הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות בתאים מתורבתים או ברקמה, את השותפים המולקולריים של RNA ארוך שאינו מקודד מעניין. שיטה זו יכולה לעזור לפענח את הפונקציות הביולוגיות של RNA ארוך שאינו מקודד על ידי מתן ידע משמעותי חדש על ויסות RNA על ידי RNA ארוך שאינו מקודד. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שהיא שמישה לרוב היישומים מכיוון שביצענו אופטימיזציה שלה, ראשית למספר RNAS ארוכים שאינם מקודדים ושנית הן לתאים מתורבתים והן לתמציות רקמות.

השיטה שלנו מבוססת על שילוב של שתי שיטות קודמות, ה-ChIRP, ראשי תיבות של Chromatin Isolation by RNA Purifications, וה-CHART, שהוא ניתוח הכלאת לכידה של מטרות RNA. הספציפיות של השיטה שלנו היא שבדיקות האוליגונוקלאוטידים תוכננו באמצעות מודלים ביואינפורמטיים של מבנה משני של RNA ארוך שאינו מקודד ומטרתו הייתה לזהות את מטרות ה-RNA. ידגימו את ההליך שני טכנאים מהצוות שלי, בנדיקט בוייר וסברין גילן.

לאחר תרבית תאי GH4C1 על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את המדיום מצלחת תרבית תאים והשתמש בנפח אחד של PBS כדי לשטוף את התאים. הוסף 10 מיליליטר של 1% PFA ב- PBS כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, קשרו את התאים תחת תסיסה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

להרוות את פעולת ה-PFA על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1.25 גליצין מולרי ולערבב את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את התמיסה על ידי שאיפה והשתמשו ב -10 מיליליטר PBS כדי לשטוף את הצלחת פעמיים למשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של PBS, השתמש במגרד תאים כדי לאסוף תאים והעביר אותם לצינור צנטריפוגה.

סובב את הדגימה בחום של 510 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר כמה שיותר סופרנטנט ואחסן את הכדורים ללא הגבלת זמן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע קישור צולב של רקמות, טבלו חמישה מיליגרם של רקמת בלוטת יותרת המוח של העכבר שהושגה לאחרונה בנפח פי 10 של 1% PFA ב-PBS וערבבו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

להרוות את ה-PFA על ידי הוספת 0.05 מיליליטר של תמיסת גליצין 1.25 מולרית ולערבב את הרקמה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. שאפו את המדיום והשתמשו ב-0.5 מיליליטר PBS כדי לשטוף את הרקמה פעמיים. לאחר הסרת כמה שיותר סופרנטנט, אחסן את הרקמה הצולבת ללא הגבלת זמן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

הכן את מאגר הליזיס ולאחר מכן כדי ליז דגימות ללא הפשרה מוקדמת. השתמש במאגר כדי להשעות מחדש דגימות בכמיליליטר אחד לכל 100 מיליגרם של כדור תא או רקמה. הנח את הדגימות הליזיות באמבט מים של ארבע מעלות צלזיוס והתחל את סדרת הסוניקציה המותאמת על פי פרוטוקול הטקסט.

מיד לאחר הסוניקציה, צנטריפוגה את הדגימות ב -12, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים. יש לבצע אופטימיזציה של סדרת הסוניקציה כך שתהיה יעילה מספיק כדי להפחית את הצמיגות מה-DNA מבלי להשיג RNA מקוטעים אחרים.

כדי לבצע הכלאה על הדגימות הסוניקטיביות, הוסף שני נפחים של מאגר הכלאה לצינורות ולמערבולת. מעבירים 20 מיקרוליטר מכל דגימה לצינורות צנטריפוגה ומאחסנים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. הוסף 100 פיקומולים של בדיקות אוליגונוקלאוטידים ביוטיניליות לכל דגימה.

לאחר מכן, דגרו את הדגימות בתסיסה מתונה על מסובב צינור בטמפרטורת החדר למשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה יש להוסיף לדגימות 50 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין מגנטיים בתוספת 200 יחידות למיליליטר של תמיסת מעכב RNase וקוקטייל מעכב פרוטאז של 5 מיקרוליטר למיליליטר. דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה מתונה על מסובב הצינור למשך הלילה.

