Name: Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למדו פרוטוקול סיטומטריית זרימה פשוט לבדיקת שיפור תלוי נוגדנים של זיהום נגיף דנגה באמצעות נסיוב הבראה מנגיף זיקה. השיטה מאפשרת הערכת יכולת הנסיוב לתווך ADE בתאי K562.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט המתוארת נתמכה על ידי כספים באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות כדי JJM. דעתם או את הנחרצות הכלול הם אלה פרטי של המחברים ואינם להיות לפרש הרשמי או המשקף את הנופים של משרד ההגנה, באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות או בכל חברה אחרת של ארצות הברית הממשלה.
WGV ביצע את כל הניסויים וניתח את הנתונים; JJM עוצב והשגחת המחקר; WGW JJM כתבו בעיתון.

הדוגמאות סרום בשימוש כדי להדגים את הפרוטוקול המתואר כאן, התקבלו קופי מקוק רזוס שהיו שוכנו, בהתאם במדינת מקומיים, ושלמישהו אכפת הפדרלית מדיניות שיוך עבור הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה הבינלאומי (AAALAC)-מוכר מתקן. כל ניסויים בבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על-ידי אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש, דגימות נרכשו דרך רקמה שיתוף פרוטוקול.
1. יום 1
הערה: בצע את כל השלבים המתוארים להלן ב- cabinet אבטחה בעל דירוג זרימה שכבתית סטרילי המשמש תרביות רקמה במעבדה BSL-2.
<ol><li>להפשיר את הדוגמאות סרום בטמפרטורת החדר, להעביר µL 100 לכל דגימת נסיוב צינור סטרילי. חום הפוך ללא פעיל למשך 30 דקות ב 56° C באמבט מים או של thermomixer טמפרטורה מתכוונן. להפוך 10-fold דילולים טורי של דגימת נסיוב ועד 1:1 1:1,000 באמצעות RPMI קר-10 (RPMI עם 10% סרום שור עוברית).</li>
	<li>העברת µL 10 דגימת נסיוב באופן סדרתי מדולל כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן סטרילי. כוללים שתי קבוצות של שליטה וולס, RPMI-10 עם RVPs בלבד, ללא דגימת נסיוב, ו RPMI-10 רק בלי RVPs ובלי דגימת נסיוב. להגדיר כל דגימת נסיוב ופקדים RPMI-10 ב- triplicates.</li>
	<li>להסיר את קדחת דנגה-1, 2, 3 ו 4 RVPs מן המקפיא-80 ° C ו להפשיר אותם בתוך אמבט מים 37 º C. להעביר את RVPs המופשרים מיד לקרח. להשיג כ 170 µL RVPs עבור כל דגימה סרום (10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל בסרום (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) 10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל אחד ה-RPMI-10 עם RVP רק לשלוט וולס).</li>
	<li>פיפטה 10 µL של RVPs לתוך כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן המכיל את דגימת נסיוב, כדי RPMI-10 עם RVPs (ללא סרום) שליטה וולס. אל תוסיף בארות RVPs RPMI-10 בלבד (אין דגימת נסיוב, אין RVP). לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להוסיף 10 µL קר RPMI-10 במקום RVPs על כל RPMI-10 קר בלבד (אין דגימת נסיוב RVP אין) ובקרת בארות.</li>
	<li>להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של שעה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2. בעוד צלחת V-התחתון 96-ובכן הוא המקננת, לנקות את השטח של אבטחה הקבינט עם-70% אתנול ולהפעיל את אולטרא סגול למשך 15 דקות.</li>
	<li>הסר בקבוקון T75 באופן מלא confluent של תאים K562 החממה, לערבב את התאים היטב באמצעות pipet מ ל סטרילי ולאחר להעביר 5 מ של תאים צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל. הערה: התאים K562 הם שמרו ב- RPMI-10, subcultured-עונה 1 פרק 106/mL.</li>
	<li>לספור את מספר תאים על-ידי הסרת תאים µL 10 מהצינור חרוט סטרילי 15 מ"ל ומערבבים עם 10 כחול tryphan µL. לספור את התאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים בצינור חרוט 15 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge 15 mL חרוט עם תאים ב ~ 1,200 x g למשך 10 דקות, decant את תגובת שיקוע, resuspend תאי RPMI חמים-10-ריכוז של 80,000 µL תאים/30 של מדיה (2.66 x 106 תאים /mL).</li>
