Name: מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: למד מדידת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי בחזה מחורר של Drosophila באמצעות רזפירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו דורשת כמויות מינימליות של רקמה ומספקת תוצאות פיזיולוגיות רלוונטיות יותר לחקר מטבוליזם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענקים הלאומית למדעים ואת המועצה למחקר הנדסי (NSERC, גילוי גרנט), אוניברסיטת דה מונקטון NP. LHB הייתי רוצה להכיר את התמיכה המימון של המכון הקנדי של הבריאות מחקר (CIHR), קרן חדשנות ניו ברנזוויק (NBIF) ושל אוניברסיטת דה מונקטון. העבודה של EHC נתמך על ידי אגודת האלצהיימר של קנדה, קנדה המוח, NSERC, קרן סרטן השד קנדי, ניו ברנזוויק חדשנות קרן, קרן למחקר בריאות ניו ברנזוויק ו אוניברסיטת דה Moncton.

1. נוגדנים הכנה
<ol><li>להכין את הפתרונות הבאים לנתיחה, permeabilization של הרקמה.<ol>
<li>להכין תמיסת השימור: 2.77 מ"מ CaK2EGTA, 7.23 מ מ K2EGTA, 5.77 מ מ נה2ATP, מ מ 6.56 MgCl2, טאורין, 20 מ מ 15 מ מ נה2phosphocreatine, imidazole 20 מ מ, dithiothreitol 0.5 מ מ, ו 50 מ מ K-MES, pH 7.1 (ניתן לאחסן ב-20 ° C).</li>
		<li>להכין סאפונין פתרון: 5 מ"ג של סאפונין ב 1 מ"ל של תמיסת השימור (להכין טרי מדי יום).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו את הפתרונות הבאים לשקילת הנשימה.<ol>
<li>להכין נשימה בינוני: 120 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ ח'2PO4, 3 מ מ HEPES, 1 מ"מ EGTA, 1 מ MgCl2ו- 0.2% BSA (w/v), pH 7.2.</li>
		<li>הכינו מצעים, uncoupler, מעכבי. להמיס הכל מצעים H2O, לפזר את uncoupler FCCP, כמו גם את מעכבי אתנול מוחלטת (למעט malonate אשר הוא מדולל H2O). לנטרל את רוב סובסטרטים כמו גם malonate (ראה טבלה של חומרים). ריכוז כל נתון בפרוטוקול ריכוזים הסופי בתוך 2 מ"ל צ'יימברס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה וכיול של Respirometer ברזולוציה גבוהה.
<ol><li>לשטוף את צ'יימברס, בקבוקים, פקקים של respirometer שלוש פעמים עם 70% אתנול, שלוש פעמים עם מים מזוקקים.</li>
	<li>כיול על ריכוז חמצן אפס: pipet 2.3 מ של נשימה במדיום התאים ולהוסיף 10 מ"ג נתרן dithionite. אמנם נפח החדר 2 מ"ל, 2.3 mL נוספים כדי להבטיח כי אין בועת האוויר נשאר תחת הפקק בסגירת התאים. סגור התאים עם פקקים, מודדים ריכוז החמצן במשך 10-20 דקות כיול האלקטרודות ב אפס ריכוז חמצן עם קצב צריכת החמצן שנוצר.</li>
	<li>לשטוף את הצ'יימברס במים distillated, דגירה באתנול מוחלט למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים.</li>
	<li>כיול-אוויר רוויה: pipet 2.3 מ של נשימה בינוני בלשכה, להוסיף על פקקים, תשאף המדיום עודף על פקקים ולאחר מכן הרם את פקקים עם מרווח. עודף נשימה בינוני pipetted בלשכה (נפח של סה כ 2 מ"ל) כדי למנוע הנוכחות של בועות אוויר לאחר סגירת התאים.</li>
	<li>לפקח על צריכת חמצן למשך 45 דקות עד שעה, עד ריכוז חמצן (כחול trace) תהיה יציבה סביב 250 nM ב 24 ° C.</li>
</ol>3. ניתוח של זבובים, Permeabilization של רקמות
<ol><li>ודא כי כל הצעדים מבוצעים על קרח.</li>
	<li>להרדים שישה זבובים זכרים של המתח זהה, אותו גיל וגדל על דיאטה זהה על קרח כדי להקל על ניתוח של הזבובים (פראי-סוג w1118, בן, 15 ימים ניזונו קמח תירס בינוני).</li>
	<li>באמצעות אזמל ומלקחיים שקצהו פיין, לנתח את הזבובים (להסיר את הראש ואת הבטן) כדי לשמור רק את thoraxes המכיל את השרירים טיסה. שלב זה יכול להעשות בעין בלתי מזוינת. להתמודד עם thoraxes שנוצר עם מלקחיים שקצהו פיין.</li>
	<li>העברת שלושה גזור thoraxes ב- 25 מ מ פטרי המכילות 2 מ ל תמיסת השימור קפואים עם המלקחיים.</li>
	<li>עם המלקחיים שקצהו פיין, מכנית permeabilize את thoraxes על-ידי הוספת הקצה של המלקחיים thoraxes, שוב ושוב לקרוע לגזרים את הרקמה כדי להשיג באופן רופף מחובר לרשת.</li>
