם 800 µL של מצע ציפוי ולאפשר את המצע שבמהלכו בצלחת PPy בתוך אינקובטור ב 37 ° C-5% CO2 לשעה.</li>
	<li>לאחר שעה אחת, הסר את תגובת שיקוע של צ'יימברס, לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS + Ca + Mg לכל טוב. הערה: להימנע לשטוף את פני השטח של PPy בכוח כמו זה יגרום להתנתקות המצע ציפוי.</li>
	<li>באמצעות מדיה תא טריים, מכנית מביצועם בתרבית תאים לשימוש עם התאים מצלחת תרביות רקמה עם pipetting עדין. הערה: תאים צריך להיות 90-100% confluent על דיסוציאציה.</li>
	<li>לאסוף את כדורי hNPC באמצעות צנטריפוגה ב 8000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>שימוש של hemocytometer, לספור, resuspend את התאים בווליום של תאים/ס מ 100,0002.</li>
	<li>צלחת 100,000 התאים לתא בכל טוב (100,000 תאים/cm2 ב 1 מ"ל של מדיה).</li>
	<li>לחזור צ'יימברס חממה-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2-
</li>
</ol>7. גירוי חשמלי של hNPCs
<ol><li>יום אחד לאחר זריעה התאים על התאים, השתמש מחולל גל כדי להחיל גירוי חשמלי לתאים.</li>
	<li>לפני גירוי, להסיר מדיה זקן אחד טוב, לחדש עם 800 µL של התקשורת טריים.</li>
	<li>לאחר שינוי בתקשורת, במקום התאים בחזרה לתוך החממה, להרחיב את החוטים מתוך החממה, לצרף אותם גנרטור גל</li>
	<li>להחיל את הגירוי התאים עם אות גל מרובע ב mV ±400 עם 100 הרץ לשעה.</li>
	<li>לאחר הגירוי, להסיר את החוטים, תקופת דגירה של התא להוצאה של עוד יום בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>לבצע לאחר מכן ניתוח הביולוגי כולל הכדאיות התא, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ע פ הפרוטוקול של היצרן.</li>
</ol>8. in Vivo PPy השרשה
<ol><li>מבצע דיסטלי עורק המוח התיכון (dMCA) סגר קו הדגמים תא T לקויה למבוגרים זכר עירום חולדות (NIH-RNU 230 ± 30 g) כפי שתוארה קודם לכן2. ביצוע ההשתלה שבוע אחד פוסט-dMCA סגר.</li>
	<li>יום אחד לפני הניתוח, לתת אמפיצילין (1 מ"ג/מ"ל) לעכברושים במים הכלוב שלהם.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכברוש באמצעות לשכת אינדוקציה 0.5 - 3% מ"ג/ק"ג של איזופלוריין מנוהל באמצעות אינהלציה.</li>
	<li>לאשר ההרדמה של העכברוש על ידי חוסר תגובת רפלקס של קמצוץ הבוהן.<ol>
<li>בעוד החיה תחת הרדמה, להמשיך לפקח שלה ממברנה צבע דפוס הנשימה, טמפרטורה רקטלית כל 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר ההרדמה הוא אישר, החל דמעות מלאכותיות על עיני עכברוש למניעת יובש.</li>
	<li>ודא כי הטכניקה aseptic תישמר במהלך הליך זה על-ידי שימוש בכפפות סטריליות, מאסו כירורגי סטרילי13. לשמור על כלי כירורגי סטרילי בתוך שדה סטרילי.</li>
	<li>בעוד העכברוש הוא בהרדמה, תרגיל של craniectomy מעל קליפת המוח השמאלי. פתח את השכבה הקשה של המוח.<ol>
<li>הסר את הדורה המוח באמצעות מחט דק מיקרו כירורגי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שתל פיגומים מוליך ממערכת במבחנה על גבי קליפת חולדה. הערה: לניסויים שלנו, אנחנו מושתלים פיגומים מיום במבחנה 3 לאחר ציפוי hNPC.<ol>
<li>למקם את השתל בעיקר על קליפת penumbral המדיאלי כדי הנגע שבץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר לגרדום מושם, הצב surgicel מעל השתל כדי למנוע תנועה עם העור סגירה.</li>
	<li>לתפור הפצע סגור, subcutaneously להחדיר את החולדות. הבופרנורפין SR במינון של 1 מ ג/ק ג כדי לנהל את הכאב קשור dMCA סגר ובבית stereotaxic.</li>
	<li>מקום העכברוש בכלוב שחזור זה להכרתו.<ol>
<li>לעולם לא תעזוב את החיה ללא התערבות כשהוא מחוסר הכרה.</li>
		<li>אין למקם את החיה עם אחרים עד מלא זכה להכרה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יפקח חיות מדי יום עבור סימנים של כאב כולל ירידה במשקל הגוף, צריכת מזון ירידה/מים, המעיל פרוע/לטפח מופחתת, ירד/מוגברת פעילות ספונטנית, יציבה נורמלית, התייבשות/עור להקים אוהל, עיניים שקועות, מסתור, השחתה עצמית נשימה מהירה נשימה בפה פתוח, מתעוות, רועדת, רעד, הניקוד.<ol>
<li>לנטר את החיות מדי יום עד שיופיע כי הם לאכול, לשתות, טיפוח, לעלות במשקל; ואז שבועי לאחר עלייה במשקל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanization מוקדמת דרך שאיפת2 CO ואישור משני euthanization (על מנת להבטיח את החיה לא ישוב כתוצאה מהשאיפה של2 CO פוסט של חמצן נורמלית האספקה) יחולו כל חיה שמופיע כדי לא לאכול, לשתות, לעלות במשקל לאחר ההליך הכירורגי הראשוני; מופיע כאב; או מופיעה אפשרות להשלים את הבדיקות התנהגותיות עקב גדול יותר מאשר צפוי גירעון של קורטקס מוטורי.</li>
</ol>