	<li>הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן של החממה (שלב 1.6), להעביר 30 µL של תאים K562 כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן, לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של 1שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2.</li>
	<li>לאחר המקננת עבור 1 h, הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן מן החממה צנטריפוגה ב ~ 1,200 x g למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, decant המדיה מן הבארות מאת מתהפך לגמרי את הצלחת לתוך מיכל המכיל 10% מלבין.</li>
	<li>לשטוף את התאים היטב כל מאת resuspending אותם ב- 125 µL של RPMI חמים-10, לערבב היטב עם פיפטה ולאחר centrifuge את הצלחת ב g ~ 1,200 x עבור 5 דק Decant התקשורת על-ידי הפעלת את הצלחת במהופך לתוך מיכל המכיל 10% מלבין. חזור על שלב זה לשטוף פעמיים.</li>
	<li>לאחר הרחצה, להוסיף 100 µL חמים RPMI-10 לכל אחת, לערבב למעלה ולמטה עם pipet, דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2.</li>
</ol>2. יום 3
<ol><li>הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן המכיל 100 µL של תאים, מדיה/טוב מן החממה והעברתו אבטחה בארון. שימוש של פיפטה רב-ערוצי, לערבב התוכן של כל אחד טוב ולהעביר את התאים ואת מדיה 96 טוב U-תחתון צלחת או כדי הנקרא מראש 5 מ ל צינורות פוליפרופילן.</li>
	<li>לשטוף כל טוב ב 96-ובכן V-תחתית לצלחת עם µL 100% 1 Paraformaldehyde (PFA) ב- 1-פוספט Buffered מלוחים (PBS) והעברת הבארות בהתאמה גם צלחת U-התחתון או צינורות פוליפרופילן שכותרתו מ ל 96 מ שלב 2.1 להניב סופית ריכוז של 0.5% מחברים/טוב או ברכבת התחתית. לערבב ביסודיות באמצעות פיפטה רב-ערוצי עם כיסוי לצלחת עם נייר אלומיניום, תן לזה לנוח בחממה במשך 30 דקות לתקן את התאים.</li>
	<li>להכין את cytometer זרימה (ראה טבלה של חומרים לדוגמה) על-ידי הפעלת מוכתם K562 תאים כדי לכייל את הצד ופיזור קדימה יחד עם ההגדרות זריחה. הערוץ היחיד פלורסצנטיות הנדרש הוא FL1, כמו GFP היחידה ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט מהתאים. לרכוש ~ 30, 000 – 50,000 תאים מחלון כל דגימה. הערה: כל cytometer זרימה היכול לקרוא פלורסצנטיות יחיד יכול לשמש עבור רכישת הנתונים, כפי תאים נגועים RVPs רק פולט קרינה פלואורסצנטית ירוק בשל נוכחותם של ה-GFP, אין ערוץ פלורסצנטיות אחרים נדרשים.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>
ניתוח נתונים רכשה ב- cytometer זרימה באמצעות תוכנות ניתוח cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים).
	<ol>
<li>ערכת בשער הראשון מבוססת על FSC-A (קדמי פיזור – אזור) לעומת FSC-H (פיזור קדימה – גובה) כדי לכלול תאים בודדים או להשמיט אוטומטית-פלורסנט doublets ניתוח12. לאחר מכן, שער תאים ממותגת גופיה בהתבסס על האס-A (לצד פיזור – אזור) לעומת FSC-A כדי לא לכלול כל פסולת autofluorescent.</li>
		<li>לנתח האס-A לעומת תאים מגודרת FSC-A עבור הביטוי של GFP בהתבסס על האס-A vs GFP-א לקבוע את אחוז ה-GFP + תאים עבור כל דילול של הדוגמאות סרום ושליטה על-ידי הגדרת שער סביב GFP + התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את האחוז הממוצע של GFP + תאים עבור כל דגימה בסרום שליטה בארות על-ידי חלוקת האחוז הכולל של GFP + בתאים הבארות triplicate ע י 3.</li>
	<li>לחשב קיפול-שיפור של זיהום על ידי חלוקת האחוז הממוצע של GFP + בתאים הדוגמאות סרום עבור כל דילול חלקי האחוז הממוצע של GFP + תאי ה-RPMI-10 עם RVPs (אין דוגמה סרום) שליטה וולס.</li>
	<li>גרף קיפול-שיפור (ציר y) נגד דילול (ציר x), ולבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Flaviviruses כגון DENV ו- ZIKV לשתף עדויות משמעותיות של הומולוגיה בחלבונים שני שלהם מבניים שאינן מבניות המייצרים נוגדנים cross-react אחד עם השני13,14. תגובות cross-reactive נוגדנים אלה הוכחו לשפר לזיהום הן ויוו והן במבחנה עם heterologous serotype או אחרים הקשורים flaviviruses1,2. הפוטנציאל לשיפור צלב זיהום יש השלכות משמעותיות עבור ניהול של המחלה וכן לפיתוח חיסון.
<p class="jove_conte...