	<li>צלחת 24-ובכן, למלא שתי בארות עם 12.5 µL של הפתרון סאפונין ו 1 מ"ל של תמיסת השימור בריכוז הסופי של µg/mL 62.5 של סאפונין. ממלאים שתי הבארות הסמוכים 1 מ"ל של נשימה בינוני.</li>
	<li>עם המלקחיים שקצהו פיין, להעביר שלוש thoraxes permeabilized לתוך הפתרון מדולל סאפונין, דגירה עם עצבנות קלה על שייקר-מסלולית, על קרח, כעשרים דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה האחרון, להעביר את הסיבים הבארות הסמוכים מלאים המדיום נשימה עם עצבנות קלה, על קרח, עבור 5 דקות כדי לשטוף סאפונין.</li>
</ol>4. קביעת משקל יבש
<ol><li>יבש את thoraxes permeabilized על משטח סופג והיפוך 3 - 4 פעמים עם המלקחיים שקצהו הקנס כדי לוודא שלחות כל מוסר.</li>
	<li>לשקול את thoraxes שלושה ביחד על microbalance. הערה על המשקל שהושג כמו זה ישמש לנרמל את שיעור צריכת החמצן מיטוכונדריאלי.</li>
	<li>העברת רקמות באופן מיידי בכל טיפת נשימה בינוני על קרח.</li>
</ol>5. קביעת המחירים צריכת חמצן
<ol><li>פתח לאהלי respirometer (להסיר את פקקים) ולהוסיף 10 מ מ של פירובט, 2 מ מ של בנויים לתוך כל תא.</li>
	<li>הוסף את רקמות permeabilized ישירות לתוך התאים מלאים המדיום נשימה.</li>
	<li>החלף את פקקים באמצעות את מרווח.</li>
	<li>עם מזרק 60 מ ל, לאסוף חמצן ישירות מתוך מיכל חמצן, להזריק 2-5 מ של חמצן דרך נימי בסימפטומים של כל חדר כדי לוודא דיפוזיה חמצן דרך הרקמות לא יגביל צריכת החמצן.</li>
	<li>מכניס מזרק המילטון נימי של כל פקק כדי לוודא ש-thoraxes יישארו בבית הבליעה.</li>
	<li>לסגור את התאים לחלוטין. כאשר ריכוז החמצן הוא בסביבות 400 nM, להשגת רמות החמצן מעל אוויר רוויה (בסביבות 160% אוויר רוויה) בתוך התאים.</li>
	<li>הפסק והפעל מחדש את חימום/קירור כדי לבדוק אם בועות אוויר בתוך התאים.</li>
	<li>הזן את המסה של רקמות שקל בעבר לנרמל את המחירים הנשימה על ידי מסה של רקמה (מ ג), הצגת צריכת החמצן ספציפיים מסה (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 של רקמות).</li>
	<li>לאחר צריכת חמצן מיוצב (trace אדום), להוסיף 5 מ מ ADP עם מזרק המילטון.</li>
	<li>אחרי כל זריקה, לשטוף את המזרקים עם מים מזוקקים, 70% אתנול, ו מים מזוקקים שוב.</li>
	<li>לאחר צריכת חמצן הוא יציב שוב, להזריק µL 5 מ 4 של ציטוכרום c.</li>
	<li>להמשיך הזריקות רציפים של סובסטרטים הבאים כדי להעריך את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי-שלבים שונים החוצנים:<ol>
<li>להוסיף 5 µL של פרולין 2 מ'.</li>
		<li>להוסיף 10 µL של succinate 1 מ'.</li>
		<li>להוסיף 30 µL של גליצרול 1 מ'-3-פוספט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להזריק את uncoupler FCCP באופן טיטור לפי השלבים של 0.5-1 מיקרומטר (2 µL של פתרון 1 מ"מ) עד ריכוז אופטימלי הוא להגיע, קרי, ריכוז כדי להשיג את צריכת החמצן הגבוה אפשרי ללא עכבות (זהירות: לראות טבלה החומרים).</li>
	<li>להזריק את מעכבי הבאים ברצף כדי לעכב לחלוטין שטף האלקטרונים ב החוצנים כדי למדוד את צריכת החמצן שיורית (רוקס) דהיינו שאינו נשימתי תגובות כגון oxygenase תגובות בין היתר:<ol>
<li>להוסיף 1 µL של rotenone 1 מ מ (זהירות: ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>להוסיף 5 µL של malonate 2 מ' (זהירות: ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>להוסיף 1 µL של antimycin 5 מ מ A (זהירות: ראה טבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף ascorbate 0.2 מ מ ו- 0.5 מ מ TMPD ברצף לתוך התאים, החל ascorbate כדי למדוד את צריכת החמצן על ידי הרביעי מורכבים.</li>
	<li>הוסף 20 מ מ של אזיד הנתרן לעכב הרביעי מורכבים (זהירות: ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לאחר האות יציב, לפתוח התאים מרווח, מחדש חמצן התאים באמצעות הזרקת 2 מ של חמצן טהור ולסגור התאים כאשר הריכוז הוא סביב 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>למדוד את האות למשך 10-15 דקות ולחשב את הרקע כימי, קרי, צריכת חמצן בשל autoxidation TMPD.</li>