<ol><li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Science+of+Stroke%3A+Mechanisms+in+Search+of+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Preconditioning+of+Stem+Cells+with+a+Conductive+Polymer+Scaffold+Enhances+Stroke+Recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery.</a> Biomaterials. 142, 31-40 (2017).</li>
<li>Steinberg, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+of+Transplanted+Modified+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Stroke%3A+A+Phase+1%2F2a+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study.</a> Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Stroke+Therapeutics%3A+Unraveling+Stroke+Pathophysiology+and+Its+Impact+on+Clinical+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Schabitz, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Enhances+Poststroke+Sensorimotor+Recovery+and+Stimulates+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis.</a> Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).</li>
<li>Liauw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+1+and+2+Are+Necessary+For+Synaptic+Plasticity+and+Functional+Recovery+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).</li>
<li>Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Encapsulating+Biomaterial+Regulates+Mesenchymal+Stromal%2FStem+Cell+Differentiation+and+Macrophage+Immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+Tunable+Stress+Relaxation+Regulate+Stem+Cell+Fate+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
<li>Ballios, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hyaluronan-Based+Injectable+Hydrogel+Improves+the+Survival+and+Integration+of+Stem+Cell+Progeny+following+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+Injured+Spinal+Cord+by+Transplantation+of+Neural+Stem+Cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+Biomaterials%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Cases%22%5BJournal%5D)">Implant Biomaterials: A Comprehensive Review.</a> World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).</li>
<li>Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Stimulation+Elicits+Neural+Stem+Cells+Activation%3A+New+Perspectives+in+CNS+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair.</a> Front Hum Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Abdelwahid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Death+and+Survival+in+Heart+Regeneration+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair.</a> Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Status+of+Stem+Cell+Therapy+for+Ischemic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+Biocompatibility+of+Polypyrrole+Implants+Suitable+for+Neural+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics.</a> Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).</li>
<li>Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Induces+Proliferation+of+Human+Airway+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells.</a> J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).</li>
<li>Lopes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+2+Regulates+Cell+Proliferation+Induced+by+Rac1+Redox-Dependent+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).</li>
<li>Ploughman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Contributes+to+Recovery+of+Skilled+Reaching+After+Focal+Ischemia+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats.</a> Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).</li>
<li>Baker, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Stem+Cell+Therapy+Enhances+Recovery+in+an+Ischemic+Stroke+Pig+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model.</a> Sci Rep. 7 (1), 10075(2017).</li>
<li>Bacigaluppi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Transplantation+Induces+Stroke+Recovery+by+Upregulating+Glutamate+Transporter+GLT-1+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להצהיר עם עבודה זו.