נוגדן התלויים שיפור (איד) של זיהום הוא תהליך לפיה תגובות נוגדנים cross-reactive חלקית המושרה על ידי serotype של וירוס משפר ספיגת של serotype נוספת של וירוס, המוביל שכפול ויראלי מוגברת viremia. אייד תועד בהרחבה דנגה זיהומים וירוס (DENV) שבו ארבע הגדולות אשר נגרמו מהזנים אליהם גם הם נפוצים. בקבוצת משנה של חולים, אייד משויכת קדחת דנגה מדמם (DHF). לאחרונה הראינו כי זיהום בנגיף (ZIKV) Zika המושרה רמות גבוהות באופן משמעותי של תגובות נוגדנים cross-reactive DENV גרם אייד של DENV חוץ גופית בתוך , סביר להניח תרמו שיפור DENV viremia in vivo1 , 2. מבחני שיפור התלויים נוגדנים הם כלי חשוב כדי להעריך את הקיבולת של נוגדנים כדי לשפר את זיהום משני עם וירוסים הקשורים ואת לספק תובנות לתוך בפתוגנזה של זיהומים flavivirus ליידע פיתוח חיסונים.
וזמינותו המתוארים כאן משתמש DENV RVPs יחד עם תאים K562, כי הם בדרך כלל שבידנו לזיהום. RVPs הם שכפול מבנית כשירים DENV חלקיקים נגיפיים אשר קידוד של replicon תת-גנומית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הבאה לידי ביטוי לאחר סבב אחד של שכפול3. ככזה, תאים נדבקים בנגיף RVPs לזרוח ירוק, ניתן בקלות להבחין באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ. RVPs בשימוש assay זו התקבלו ממקורות מסחריים. הם יכולים, לעומת זאת, להיות שנוצר נגד וירוסים אחרים, המשמשים וזמינותו המתואר בכתב היד. בינתיים, תאים K562 הם FcγIII-קולטן-הבעת ' לוקמיה תא קו לאגד האזור Fc של נוגדנים, להידבק בנוכחות תת נטרול ריכוזים של נוגדן4,5.
מבחני אייד שימשו בהרחבה מחקרים חוקרת את גורמי הסיכון עבור דנגה חמור וכדי ניסחו את המנגנונים של במבחנה אייד6,7,8. וזמינותו אייד המתוארים כאן יכול בקלות ובמהירות לשמש כדי לקבוע את הקיבולת של נסיוב flow cytometry, לעומת שאר מבחני בשימוש כיום, אשר דורשים גם הקביעה של פלאק ויוצרים ולשפר במבחנה זיהום באמצעות RVPs יחידות (pfu) ורו תאים או נוגדן כתמים נגוע תאים6,7,8,9,10,11, שניהם נמצאים זמן רב ודיני אינטנסיבית.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>אינטגרלי מולקולרי</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 תאים</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS ב-RPMI-10</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL ב-RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M</td></tr><tr><td>בתמיסת חומצות אמינו לא חיוניות RPMI-10 MEM (100 ופעמים;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x ב-RPMI-10</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM ב-RPMI-10</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>פישר MT25005CI</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תחתונות V סטריליות</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD פלקון פוליפרופילן 5 מ"ל צינורות FACS</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תחתונות U לא סטריליות</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>אלטרנטיבה בתפוקה גבוהה לצינורות FACS</td></tr><tr><td>5 מ"ל, פיפטה סטרילית, סרולוגית</td><td>דנוויל</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL קצות</td> <td>פיפטה סטרילייםדנוויל</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL קצות פיפטה סטריליות</td><td>דנוויל</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL פיפטה רב ערוצית</td><td>דנוויל</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL פיפטה רב ערוצית</td><td>דנוויל</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% פורמדהיד</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>אלטרנטיבה לאמבטיית מים להפעלת חום</td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה נוזלית</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II ציטומטר זרימה</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה נוזלית</td><td>פישר NC9724348</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> מדעי