</ol>6. ניקוי של Respirometer
<ol><li>אחרי המדידות, יש לשטוף את החדרים עם מים מזוקקים פעם ולשטוף הצ'יימברס שלוש פעמים ב 70% אתנול.</li>
	<li>דגירה באתנול מוחלט למשך 10 דקות להשבית את מעכבי.</li>
	<li>לשטוף שלוש פעמים עם מים מזוקקים, למלא את החדרים עם 70% אתנול ולהחליף את פקקים, את כמוסות עד ניצול הבא.</li>
</ol>

<ol><li>Stephenson, R., Metcalfe, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+fly+through+its+history+and+current+use%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+the+Royal+College+of+Physicians+of+Edinburgh%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use.</a> The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1400110404/abstract">An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila.</a> Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).</li>
<li>Dobzhansky, T., Wright, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Natural+Populations.+V.+Relations+between+Mutation+Rate+and+Accumulation+of+Lethals+in+Populations+of+Drosophila+Pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura.</a> Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).</li>
<li>Zipursky, S. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Neuronal+Cell+Fate%3A+Lessons+from+the+R7+Neuron+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).</li>
<li>Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+therapeutic+potential+of+doxycycline+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease.</a> The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).</li>
<li>Blandini, F., Armentero, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22251459">Animal models of Parkinson's disease.</a> FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).</li>
<li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+Larvae+and+Obese+Flies-Emerging+Studies+of+Metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).</li>
<li>Morris, S. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).</li>
<li>Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+insights+of+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+mitochondrial+damage%3A+importance+in+non-SOD1+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120 (4), 483-495 (2005).</li>
<li>Szibor, M., Holtz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ageing.</a> Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+and+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis and healthy aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).</li>
<li>Muoio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inflexibility%3A+When+mitochondrial+indecision+leads+to+metabolic+gridlock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock.</a> Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).</li>
<li>Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensing+mechanisms+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensing mechanisms and pathways.</a> Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).</li>
<li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).</li>