גדל ראיות הוכיחה את ההבטחה של תאי גזע כטיפול קו הרומן. הבטחה זו הובילה מאמץ גדול כדי להתקדם תאי גזע הרפוי המיטה לפחות 40 הניסויים הקליניים מתמשכים או שהושלמו. קו פתולוגיה מציע הפרעה נוירולוגית ייחודי זה הוא משאיל את עצמו טיפול בתאי גזע כי לאחר העלבון חריפה, שום תהליך ניווניות מניעת שחזור. המנגנון המדויק של התאוששות משופרת תאי גזע שבץ עדיין לא ברור. אנגיוגנזה, synaptogenesis וסינפטית שיפוץ כל הוכחו להיות חשוב. כאשר מולקולות חשוב עבור סינפסה היווצרות כגון BDNF ו- THBS-1 אינן מוסרות, קו שחזור הוא לקוי6</su...

שבץ מוחי הוא הסיבה המובילה השניה של מוות בעולם, הגורם המוביל החמישי המוות בארצות הברית. למרות אלה שיעורי התמותה גבוהים, טיפולים להחלמה שבץ נותרו כיום אתגר עם אפשרויות רפואי קיימא זמין כעת1. כרגע יש כ 300 ניסויים קליניים העוסקים שבץ איסכמי, מהם 40 רק לנצל את תאי גזע. מחקרים קודמים הראו כי תאי הגזע טיפולים יש השפעה מיטיבה על קו-תיקון-2,-3. גורמים Paracrine כמו neurotrophic המוח-derived factor (BDNF) ו- thrombospondin-1 (THBS-1) שוחררו המושתלים האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) הראו התאוששות פונקציונליות משופרת באמצעות מנגנונים הקשורים עם עלייה סינפסה היווצרות, אנגיוגנזה, מסעף דנדריטים, תחזיות עצב חדשים, כמו גם הכוח ויסות מערכת החיסון4,5,6. עם זאת, השיטות אספקה אופטימלים של תאי גזע נשארים חמקמקים.
משלוח מוצלח בתאי גזע המוח נשאר אתגר. כיום, הידרוג להזרקה ומערכות פיגומים פולימריים הוכנסו להעביר תאי גזע. שיטות משלוח אלה להגן על תאי גזע במהלך ההשתלה, כמו גם להציע הגנה מפני הקשים שלאחר שבץ כולל תגובה דלקתית של המחשב המארח, תנאים ובשפתיים-7,-8,-9 , 10. עם זאת, החומרים הנפוצים הם ללא ניע, אשר מגביל את השימוש אפנון רציפה (קרי, גירוי חשמלי) של תאים11. גירוי חשמלי הוא רמז המשפיע בידול, יון ערוץ צפיפות ו- neurite המוצלח תאי גזע12. לעומת פולימרים אינרטי, פולימרים מוליכים יכול לשאת הנוכחי המאפשר גירוי חשמלי ומניפולציה של תאי גזע2. עם זאת, המנגנון המדויק שבו גירוי חשמלי ממיקרו neurotrophic גורם לשחרור (קרי, BDNF ו- THBS-1) הוא חקר עדיין לא לגמרי.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי לבנות מערכת התרבות התא המורכב לפיגום פולימר מוליך, polypyrrole (PPy), המאפשר במבחנה גירוי חשמלי. בשל האופן שבו מערכת התרבות התא הוא מפוברק, אפשרי בהמשך השרשת לגרדום נזרע תאי גזע על גבי קליפת פרי-לאוטם. למערכת זו, אנחנו חשמלית כתנאי תאי גזע על הגרדום פרק זמן קצר לפני ההשתלה. בעקבות גירוי חשמלי, לגרדום פולימר מוליך נושא את התאים בהצלחה קטנטנים intracranially באמצעות שיטת פולשנית.

