מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע
13 באפריל 2018
פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פלטפורמה לגירוי חשמלי במבחנה של תאי גזע על פיגום פולימרי מוליך, עם השתלה in vivo לאחר מכן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר שבץ וביולוגיה של תאי גזע על ידי מתן אמצעי לווסת תאי גזע. היתרון העיקרי הוא שניתן לבצע אופטימיזציה של תאי הגזע במבחנה, ולאחר מכן להשתיל אותם.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התאוששות משבץ מוחי, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כשיטת העברת תאים חדשה. בדרך כלל, משתמשים חדשים בטכניקה זו יתקשו בשל הדיוק הנדרש להרכבת תא התא, והטכניקה הכרוכה בכריתת הקרניקטומיה. בהכנה יש לבצע חיטוי של לוחות המתכת בגודל 2.5 על 12.5 ס"מ ושסתומי הזרימה.
לאחר מכן, בעזרת שקופית קאמרית כתבנית, חותכים שתי חתיכות PDMS. חתיכה אחת משמשת לקווי מתאר של היקף החדר. על החתיכה השנייה, גזרו שתי חתיכות סמוכות מבפנים של שקופית החדר.
שני החלקים צריכים להיות מלבניים ולהתאים למגלשת החדר. כעת, שכבו את החומרים. התחל עם לוחית המתכת, לאחר מכן ה-PDMS הלא חתוך, לאחר מכן לוחית הפוליפירול, המכוונת בניצב, לאחר מכן ה-PDMS עם חיתוכים, ולבסוף, תא התא.
יישר את השכבות בזהירות והדק את המנגנון יחד. לאחר מכן, חותכים שני אורכים של חוט מתכת כדי להרחיב מהמנגנון אל החלק החיצוני של החממה שתכיל אותו. אורכים של 60 סנטימטר הם בדרך כלל ארוכים מספיק.
לאחר מכן, השתמש במשחת כסף כדי לחבר חוט לכל קצה של לוחית הפוליפירול הבולטת מהחלק החיצוני של החדר. לאחר ריפוי משחת הכסף, חזקו ואטמו את החיבורים באמצעות אפוקסי. כעת, רשום את ההתנגדות על פני המכלול באמצעות מולטימטר.
השדה המיושם חייב להיות זהה בכל חדר. לאחר מכן, צלח את התאים על המכלול, ועורר אותם חשמלית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני השתלת התאים, הסר את החוטים מהמכלול.
לאחר מכן, שחררו את תאי התאים והפרידו את ה-PDMS מהפיגום המוליך. הפיגום מוכן כעת להשתלה. יום אחד לפני הניתוח, ספקו לבעל החיים הנבדק אמפיצילין במי השתייה שלו.
ביום הניתוח, יש להרדים את החולדה באיזופלורן, ולאשר את ההרדמה בצביטה בבוהן. כעת, מרחו דמעות מלאכותיות על עיני החולדה כדי לשמור עליהן לחות. לאחר גילוח הגולגולת, עטפו את החיה והתכוננו לניתוח סטרילי.
ללבוש בגדי מגן, לפרוק את הכלים המעוקרים ולעקר את הקרקפת. לכריתת הקרניקטומיה, קדחו חור מעל קליפת המוח השמאלית עד לדורה מאטר. הפוך את הפתח למעט גדול יותר מ -1 על 3 מילימטרים, גודל השתל.
לאחר מכן, פתחו את הדורה והוציאו את הדורה מאטר מהמוח באמצעות מחט כירורגית דקה. הסר את האסדה מחממת תרבית TC והשבת את האסדות. לאחר מכן, השתלו בזהירות את הפיגום המוליך ממערכת המבחנה על קליפת המוח של העכברוש.
לאחר מכן כסו את השתל ב-Surgicel כדי לאבטח אותו, אחרת הוא עלול לזוז במהלך סגירת העור. כעת, תפרו את הפצע בעזרת תפר משי 4-0. לאחר השלמת התפרים, יש להזריק לחולדות תת עורית בופרנורפין SR. לאחר מכן, הנח את החולדה בכלוב התאוששות עד שהיא חוזרת להכרה.
ההליך שלאחר הניתוח מפורט בפרוטוקול הטקסט. תאי אב עצביים אנושיים נחשפו לגירוי חשמלי, ולאחר מכן נצבעו במבחני כדאיות התאים. הצבע הירוק מעיד על תא חי.
התאים הצליחו בבירור לשרוד את הגירוי החשמלי. גורמים ששוחררו מתאי האב העצביים החשובים בהתאוששות משבץ הוערכו ממיקרוגרם אחד של RNA כולל באמצעות RTPCR כמותי. לאחר נורמליזציה של התוצאות בשיטת סף מחזור דלתא דלתא, הם חושפים אז את החשיפה לגירוי חשמלי מווסתת את ביטוי BDNF ו-THBS1.
לאחר צפייה בהליך זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מערכת תרבית תאים לתאי גזע מוליכים חשמלית, ולאחר מכן להשתיל את תאי הגזע הללו במודל חולדה. לאחר ששולטים בו, ניתן לבצע את ההליך תוך 45 דקות אם הוא מבוצע כראוי. בזמן שאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור תמיד לעקוב אחר בעלי החיים עבור דפוס נשימה תקין וצבע הממברנה, כדי להבטיח הרדמה נכונה.