<li>McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BAlternative%26%2334%3B+fuels+contributing+to+mitochondrial+electron+transport%3A+Importance+of+non-classical+pathways+in+the+diversity+of+animal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">&#34;Alternative&#34; fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Physiology+in+the+Major+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti%3A+Substrate+Preferences+and+Sexual+Differences+Define+Respiratory+Capacity+and+Superoxide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120600(2015).</li>
<li>Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/phen.12127/abstract">Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor.</a> Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).</li>
<li>Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+as+a+fuel+for+insect+flight%3A+enhancing+carbohydrate+oxidation+in+hymenopterans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333(2016).</li>
<li>Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decline+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster.</a> The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topology+of+superoxide+production+by+complex+III+and+glycerol+3-phosphate+dehydrogenase+in+Drosophila+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).</li>
<li>Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympatric+Drosophila+simulans+flies+with+distinct+mtDNA+show+difference+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+superoxide+production+from+different+sites+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.+New+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+isolation%2C+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: isolation, structure and function.</a> The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li>
<li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+sensitivity+of+mitochondrial+functions+in+permeabilized+muscle+fibers+from+two+populations+of+Drosophila+simulans+with+divergent+mitotypes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).</li>
<li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial+dna+haplotypes+exhibit+metabolic+differences%3A+insight+into+functional+properties+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria.</a> Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).</li>
<li>Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+influences+the+intake+target+and+mitochondrial+functions+of+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males.</a> Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).</li>
<li>Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation%3A+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+proline%2C+a+stress+substrate%2C+modulates+carcinogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li>
<li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease%3A+To+carry+or+not+to+carry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li>
<li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, מתוארת שיטה עבור הכנת הדוגמא לפני המידות של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי דרוזופילה. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על בעיות שונות הקשורות הפרוטוקולים באמצעות ומשום מיטוכונדריאלי, בייחוד מבחינת משך מספר האנשים הדרושים. במקום לעבוד עם ומשום מיטוכונדריאלי בדרך כלל נדרש גם כמות גדולה של רקמות שהושג מאנשים שונים, ניסוי זה מתבצע על סיבי השריר permeabilized מן thoraxes של כמה דרוזופילה. ב פרוטוקול זה, רק שלושה אנשים נדרשים להציג תוצאות אופטימליות. לכן, מידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי בנקודות זמן שונות אפשרי גם ככה השגה כדי לסנכר...