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>20 ננוגרם/מ"ל למדיה עובדת</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>cb40234a</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>חלבון LIF, Recom. Hum. (10 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td> <td>EMD Millipore</td><td>LIF1010</td><td>10 ננוגרם/מ"ל למדיה</td></tr><tr><td>עובדת סילגארד 184 סיליקון 3.9 ק"ג</td><td>פישרברנד</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישרברנד</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>תרכיז חומצה חנקתית (מוסמך) ACS, פישר כימיקל</td><td>פישרbrand</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>ITO זכוכית</td><td>דלתא טכנולוגיות</td><td>CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודצילבנזנסולפונאט</td><td>סיגמא</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>פירול</td><td>סיגמא</td><td>131709-500 מ"ל</td><td>הגן על תמיסת פירול מפני אור וטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>8 בארות תאי שקופיות זכוכית</td><td>Thermo Sci Nuc&nbsp;</td><td>125658</td><td>נתק את תא התא ושמור אותו בתנאים מעוקרים</td></tr><tr><td>תושבת משטח שטוח, 3 "x1"</td> <td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>צבע כסף שני חלקים 14G</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית&nbsp;</td><td>1264214</td><td>מערבבים שני חלקים (1:1) בצלחת פלסטיק</td></tr><tr><td>DPBS, 1x, עם Ca ו-Mg, ללא פנול אדום</td><td>Genesse&nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA ערכת מדיה לתרבית תאים עצביים</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1 ערכת הרחבת אב עצבי אנושי</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>&nbsp; hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>שסתום כוונון זרימה ללא מגע, פליז מצופה ניקל, עבור צינור 3/32 אינץ' עד 5/8 אינץ' OD</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>5330K22</td><td></td></tr><tr><td>מולטימטר</td><td>Keysight&nbsp;</td><td>E3641A</td><td></td></tr><tr><td>מחולל קצף גל</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>רשתות Pt</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>אלקטרודת ייחוס עם מידות, 1x1 ס"מ</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD כדאיות/ערכת ציטוטוקסיות, לתאי יונקים</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02718934_s1</tr><tr><td>THBS1</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hs00962908_m1 GAPDH</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני Hs02758991_g1 RNeasy (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAמגרסה (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>סט DNase ללא RNase (50)</td>ערכת סינתזה <td>של QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA, 100 x 20 & L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>4369510</tr><tr><td>בן 7-8 שבועות, זכר, חולדות RNU</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 תפר משי אתיקון</td><td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 מערכת הרדמה לבעלי חיים במעבדה שולחנית</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel מקורי נספג Hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי סטנדרטי במעבדה, Rat</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; כפפות בדיקה סטריליות Safeskin Purple Nitrile Sterile Fisherbrand</td><td></td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>וילון סטרילי</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; ידית להב אזמל נירוסטה של שנדון, מחזיקה מס' 20-25 להבים</td><td>פישרברנד</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל וולטר שטרן סדרה 300</td><td>פישרברנד</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex מערכת PCR בזמן אמת תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>פרייז'ר מיקרו חיתוך</td><td>וו הרווארד מנגנון</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

טיפול בתאי גזע התפתחה משיכת מרגש טיפולית, אך שיטת אספקה אופטימלים נשאר לא ברור. בעוד בטכניקה של microinjection שימש במשך עשרות שנים כדי לספק תאי גזע במודלים שבץ, טכניקה זו מוגבל על ידי חוסר היכולת לתפעל את תאי הגזע לפני ההזרקה. מאמר זה מפרט שיטה של שימוש בפיגומים פולימר מוליך חשמלי של תאי גזע למסירה. גירוי חשמלי של תאי גזע באמצעות לפיגום פולימר מוליך הפיצולים של התא גזע גנים המעורבים ב הישרדות cell, תגובה דלקתית ו שיפוץ סינפטית. לאחר preconditioning חשמליים, תאי גזע על הגרדום מושתלים intracranially במודל חולדה סגר דיסטלי עורק המוח התיכון. פרוטוקול זה מתאר טכניקה חזקה לתמרן תאי גזע דרך לפיגום פולימר מוליך ויוצר כלי חדש כדי להמשיך ולפתחו טיפול המבוסס על תאי גזע.