אל תשכח שעבודה עם חולדות ותאי גזע עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת PPE מתאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת תרבית תאים להזרעת תאי גזע על פיגום פולימר מוליך. המערכת מאפשרת גירוי חשמלי in vitro ולאחר מכן השתלה in vivo באמצעות טכניקה זעיר-פולשנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- טכניקות של גירוי חשמלי
רקע
- שיטה זו שואפת למטב תאי גזע למחקר בהחלמה משבץ מוחי.
- הוא מספק גישה חדשנית לוויסות התנהגות תאי גזע.
- דיוק הוא קריטי להרכבה מוצלחת של תא התאים.
- כולל טכניקה של קרניאקטומיה (הסרת חלק מגולגולת) זעיר-פולשנית לצורך השתלה.
מטרת המחקר
- ליצור פלטפורמה לגירוי חשמלי של תאי גזע in vitro.
- להקל על השתלה של תאי גזע שעברו אופטימיזציה in vivo.
- לחקור יישומים במחקר של שבץ מוחי ומערכות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של פיגום פולימר מוליך.
- זריעה של תאי גזע על הפיגום.
- גירוי חשמלי in vitro של תאי הגזע.
- טכניקה להשתלה פולשנית מינימלית.
תוצאות עיקריות
- אופטימיזציה מוצלחת של תאי גזע להשתלה.
- תובנות לגבי ויסות התנהגות תאי גזע.
- יישומים פוטנציאליים בהשקמה משבץ מוחי ובשיטות להחדרת תאים.
- זיהוי אתגרים עבור משתמשים חדשים בנושאי דיוק וטכניקה.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך למחקר תאי גזע.
- היא משפרת את ההבנה של מנגנוני ההחלמה משבץ מוחי.
- חקירה נוספת עשויה להוביל לפריצות דרך בטיפול תאי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פיגומים מוליכים חשמלית להחדרה של תאי גזע מציעים פלטפורמה חדשנית לוויסות הפנוטיפ התאי לפני השתלה, ובכך נותנים מענה לאתגר מרכזי ברפואה רגנרטיבית ובמידול מחלות נוירולוגיות. גישה זו מאפשרת אופטימיזציה in vitro של תכונות תאי הגזע, דבר התומך בביטחון ניבוי במחקרי in vivo עוקבים ומקל על התקדמות מותאמת סיכונים במסלולים פרה-קליניים. המודולריות של השיטה ממצבת אותה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר עבור יישומים מגוונים של טיפול תאי והנדסת רקמות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תגובת תאי גזע לרמזים חשמליים, ובכך מבהיר מסלולים מכניסטיים הרלוונטיים להישרדות תאים ולנוירו-רגנרציה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות למודולציה ולהערכה של ביטוי גנים הקשורים לתוצאות טיפוליות לפני השתלה.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות קורלציה בין התניה מוקדמת in vitro לבין ביצועים in vivo במודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין אוכלוסיות תאי גזע סטנדרטיות שעברו התנייה חשמלית מוקדמת עבור בדיקות המשך הניתנות לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של ביטוי גנים וחיוניות תאים לאחר גירוי, ובכך תומך בפיתוח בדיקות.
- מספק פלטפורמה להערכה ניתנת להרחבה (scalable) של פרמטרי פיגום וגירוי על פני סוגי תאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודולציה של תאים in vitro למודלים in vivo רלוונטיים למחלה, ובכך תומכת בגילוי ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשרת רציפות משלב אופטימיזציה של תאים בשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני במודלים של פגיעות נוירולוגיות.
- תומכת בקבלת החלטות מותאמות סיכונים על ידי קישור השפעות של התנייה מוקדמת (preconditioning) לתוצאות פונקציונליות לאחר השתלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף השלב של הגילוי ועד למסלול הפרה-קלמיני על ידי התמkinת מודולציה של תאי גזע in vitro, ולאחריה בדיקות in vivo במודלים של מחלות כגון שבץ מוחי. היא תומכת באופטימיזציה איטרטיבית ובניתוחים השוואתיים בין תנאים ניסויים שונים.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת פלטפורמה לבדיקת השערות לגבי השפעת גירוי חשמלי על הפנוטיפ של תאי גזע ועל ביטוי גנים.
- סריקה: מספקת אוכלוסיות תאים ה preconditioned הניתנות לשחזור עבור בדיקות תפקודיות המשך.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של ביטוי גנים וחיוניות, התומכת בקבלת החלטות מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין אופטימיזציה in vitro למחקרי יעילות in vivo במודלים רלוונטיים של בעלי חיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה מודולרית הניתנת להתאמה לסוגי תאים שונים ולהקשרים טיפוליים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתוצאות טיפולים תאיים על ידי מתן אפשרות למודולציה והערכה לפני השתלה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת תאים והפעלה, תוך שיפור השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי קישור אופטימיזציה in vitro לביצועים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפולים תאיים ודרכי הובלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, בגירוי חשמלי ובניתוחים בבעלי חיים קטנים.
- נדרשת הרכבה מדויקת של תאי תאים רב-שכבתיים ופיגומים מוליכים.
- נדרש מיכשורי מעבדה מתוקף לצורך גירוי חשמלי ואנליזה כמותית של ביטוי גנים.
- סטנדרטיזציה בין צוותים חיונית להבטחת הדירות (reproducibility) בין ניסויים ואתרים שונים.
- התאמה לסוגי תאים אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה ותיקוף של הפרוטוקול.