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימש כאורגניזם מודל עבור מחקר גנטי עבור מעל המאה ה1. המחקר של האורגניזם הזה הוביל לא רק ידע משמעותי על ירושה שאיי2, קצב מוטציה3, הפיתוח של מערכת העצבים, את קביעת גורל התא4, אבל גם לאחרונה התפתחה כלי חשוב ללמוד את המנגנונים הטמון כמה מחלות כגון אלצהיימר ופרקינסון5,6. יתר על כן, זה מודל פופולרי ללמוד את תהליך ההזדקנות, כפי שהם יכולים לגדול במספר גדול על פני תקופה קצרה של זמן יש אורך חיים קצר. הם גם בעלי מבנים הומולוגיים לאיברים אנושי, כגון לב, oenocytes (כמו hepatocyte תאים), שומן הגוף (מתפקד באופן דומה רקמת שומן בכבד ולבן), לייצר תאים (שקול לתאי β בלבלב), אינסולין, כמו גם hemolymph הובלת מטבוליטים (מקביל להדם של בעלי חוליות)7. יתר על כן, משעולים המרכזי של מתווך חילוף החומרים (כולל את מסלול איתות כמו פקטורי גדילה דמויי אינסולין/אינסולין מסלולים היעד של Rapamycin-תור) הם גם מאוד שנשמרת7. מסיבות אלו, דרוזופילה לאחרונה נוצלה כדי לתאר את המנגנונים הבסיסיים השולטים חילוף החומרים, במיוחד בתנאים פתולוגיים הקשורות למחלות מטבוליות כגון סוכרת8. רכיב מרכזי של חילוף החומרים הוא מיטוכונדריון משלב מספר מסלולים ומבצע אחת מהפונקציות הביולוגי החשוב ביותר של החיים, ייצור ATP, באמצעות תהליך זרחון חמצוני (OXPHOS). בהתחשב שלהם תפקיד מרכזי בחילוף החומרים של האורגניזם, זה לא מפתיע כי תפקוד מיטוכונדריאלי מעורבים במחלות כמו פרקינסון9 ו מחלות אלצהיימר10, כמו גם נוירודגנרטיביות 11 , 12. הם גם המשפיעים של תהליך ההזדקנות. אכן, הם המפיקים הראשי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתא, אשר עלולה לפגוע בבריאותך לתא ריכוז גבוה דרך נזק חמצוני11. הזדקנות גם היה קשור להצטברות של ניזוק או מוטציה מיטוכונדריאלי דנ א13,14,mitophagy בתפקוד15 , כמו גם ליקוי להן מיטוכונדריאלי16. המיטוכונדריה הם גם גורמים מרכזיים של הומאוסטזיס של התא, כפי שהם יכולים לנצל סובסטרטים שונים כדי להתאים את מספר הסלולר פונקציות בהתאם שפע או מחסור של macronutrients17,18.
אכן, החומרים המזינים שונים בתזונה (פחמימות, שומנים וחלבונים) מתעכל, נספג, מועבר בתאים. . הם הופכים לאחר מכן ב ציטוזול ולאחר סובסטרטים נגזר מועברים לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי שבו הם מייצרים מקבילות תוך צמצום, כגון2NADH ו FADH19. הם אלה מקבילות תוך צמצום ואז תחמוצת על-ידי מתחמי אנזימטיות שונות של מערכת התחבורה אלקטרון (ETS). מכלולים אלה מוטבעות ממברנה פנימית מיטוכונדריאלי, כגון מתחם I ו- II מורכבים. בנוסף, מתחמי אנזימטי אחרים כגון דהידרוגנאז מיטוכונדריאלי של גליצרול-3-פוספט דהידרוגנאז פרולין מייצגים דרכים חלופיות עבור הערך של אלקטרונים לתוך ה ETS20,21. מתחמי "אלטרנטיבי" אלה חשובים במיוחד חרקים, כמו לפי המין, הם יכולים באופן פעיל להשתתף כדי להגדיל את הנשימה20,22,23,21. אלקטרונים אלה ETS האכלה מערכות מועברים את ubiquinone, לאחר מכן השלישי מורכב ולאחר מכן הרביעי מורכבים, עד מקבל הסופי, חמצן מולקולרי. העברת האלקטרון הזה יוצר פרוטון-מניע כוח על פני קרום מיטוכונדריאלי הפנימי שנוסעים זירחון של ADP ATP-V מורכבים (איור 1). בהתחשב התפקיד המרכזי של מיטוכונדריה הומאוסטזיס של התא, לומד מיטוכונדריאלי חילוף החומרים באמצעות