התרשים המוצג באיור 1 מייצג את זרימת העבודה הכוללת של גירוי חשמלי של hNPCs והיישומים פוטנציאלית במורד הזרם. מגבלה הנוכחי של טיפול בתאי גזע הוא כי תאי גזע נחשפים סביבת שלאחר השתלת קשים כולל דלקת ותנאים איסכמי. אלה התנאים הקשים סביר להגביל את היעילות הטיפולית14,15. השימוש לפיגום מוליך על hNPCs מפני סביבה זו עשוי להגדיל את היתרונות הטיפוליים hNPCs דרך preconditioning חשמל. הצעד הראשון בטכניקה זו מסירה תאי...

פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פלטפורמה לגירוי חשמלי במבחנה של תאי גזע על פיגום פולימרי מוליך, עם השתלה in vivo לאחר מכן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר שבץ וביולוגיה של תאי גזע על ידי מתן אמצעי לווסת תאי גזע. היתרון העיקרי הוא שניתן לבצע אופטימיזציה של תאי הגזע במבחנה, ולאחר מכן להשתיל אותם.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התאוששות משבץ מוחי, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כשיטת העברת תאים חדשה. בדרך כלל, משתמשים חדשים בטכניקה זו יתקשו בשל הדיוק הנדרש להרכבת תא התא, והטכניקה הכרוכה בכריתת הקרניקטומיה. בהכנה יש לבצע חיטוי של לוחות המתכת בגודל 2.5 על 12.5 ס"מ ושסתומי הזרימה.לאחר מכן, בעזרת שקופית קאמרית כתבנית, חותכים שתי חתיכות PDMS. חתיכה אחת משמשת לקווי מתאר של היקף החדר. על החתיכה השנייה, גזרו שתי חתיכות סמוכות מבפנים של שקופית החדר.שני החלקים צריכים להיות מלבניים ולהתאים למגלשת החדר. כעת, שכבו את החומרים. התחל עם לוחית המתכת, לאחר מכן ה-PDMS הלא חתוך, לאחר מכן לוחית הפוליפירול, המכוונת בניצב, לאחר מכן ה-PDMS עם חיתוכים, ולבסוף, תא התא.יישר את השכבות בזהירות והדק את המנגנון יחד. לאחר מכן, חותכים שני אורכים של חוט מתכת כדי להרחיב מהמנגנון אל החלק החיצוני של החממה שתכיל אותו. אורכים של 60 סנטימטר הם בדרך כלל ארוכים מספיק.לאחר מכן, השתמש במשחת כסף כדי לחבר חוט לכל קצה של לוחית הפוליפירול הבולטת מהחלק החיצוני של החדר. לאחר ריפוי משחת הכסף, חזקו ואטמו את החיבורים באמצעות אפוקסי. כעת, רשום את ההתנגדות על פני המכלול באמצעות מולטימטר.השדה המיושם חייב להיות זהה בכל חדר. לאחר מכן, צלח את התאים על המכלול, ועורר אותם חשמלית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני השתלת התאים, הסר את החוטים מהמכלול.לאחר מכן, שחררו את תאי התאים והפרידו את ה-PDMS מהפיגום המוליך. הפיגום מוכן כעת להשתלה. יום אחד לפני הניתוח, ספקו לבעל החיים הנבדק אמפיצילין במי השתייה שלו.ביום הניתוח, יש להרדים את החולדה באיזופלורן, ולאשר את ההרדמה בצביטה בבוהן. כעת, מרחו דמעות מלאכותיות על עיני החולדה כדי לשמור עליהן לחות. לאחר גילוח הגולגולת, עטפו את החיה והתכוננו לניתוח סטרילי.ללבוש בגדי מגן, לפרוק את הכלים המעוקרים ולעקר את הקרקפת. לכריתת הקרניקטומיה, קדחו חור מעל קליפת המוח השמאלית עד לדורה מאטר. הפוך את הפתח למעט גדול יותר מ -1 על 3 מילימטרים, גודל השתל.לאחר מכן, פתחו את הדורה והוציאו את הדורה מאטר מהמוח באמצעות מחט כירורגית דקה. הסר את האסדה מחממת תרבית TC והשבת את האסדות. לאחר מכן, השתלו בזהירות את הפיגום המוליך ממערכת המבחנה על קליפת המוח של העכברוש.לאחר מכן כסו את השתל ב-Surgicel כדי לאבטח אותו, אחרת הוא עלול לזוז במהלך סגירת העור. כעת, תפרו את הפצע בעזרת תפר משי 4-0. לאחר השלמת התפרים, יש להזריק לחולדות תת עורית בופרנורפין SR. לאחר מכן, הנח את החולדה בכלוב התאוששות עד שהיא חוזרת להכרה.ההליך שלאחר הניתוח מפורט בפרוטוקול הטקסט. תאי אב עצביים אנושיים נחשפו לגירוי חשמלי, ולאחר מכן נצבעו במבחני כדאיות התאים. הצבע הירוק מעיד על תא חי.התאים הצליחו בבירור לשרוד את הגירוי החשמלי. גורמים ששוחררו מתאי האב העצביים החשובים בהתאוששות משבץ הוערכו ממיקרוגרם אחד של RNA כולל באמצעות RTPCR כמותי. לאחר נורמליזציה של התוצאות בשיטת סף מחזור דלתא דלתא, הם חושפים אז את החשיפה לגירוי חשמלי מווסתת את ביטוי BDNF ו-THBS1.לאחר צפייה בהליך זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מערכת תרבית תאים לתאי גזע מוליכים חשמלית, ולאחר מכן להשתיל את תאי הגזע הללו במודל חולדה. לאחר ששולטים בו, ניתן לבצע את ההליך תוך 45 דקות אם הוא מבוצע כראוי. בזמן שאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור תמיד לעקוב אחר בעלי החיים עבור דפוס נשימה תקין וצבע הממברנה, כדי להבטיח הרדמה נכונה.אל תשכח שעבודה עם חולדות ותאי גזע עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת PPE מתאים.