cytometry זרימה פשוטים מבוסס assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה zika וירוס

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

שיפור התלויים נוגדנים לזיהום הוכח לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה נגיפי קדחת דנגה. מבחני מסורתי המודדים את הקיבולת של נוגדנים או סרום כדי לשפר הידבקות שורות תאים שבידנו צריכים לסמוך על באמצעות פלט ויראלי בתקשורת ואחריו פלאק מבחני לכמת זיהום. לאחרונה, מבחני אלו בחנו דנגה זיהום בנגיף (DENV) בשורות תאים באמצעות נוגדנים fluorescently עם תוויות. שתי גישות אלה יש מגבלות שמגבילות את השימוש הנרחב של טכניקות אלה. כאן, אנו מתארים assay פשוט במבחנה באמצעות דנגה כתב ויראלי חלקיקי וירוס (RVPs) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק ותאים K562 לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהום DENV השימוש סרום זה היה המתקבלים רזוס קופי מקוק 16 שבועות לאחר ההדבקה בנגיף Zika (ZIKV). טכניקה זו הוא אמין, כרוך מניפולציה מינימלי של תאים, אינו כרוך השימוש של וירוס המוסמכת שכפול בשידור חי, יכול להתבצע בתבנית תפוקה גבוהה כדי לקבל בדיקה כמותית באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, וזמינותו זו ניתן להתאים בקלות לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהומים נוספים flavivirus כגון נגיף קדחת צהובה (YFV), וירוס. קדחת מוח הסוסים יפני (JEEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) שבו זמינות RVPs וכו. הקלות של הגדרת וזמינותו, ניתוח הנתונים, ופרשנות תוצאות הופך לבצע רוב ההגדרות מעבדה.

שרה מ 4 רזוס קופי מקוק היו שנאספו 16 שבועות לאחר ההדבקה עם ZIKV ונבדק את הפוטנציאל שלהם לשפר את DENV-1, 2, 3 ו 4 זיהום בתאים K562. החיות היו נגיפי ~ 1 x 105 עותקים של RNA ZIKV/mL של פלסמה ביום 3 לאחר זיהום ירדו לרמות שהיו מתחת לגבול של זיהוי על ידי 7 ימים לאחר ההדבקה. Viremia לא זוהה הפלזמה-16 שבועות לאחר הפגיעה. לאחר מכן, וזמינותו RVP בוצעה, נותחו הנתונים שנאספו, כמפורט בפרוטוקול לעיל.
האסטרטגיה המגביל המשמש לזיהוי G...

אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקל למדידת שיפור התלויים נוגדנים לזיהום על ידי Zika וירוס הבראה בנסיוב באמצעות וירוס דנגה כתב נגיפים.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את יכולת הסרום שנאסף מקופי מקוק רזוס נגועים בנגיף הזיקה לתווך שיפור תלוי נוגדנים של זיהום בנגיף דנגי במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לשיפור תלוי נוגדנים של זיהום דנגי הנגרם על ידי נוגדנים צולבים המושרים על ידי נגיף זיקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא טרופר גבוה, פשוטה וקלה לביצוע.מי שידגים את ההליך הזה יהיה וויליאם ואליאנט, סטודנט לתואר שני במחלות זיהומיות, במעבדה שלי. התחל בהפשרת דגימות הסרום בטמפרטורת החדר. לאחר ההפשרה, העבירו 100 מיקרוליטר מכל דגימת סרום לצינור סטרילי וחממו והפעילו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, בצע דילולים סדרתיים פי 10 של דגימת הסרום הנעים בין אחד לאחד, לאחד לאלף ב-RPMI 10 קר. לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר מכל דגימת סרום מדוללת לבארות של צלחת סטרילית של 96 בארות V-bottom. לאחר מכן, יש להפשיר חלקיקים נגיפיים של דנגי 1, 2, 3 ו-4 פרופורטר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, מה שמבטיח נפח של כ-170 מיקרוליטר מכל RVP לדגימת סרום.לאחר ההפשרה, העבירו מיד את צינורות ה-RVP לקרח. לאחר מכן הזרימו 10 מיקרוליטר של RVPs לבארות המכילות דילול דגימות סרום לבארות ללא בקרת סרום. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד עשר פעמים.העבירו את הצלחת התחתונה של 96 בארות V לחממה ודגרו למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס, בנוכחות 5% פחמן דו חמצני. בזמן שהצלחת התחתונה של 96 בארות V דוגרת, נקה את פני ארון הבטיחות הביולוגית עם 70% אתנול, והפעל את אור ה-UV למשך 15 דקות. לאחר מכן הסר בקבוק T-75 מלא של תאי K562 מהחממה.מערבבים היטב את התאים בעזרת פיפט סטרילי של חמישה מילימטר ומעבירים חמישה מיליליטר לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הסר 10 מיקרוליטר תאים מהצינור, ערבב עם 10 מיקרוליטר טריפן כחול והעמיס להמוציטומטר. ספור את התאים וחשב את מספר התאים הכולל.לאחר צנטריפוגה של התאים ב-12 מאות פעמים G למשך 10 דקות, יש לשפוך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את התאים ב-RPMI 10 חם בריכוז של 80 אלף תאים לכל 30 מיקרוליטר מדיה. לאחר הוצאת הצלחת התחתונה של 96 בארות V מהחממה, העבירו 30 מיקרוליטר של תאי K562 לכל קיר של צלחת 96 בארות V-bottom. ומערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד עשר פעמים.ואז החזירו את הצלחת לחממה למשך שעה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצלחת ב -12 מאות פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, יש לשפוך את המדיה מהבארות על ידי הפיכת הצלחת למיכל המכיל 10% אקונומיקה.לאחר מכן שטפו את התאים בכל קיר על ידי השעיה מחדש שלהם ב -125 מיקרוליטר RPMI 10 חם וצנטריפוגה כמו קודם. לאחר סילוק הכביסה האחרונה, הוסיפו 100 מיקרוליטר RPMI 10 חם לכל באר. מערבבים למעלה ולמטה עם הפיפט ודוגרים על הצלחת למשך 48 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% פחמן דו חמצני.יומיים לאחר מכן, הוציאו את הצלחת מהחממה והעבירו לארון בטיחות ביולוגית. בעזרת פיפט רב ערוצי, מערבבים את תכולת כל באר ומעבירים לצלחת תחתונה U של 96 באר. שטפו כל באר של צלחת 96 באר V תחתונה עם 100 מיקרוליטר של 1% פרפורמלדהיד ו- PBS והעבירו את התאים הנותרים ו- PBS לבארות המתאימות בצלחת 96 בארות U.מערבבים היטב בעזרת פיפט רב ערוצי. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ונותנים לה לשבת בחממה למשך 30 דקות כדי לתקן את התאים. הכן את ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת תאי K562 לא מוכתמים כדי לכייל את הגדרות הפיזור הצדדי והקדימה באמצעות תעלת אתיל-אחד לפריחת GFP.לאחר מכן רכשו 30 אלף עד 50 אלף תאים מכל דגימה. באמצעות תוכנת ניתוח זרימה ציטומטרית, הגדר את השער הראשון על סמך אזור הפיזור הקדמי לעומת גובה הפיזור קדימה כדי לכלול תאים בודדים ולהוציא דובלטים אוטו-פלואורסצנטיים מהניתוח. חשב את האחוז הממוצע של תאים חיוביים ל-GFP עבור כל מצב ולאחר מכן חשב את שיפור הקיפול של הזיהום עבור כל דילול בסרום.שיפור קיפול גרף על ציר ה-y לעומת דילול על ציר ה-x וביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA ואחריו מבחן הפוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות. נתונים מבעל חיים מייצג המשתמש בחלקיקי נגיף דנגי מדווח אחד מוצגים כאן. אחוז התאים החיוביים ל-GFP עבור דגימת הביקורת ללא סרום היה 0.253%דגימת הסרום הלא מדוללת הייתה 2.58% GFP חיובית.שיעור התאים החיוביים ל-GFP הגיע לשיא של 12.8% בדילול של 1 עד 10 בסרום לאחר 0.735% בדילול של 1 עד 100 ו-0.022% בדילול של 1 עד 1,000. שיפור תלוי נוגדנים של זיהום דנגי נבדק עבור ארבעת סוגי הסרום של נגיף הדנגי. הנתונים מראים כי הסרום שנאסף 16 שבועות לאחר ההדבקה שיפר משמעותית את הזיהום של תאי K562 על ידי כל סוגי הסרום של נגיף הדנגי בדילול של אחד עד עשרה.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לרכוש את הנתונים תוך שעה עד שעתיים לאחר השלמת שלב הקיבוע הסופי של 30 דקות. אל תשכח שעבודה עם סרום נגוע עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון PPE ו-BSL2 Level בעת ביצוע הליך זה.

