Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את יכולת הסרום שנאסף מקופי מקוק רזוס נגועים בנגיף הזיקה לתווך שיפור תלוי נוגדנים של זיהום בנגיף דנגי במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לשיפור תלוי נוגדנים של זיהום דנגי הנגרם על ידי נוגדנים צולבים המושרים על ידי נגיף זיקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא טרופר גבוה, פשוטה וקלה לביצוע.

מי שידגים את ההליך הזה יהיה וויליאם ואליאנט, סטודנט לתואר שני במחלות זיהומיות, במעבדה שלי. התחל בהפשרת דגימות הסרום בטמפרטורת החדר. לאחר ההפשרה, העבירו 100 מיקרוליטר מכל דגימת סרום לצינור סטרילי וחממו והפעילו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, בצע דילולים סדרתיים פי 10 של דגימת הסרום הנעים בין אחד לאחד, לאחד לאלף ב-RPMI 10 קר. לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר מכל דגימת סרום מדוללת לבארות של צלחת סטרילית של 96 בארות V-bottom. לאחר מכן, יש להפשיר חלקיקים נגיפיים של דנגי 1, 2, 3 ו-4 פרופורטר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, מה שמבטיח נפח של כ-170 מיקרוליטר מכל RVP לדגימת סרום.

לאחר ההפשרה, העבירו מיד את צינורות ה-RVP לקרח. לאחר מכן הזרימו 10 מיקרוליטר של RVPs לבארות המכילות דילול דגימות סרום לבארות ללא בקרת סרום. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד עשר פעמים.

העבירו את הצלחת התחתונה של 96 בארות V לחממה ודגרו למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס, בנוכחות 5% פחמן דו חמצני. בזמן שהצלחת התחתונה של 96 בארות V דוגרת, נקה את פני ארון הבטיחות הביולוגית עם 70% אתנול, והפעל את אור ה-UV למשך 15 דקות. לאחר מכן הסר בקבוק T-75 מלא של תאי K562 מהחממה.

מערבבים היטב את התאים בעזרת פיפט סטרילי של חמישה מילימטר ומעבירים חמישה מיליליטר לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הסר 10 מיקרוליטר תאים מהצינור, ערבב עם 10 מיקרוליטר טריפן כחול והעמיס להמוציטומטר. ספור את התאים וחשב את מספר התאים הכולל.

לאחר צנטריפוגה של התאים ב-12 מאות פעמים G למשך 10 דקות, יש לשפוך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את התאים ב-RPMI 10 חם בריכוז של 80 אלף תאים לכל 30 מיקרוליטר מדיה. לאחר הוצאת הצלחת התחתונה של 96 בארות V מהחממה, העבירו 30 מיקרוליטר של תאי K562 לכל קיר של צלחת 96 בארות V-bottom. ומערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד עשר פעמים.

ואז החזירו את הצלחת לחממה למשך שעה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצלחת ב -12 מאות פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, יש לשפוך את המדיה מהבארות על ידי הפיכת הצלחת למיכל המכיל 10% אקונומיקה.

לאחר מכן שטפו את התאים בכל קיר על ידי השעיה מחדש שלהם ב -125 מיקרוליטר RPMI 10 חם וצנטריפוגה כמו קודם. לאחר סילוק הכביסה האחרונה, הוסיפו 100 מיקרוליטר RPMI 10 חם לכל באר. מערבבים למעלה ולמטה עם הפיפט ודוגרים על הצלחת למשך 48 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% פחמן דו חמצני.

יומיים לאחר מכן, הוציאו את הצלחת מהחממה והעבירו לארון בטיחות ביולוגית. בעזרת פיפט רב ערוצי, מערבבים את תכולת כל באר ומעבירים לצלחת תחתונה U של 96 באר. שטפו כל באר של צלחת 96 באר V תחתונה עם 100 מיקרוליטר של 1% פרפורמלדהיד ו- PBS והעבירו את התאים הנותרים ו- PBS לבארות המתאימות בצלחת 96 בארות U.

מערבבים היטב בעזרת פיפט רב ערוצי. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ונותנים לה לשבת בחממה למשך 30 דקות כדי לתקן את התאים. הכן את ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת תאי K562 לא מוכתמים כדי לכייל את הגדרות הפיזור הצדדי והקדימה באמצעות תעלת אתיל-אחד לפריחת GFP.

לאחר מכן רכשו 30 אלף עד 50 אלף תאים מכל דגימה. באמצעות תוכנת ניתוח זרימה ציטומטרית, הגדר את השער הראשון על סמך אזור הפיזור הקדמי לעומת גובה הפיזור קדימה כדי לכלול תאים בודדים ולהוציא דובלטים אוטו-פלואורסצנטיים מהניתוח. חשב את האחוז הממוצע של תאים חיוביים ל-GFP עבור כל מצב ולאחר מכן חשב את שיפור הקיפול של הזיהום עבור כל דילול בסרום.

שיפור קיפול גרף על ציר ה-y לעומת דילול על ציר ה-x וביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA ואחריו מבחן הפוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות. נתונים מבעל חיים מייצג המשתמש בחלקיקי נגיף דנגי מדווח אחד מוצגים כאן. אחוז התאים החיוביים ל-GFP עבור דגימת הביקורת ללא סרום היה 0.253%דגימת הסרום הלא מדוללת הייתה 2.58% GFP חיובית.

שיעור התאים החיוביים ל-GFP הגיע לשיא של 12.8% בדילול של 1 עד 10 בסרום לאחר 0.735% בדילול של 1 עד 100 ו-0.022% בדילול של 1 עד 1,000. שיפור תלוי נוגדנים של זיהום דנגי נבדק עבור ארבעת סוגי הסרום של נגיף הדנגי. הנתונים מראים כי הסרום שנאסף 16 שבועות לאחר ההדבקה שיפר משמעותית את הזיהום של תאי K562 על ידי כל סוגי הסרום של נגיף הדנגי בדילול של אחד עד עשרה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לרכוש את הנתונים תוך שעה עד שעתיים לאחר השלמת שלב הקיבוע הסופי של 30 דקות. אל תשכח שעבודה עם סרום נגוע עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון PPE ו-BSL2 Level בעת ביצוע הליך זה.