מייצג melanogaster ד את הדגם הרלוונטי כלי רב עוצמה כדי ניסחו את המנגנונים שבבסיס שונים הקשורים pathophysiological תנאים או תחת לחצים הסלולר וסביבתיים. באופן מפתיע, רק קומץ מחקרים למעשה נמדד נשימה מיטוכונדריאלי דרוזופילה24,25,26. אכן, ניסויים במטרה להעריך את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי דורשים את ניתוקה של המיטוכונדריה. למרות יתרון עבור המידה של פונקציות מיטוכונדריאלי שונות (כגון ייצור ROS או יחס P/O כמו סמן של יעילות מיטוכונדריאלי27,28), ומשום אלה בדרך כלל דורשים כמויות די גדולות של רקמה מתוך24,יחידים מספר29. דרישה זו עבור כמויות גבוהות של רקמות ויחידים הוא גורם מגביל חשוב, במיוחד בהתחשב בעובדה כי כל אדם צריך להיות באותו הגיל, רצוי מאותו המין על הניסויים, שהופך את מידת הנשימה בזמן שונה נקודות מפרך במקרה הטוב. יתר על כן, בעוד ומשום מיטוכונדריאלי יכול לספק תובנה משמעותית המנגנונים הבסיסיים המסדירים את חילוף החומרים מיטוכונדריאלי, האמצעים שננקטו כדי לבודד המיטוכונדריה יש מספר חסרונות כגון הקושי להשיג תוצאות ניתן לשכפול , הפרעה של רשת מיטוכונדריאלי, ושינוי של מיטוכונדריאלי מבנה ותפקוד29,30,31.
מטרת מחקר זה היא להציג פרוטוקול חזקים כדי למדוד את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי דרוזופילה באמצעות רק כמות מזערית של רקמות מאנשים מעט מאוד. פרוטוקול זה מורכב מדידת חמצן מיטוכונדריאלי צריכת בחיי עיר באמצעות סיבי השריר permeabilized29 מ דרוזופילה thoraxes בשילוב עם רזולוציה גבוהה respirometry32,33, 34 , 35. בשיטה זו יש גם יתרונות נוספים בהשוואה לשיטת הבידוד מיטוכונדריאלי קלאסי מאז האינטראקציות עם רכיבים אחרים של התא כמו מבנה ותפקוד טוב כמו מיטוכונדריאלי יישמרו יותר ב- permeabilized סיבי29,31,36, מה שהופך את גישה זו רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית. עם פרוטוקול זה, פונקציות מיטוכונדריאלי ניתן בצורה מדויקת להעריך באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ברק שלוש thoraxes של זבוב החומץ, עם מצעים המאפשר קביעת צריכת חמצן-מספר שלבים שונים של החוצנים. לכן, פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח על המנגנונים הבסיסיים השולטים חילוף החומרים בהקשר של תנאים סביבתיים או pathophysiological רבים על-ידי ניצול של המודל דרוזופילה.
למדוד את צריכת החמצן מספר שלבים שונים של החוצנים ולהעריך כיצד סובסטרטים לתרום הנשימה, מצעים שונים (איור 1), uncoupler, מעכבי נמצאות בשימוש30 לאחר permeabilization של רקמות. באופן ספציפי, תוספות רציפים של סובסטרטים מבוצעות כדי לגרות את כניסתם של אלקטרונים בעלי מתחמים שונים של החוצנים. Uncoupler, קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), מצורף-ריכוז אופטימלי כדי למדוד את הנשימה הלא מצמידים, קרי, הנשימה phosphorylating מגורה צריכת חמצן מירבית. העכבות רציפים של מתחמי שאני II, III מבוצעות לאחר מכן כדי לפקח על צריכת חמצן שיורית הראוי תגובות חמצון הלא-ETS. לבסוף, ניתן להעריך יכולת הנשימה מקסימלי הרביעי מורכבים על ידי ההזרקה של N, N, N', נ, - Tetramethyl - p-phenylenediamine (TMPD), ספק אלקטרון מלאכותי, ואת ascorbate. חשוב לציין כי הניסויים נערכים ב 24 °C שכן הוא הטמפרטורה בה מגודלים הזבובים.