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת שיפור תלוי נוגדנים (ADE) של זיהום בנגיף דנגי באמצעות סרום החלמה של נגיף זיקה. הבדיקה משתמשת בחלקיקים נגיפיים של כתב דנגי (RVPs) המקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק. נוגדנים בסרום נגד נגיף הזיקה מגיבים בהצלבה עם RVPs ליצירת קומפלקס. הנוגדנים הקשורים מגבירים את ספיגת RVP על ידי תאים המבטאים את קולטן Fc, אשר מזוהה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בדיקה חוץ גופית לבחינת שיפור תלוי נוגדנים של זיהום ויראלי

הסרטון מדגים בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים בעלי פעילות אנטי-ויראלית נגד נגיף הזיקה, פתוגן אנושי. בתוך התא המארח, נגיף הזיקה עובר הכפלה עם הפנמתו, מדביק תאים שכנים ויוצר אזורים מובחנים או רבדים נגיפיים. אינטרפרון מסוג I, הפועל כסוכן אנטי-ויראלי, מעכב את הכפלת הנגיף, ובכך מונע היווצרות של פלאקים נגיפיים בתא המארח monolayer.

בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים כמעכבים חזקים של צמיחת נגיף זיקה

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

פרוטוקול להעריך תגובות תא T אנטיגן ספציפי באיברים immunoprivileged של Ifnar1- / - מאתר מודל עבור זיהום בנגיף (ZIKV) Zika מתואר. בשיטה זו הוא מרכזי בשביל לחקור את המנגנונים התאיים של ההגנה, השיגה חיסונים ZIKV, והוא גם יקר להערכת היעילות שלהם.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

אנו מתארים שיטה להעריך את ההשפעה של הקיימת מראש חסינות מפני וירוס דנגה על זיהום בנגיף Zika באמצעות בנסיוב אדם ראשי תאים אנושיים, כימות זיהום על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התפשטות נגיף הזיקה (ZIKV) בתאי כליות של קוף ירוק אפריקאי ורו ואת הכימות של ZIKV באמצעות שיטות זיהוי חיסוני קולורימטרי מבוססות תאים בפורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה).

התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

כאן, אנו מדגימים את השימוש בעכבה חשמלית מבוססת תאים (CEI) כשיטה קלה ופשוטה מאוד לחקר זיהום ושכפול נגיף זיקה בתאים אנושיים בזמן אמת. יתר על כן, בדיקת CEI שימושית להערכת תרכובות אנטי-ויראליות.

פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

למדו פרוטוקול סיטומטריית זרימה פשוט לבדיקת שיפור תלוי נוגדנים של זיהום נגיף דנגה באמצעות נסיוב הבראה מנגיף זיקה. השיטה מאפשרת הערכת יכולת הנסיוב לתווך ADE בתאי K562.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

גלה סרטונים נוספים