למחרת, בצע בידוד RNA על ידי הנחת הצינורות על תומך מגנטי והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו 900 מיקרוליטר של מאגר כביסה לחרוזים והניחו את הצינורות על מסובב בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את הדגימות על המגנט, השליכו את המאגר וחזרו על הכביסה חמש פעמים.

לאחר הסרת הכביסה הסופית, הוסף לדגימה 95 מיקרוליטר של מאגר Proteinase K וחמישה מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז-K. לאחר מכן, על קרח, הפשירו את דגימות הקלט והוסיפו 75 מיקרוליטר של מאגר Proteinase K וחמישה מיקרוליטרים של פרוטאינאז-K. דגרו את הדגימות ב-50 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, ולאחר מכן ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

צננו את הדגימות על קרח במשך שלוש דקות, ואז הניחו אותן על המגנט ואספו את הסופרנטנט המכיל את הרנ"א והשליכו את החרוזים. השתמש בערכת טיהור RNA כדי לטהר את ה-RNA. לבסוף, אחסן את ה-RNA בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ובצע RT ו-qPCR ובנה ספריות DNA על פי פרוטוקול הטקסט.

בהתבסס על מודלים ביואינפורמטיים של המבנה המשני של lncRNA המוצג כאן, תוכננו בדיקות כנגד שני lncRNAs, חולדות Neat1 או Malat1 עבור תאים מתורבתים GH4C1 ועכבר Neat1 עבור תמציות רקמת יותרת המוח. ההעשרה היחסית של Neat1 או Malat1 חושבה עבור בדיקות לא ספציפיות וספציפיות ביחס לדגימות הקלט. איור זה מראה את היעילות של הבדיקות הספציפיות למשוך את Neat1 כלפי מטה בקו תאי יותרת המוח GH4C1 של החולדה ובתמציות רקמת יותרת המוח של העכבר.

כאשר הפרוטוקול עבור אוליגונוקלאוטידים ספציפיים או בדיקות SO הופנה ל-Malat1, נוצר בדיקה יעילה אחת יחד עם בדיקה אחת לא יעילה שהושלכה. בעקבות משיכות RNA ו-RT qPCR, ה-RNAs הקשורים ל-Neat1 בתמציות תאי GH4C1 היו קשורים גם ל-Neat1 בתמציות רקמת יותרת המוח. ואכן, לאחר משיכת ה-RNA של Neat1, נמצא כי Malat1 ממוקד על ידי Neat1 הן בקו התאים GH4C1 והן בתמציות רקמת עכבר יותרת המוח.

בנוסף, Neat1 הועשר באופן משמעותי לאחר שבוצעה משיכת RNA Malat1 עם הגשושית בתאי GH4C1. הקשר ההדוק שזוהה בין שני ה-lncRNAs עולה בקנה אחד עם התפקיד הפוטנציאלי של ויסות משותף של Neat1 ו-Malat1, המוצע על ידי עכברי נוק-אאוט Malat1 המציגים וריאציות בביטוי ה-RNA של Neat1. לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת תוך יומיים או שלושה ללכוד את מטרות ה-RNA של RNA ארוך שאינו מקודד רצוי.

בגישה הביואינפורמטית, חשוב לתכנן מספר בדיקות אנטי-חוש ולאחר מכן להשוות את יעילותן באופן ניסיוני מכיוון שיעילות הבדיקה עשויה להשתנות על ידי תכשירי ליזאט תאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ריצוף RNA בתפוקה גבוהה על מנת לספק את כל אינטראקטום ה-RNA של RNA ארוך שאינו מקודד מעניין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ללכוד את שותפי ה-RNA של RNA ארוך שאינו מקודד באמצעות בדיקות יעילות וספציפיות שמתכלאות לאזורים זמינים של ה-RNA הארוך שאינו מקודד כפי שנקבע על ידי מודלים ביואינפורמטיים של המבנה המשני שלו.