<table><tbody><tr><td>מד נשימה ברזולוציה גבוהה Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה</td><td>10022-02</td><td>ערכת מד נשימה O2K להפעלה &nbsp;</td></tr><tr><td>סט טיטרציה O2K&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה</td><td>20820-03</td><td>מזרקי המילטון בנפחים שונים &nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת Datlab</td><td>Oroboros Instruments, אינסברוק, אוסטריה</td><td>20700</td><td>תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים &nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים אנטי מגנטיים עדינים</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, גטינגן, גרמניה</td><td></td><td>יתרה חצי מיקרו (מופצת על ידי מספר חברות)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster סוג פרא w1118Bloomington</td> <td>Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><<td>br/> מצב אחסון: 24 & deg; C</td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&prime;,N&prime;-חומצה טטראצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>זהירות: קורוזיבי למתכות, רעילות חריפה, קורוזיה בעור, נזק חמור לעיניים, רעילות מימית חריפה. מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td> מצב אחסון: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>Na2phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td> מצב אחסון: -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td> מצב אחסון: 2-8 & deg; C</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>Saponin מקליפת קווילג'ה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponin מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: 5 מ"ג ב-1 מ"ל של תמיסת שימור. הכן טרי מדי יום.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td> מצב אחסון: 2-8 & deg; C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>נתרן דיתיוניט. זהירות: חומרים ותערובות לחימום עצמי, רעילות חריפה, רעילות מימית חריפה רעילות מימית כרונית. מצב אחסון: RT</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2256</td><td>פירובט מצב אחסון: 2-8 ו-deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. הכן טרי מדי יום.</td></tr><tr><td>L-(-)-חומצה מאלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malate מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. מנטרלים עם KOH ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-דיפוספט מונופוטסיום מלח הידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP מצב אחסון: -20 & deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. מנטרלים עם KOH ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ציטוכרום c מלב סוסים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>ציטוכרום c מצב אחסון: -20 & deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>נתרן סוקסינט דו-בסיסי הקסהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2378</td><td>סוקסינט מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. לנטרל עם HCl ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>sn-גליצרול 3-פוספט ביס(ציקלוהקסילאמוניום) מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7886</td><td>גליצרול-3-פוספט מצב אחסון: -20 & deg; הכנת תמיסת C : במי MilliQ. לנטרל עם HCl ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)פנילהידרזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2920</td><td>FCCP. אזהרה: רעילות חריפה, רגישות בעור, רעילות מים כרונית. מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: באתנול מוחלט. יש לאחסן בבקבוקוני זכוכית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8875</td><td>זהירות: רעילות חריפה, גירוי בעור, גירוי בעיניים, רעילות איברי מטרה ספציפיים (מערכת הנשימה), רעילות מימית חריפה, רעילות מימית כרונית. הכנת תמיסה: באתנול מוחלט. יש לאחסן בבקבוקונים כהים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חומצה מלונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1296</td><td>מלונט. אזהרה: רעילות חריפה, נזק חמור לעיניים. מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. לנטרל עם KOH. הכן טרי מדי יום.