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות...

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

סרטון זה מדגים את ההליך של ייצור מיקרו-נשא חוץ-תאי שמקורו במטריצה על ידי התזה חשמלית. מיקרו-נשאים אלה מדמים את המיקרו-סביבה הספציפית לרקמה המקומית והם יציבים במודלים ארוכי טווח של תרביות תאים במבחנה תלת-ממדית.

ייצור פיגומים ביולוגיים על ידי התזה חשמלית: טכניקה ליצירת פיגומים מיקרו-נשאיים שמקורם במטריצה חוץ-תאית של רקמה דה-צלולרית

ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב.  עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

מאמר זה מתאר מגוון של מערכים לזריעת תאי גזע מזנכימליים אנושיים על חומרים, במקרה זה חוטים אלקטרו-ספוניים, שאינם מכסים את הבסיס של לוחות באר תרבית סטנדרטיים על מנת למקסם ולכמת את מספר התאים שמתחברים בתחילה בהשוואה לצפיפות הזריעה הידועה.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

מאמר זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית מרובה שכבות תאי גזע סדינים עם מאפיינים חיוביים תאי גזע.

בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע Mesenchymal עם מערכת תרבות דינמית תלת-ממד

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להקמת תא התרבות תאים שנועדו לחשוף תאים לסוגים שונים של גירוי חשמלי, ושימוש בו בטיפול גזע mesenchymal כדי לשפר את הבידול osteogenic.

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

מתודולוגיה זו שואפת להמחיש את המנגנונים שבהם מדובר ברמזים של מטריקס כגון קשיות המצע, הרכב החלבון ומורפולוגיה התא ויסות התא Schwann (SC) פנוטיפים.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

מאמר זה מציג אסטרטגיה לבניית מודלים אלמנט סופי של חומרים מוליכים סיביים החשופים לשדה חשמלי (EF). ניתן להשתמש במודלים כדי להעריך את הקלט החשמלי שהתאים שזורעים בחומרים כאלה מקבלים ולהעריך את ההשפעה של שינוי תכונות החומר המרכיבות את הפיגומים, המבנה או הכיוון שלו.

מידול אלמנט סופי של מיקרו-סביבה חשמלית תאית

למד ליצור פלטפורמה להגירה חשמלית של תאי גזע על פולימר מוליך ולהשתילם בחולדה. שיטה זו מאפשרת מחקר שבץ ואופטימיזציה של תאים לפני השתלה בגוף החי.

מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

גלה סרטונים נוספים