</td></tr><tr><td>אנטימיצין A מStreptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycin A. זהירות: רעילות חריפה, רעילות מימית חריפה, רעילות מימית כרונית. מצב אחסון: -20 ו-deg; הכנת תמיסת C : באתנול מוחלט. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בבקבוקונים כהים בכתובת&nbsp; -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>(+)-נתרן L-אסקורבט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4034</td><td>אסקורבט מצב אחסון: RT הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בבקבוקונים כהים בכתובת&nbsp; -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>נתרן אזיד. אזהרה: רעילות חריפה (דרך הפה והעור), רעילות של איברי מטרה ספציפיים (מוח), רעילות מימית, רעילות מימית כרונית.&nbsp; הכנת תמיסה: במי MilliQ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr></tbody></table>

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מייצג מודל המתעוררים עבור המחקר של חילוף החומרים. אכן, דרוזופילה יש מבנים הומולוגיים לאברים אנושיים, בעלי מאוד שנשמרת מסלולים מטבוליים, יש אורך חיים קצר יחסית המאפשר לימוד מנגנונים בסיסיים שונים בתקופה קצרה של זמן. עם זאת, מפתיע כי באחד המנגנונים חיוני לחילוף החומרים הסלולר, הנשימה מיטוכונדריאלי לא ביסודיות נבדקה במודל זה. סביר כי המדד הנשימה מיטוכונדריאלי ב דרוזופילה בדרך כלל דורש מספר רב מאוד של אנשים, התוצאות המתקבלות אינן מאוד לשחזור. כאן, מתוארת שיטה ומאפשר המידה המדויקת של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות כמויות מינימליות של רקמה מתוך דרוזופילה. בשיטה זו, thoraxes ביתר, permeabilized באופן מכני עם מלקחיים חדה והן מבחינה כימית עם סאפונין, ומאפשר תרכובות שונות לעבור את קרום התא לווסת את הנשימה מיטוכונדריאלי. לאחר permeabilization, פרוטוקול מתבצע כדי להעריך את היכולת של מתחמי שונים של מערכת התחבורה אלקטרון (ETS) להתחמצן מצעים שונים, כמו גם תגובתם של uncoupler, מעכבי מספר. שיטה זו מציג יתרונות רבים לעומת שיטות שימוש ומשום מיטוכונדריאלי, כמו זה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בגלל המיטוכונדריה עדיין אינטראקציה עם רכיבים אחרים התאית, המורפולוגיה מיטוכונדריאלי כולו. יתר על כן, מדגם ההכנות מהירים יותר, ואת התוצאות המתקבלות הן מאוד לשחזור. על ידי שילוב היתרונות של דרוזופילה כמודל לחקר מטבוליזם עם הערכת הנשימה מיטוכונדריאלי, חשוב תובנות חדשות יכול להיות חשפה, במיוחד כאשר הזבובים חווים שונים סביבתי או pathophysiological תנאים.

עקבות נציג של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל הינו מסופק באיור2. פירובט, בנויים מוזרק בתאי יחד עם סיבי השריר permeabilized מכונים הנשימה CI-דליפה, דהיינו, כאשר המתחם מלך החוצנים הוא מגורה על ידי NADH המופק באמצעות חמצון פירובט, בנויים באמצעות מחזור חומצה tricarboxylic (CI). במהלך זה קצב נשימה, חמצן מיטוכונדריאלי נשמר בעיקר כדי לפצות על הדליפה הפרוטונים, כלומרפרוטונים חוצה מן המרחב intermembrane למטריקס מיטוכונדריאלי, כ...

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את הנשימה המיטוכונדריאלית בזבוב הפירות הנפוץ, Drosophila Melanogaster, באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של הדרוזופילה, כדי לאסוף את בית החזה. לאחר מכן מחדירים את שרירי התעופה בזהירות מכנית, עם מלקחיים חדים, ומודגרים בספונין, לחדירות נוספת. לאחר מכן מועברים בית החזה לתאים של מד נשימה, וצריכת החמצן המיטוכונדריאלית נמדדת בשילוב של סובסטרטים, מפרקים ומעכבים שונים. היי, אני קלו.

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בשחלות דרוזופילה חיות וקבועות מתוארות ומודגמות במאמר זה.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

למד מדידת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי בחזה מחורר של Drosophila באמצעות רזפירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו דורשת כמויות מינימליות של רקמה ומספקת תוצאות פיזיולוגיות רלוונטיות יותר לחקר מטבוליזם.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

גלה סרטונים נוספים