הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

המטרה הכוללת של אספקה תוך-שדרתית של נגיפים הקשורים לאדנו-רקומביננטיים היא לאפשר תיוג היסטולוגי ומניפולציה תפקודית של נוירונים מוגדרים גנטית בחוט השדרה הגבי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכאב, כגון אילו מעגלים עצביים נדרשים לתפיסה של אופני כאב שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לתפעל נוירונים מסומנים גנטית בצורה מוגבלת במיוחד ומבוקרת זמנית.

אתר את זוג הצלעות הזנב ביותר על ידי מישוש לאורך עמוד השדרה של העכבר המורדם. לאחר מכן, בצע חתך אורכי של 1.5 עד 2.5 סנטימטר בעור, החל מזוג הצלעות הזנב בלבד. הרם את העור בעזרת מלקחיים ונתק אותו מהשריר הבסיסי בעזרת מספריים.

לאורך כל הניתוח יש לשמור על לחות הרקמות החשופות עם נתרן כלורי סטרילי של 0.9%. בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים קטנים, עשו חתך לשכבה הקרומית הבאה עד דקה, ממש ליד קו האמצע, וחתכו אותה מהתהליכים הקוצניים. מספר ציוני דרך אנטומיים יכולים לסייע בזיהוי החוליות הנכונות למטרה.

כאן, אנו מתארים שלוש חלופות. ממשש לאורך עמוד השדרה זוג הצלעות הזנב ביותר ממוקם ממש רוסטרלי לחוליות T13 ועצם האגן בגובה הירך נמצאת ברמה של חוליות L6.

לחלופין, משוך את העור לאחור לכיוון הזנב כדי לחשוף את פסגת הכסל. באותה רמה, הזוג הזנבי ביותר של רצועות רוחביות שלמות גלויות מצטרף לתהליך עמוד השדרה L6. ספרו לאחור בכיוון זנב לרוסטרל כדי לזהות את החוליות המעניינות.

אחרת, אתר את המקום שבו הגיד לאורך צד עמוד השדרה הוא הלבן והמדיאלי ביותר. חוליות T13 ממוקמות רק ברוסטרל. קטע חוט השדרה המותני L4 ממוקם בתוך חוליה זו.

לאחר מכן, הניחו את החיה על כרית של רקמות מגולגלות כדי להעלות אותה אל מהדקי עמוד השדרה של המסגרת הסטריאוטקסית. יישר את המהדקים הסמוכים לחוליות המטרה. תקן מהדק אחד במקומו, ולאחר מכן החזק את עמוד החוליה בעזרת מלקחיים של אדסון תוך כדי קיבוע המהדק השני.

אשר את ההידוק הנכון על ידי לחיצה בזהירות על החוליות הממוקדות. לאחר מכן, הסר את השריר הפרספיני מעל החוליות המעניינות. ראשית, בצע חתך מדיאלי לגידים במקביל לעמוד השדרה של החוליות.

לאחר מכן, בצע חתכים מאונכים רוסטרליים וזנביים לחוליות המטרה. לאחר מכן, השתמש ב-rongeurs כדי לקרוע או לחתוך את השריר הפרספיני מעל החוליות המעניינות. השתמש במלקחיים לפי הצורך כדי להסיר רקמה שנותרה על החוליות או מעל הדורה בחלל התוך חולייתי.

כלי הדם הגבי אמור להיות גלוי כעת, ומסמן את קו האמצע של חוט השדרה. לזריקות חד צדדיות, בצע כריתה חלקית של למינקטומיה באמצעות מקדחה עדינה של רופא שיניים המצוידת בחותך כדורי של 0.5 מילימטר כדי לקדוח בזהירות רבה חור באמצע צד המטרה של החוליות. הסר את כל שברי העצם שנותרו בעזרת מחט משופעת בגודל 26 כדי לחשוף את חוט השדרה.

השתמש במחט כדי לנקב את הדורה בחללים התוך-חולייתיים הרוסטרליים והזנביים לחוליות המטרה, כ-300 מיקרון לרוחב כלי הדם הגבי. לאחר מכן, חורר את הדורה מתחת לחור הקדוח. בשלב זה, נוזל המוח צריך לברוח מהחורים וחוט השדרה צריך להיות בולט מעט החוצה.

הכן את מזרק ההזרקה על ידי הרכבה תחילה של נימי הזכוכית על מזרק מיקרוליטר. מהדקים היטב את האום כדי להבטיח התאמה הדוקה ובטוחה. מלאו את מזרק המיקרוליטר במים מזוקקים סטריליים, ואז לחצו על הבוכנה.

אם המים לא נפלטים בקלות מהקצה, סביר להניח שהמיקרופיפטה חסומה ויש להחליף אותה. התקן את המזרק על מיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק בשליטה אלקטרונית. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מזרק כדי לשאוב כמיקרוליטר אחד של אוויר כדי להפריד בין המים לווירוס.

לאחר מכן, פיפטה טיפה של 2.5 מיקרוליטר של תמיסת וירוס מדוללת על פיסת סרט פרפין. העבירו בזהירות את קצה המיקרופיפטה לתוך הטיפה באמצעות המסגרת הסטרוטקסית ומשכו אותה לתוך המיקרופיפטה. לאחר מכן, לחץ על החלק עד שתופיע טיפה של תמיסת וירוס בקצה.

החזר את המזרק והשתמש בעט כדי לסמן את המיקרופיפטה בסולם כדי לפקח על הנפח המחולק. השתמש בזרוע הסטריאוטקסית כדי להזיז את קצה המיקרופיפטה מעל אחד החורים בדורה ולאחר מכן למטה עד להופעת שקע קל על פני חוט השדרה החשוף. כדי למקד את ההזרקה לקרן הגב של עמוד השדרה, הזיזו את הקצה למטה לעומק של 500 מיקרון במרווחים של 100 מיקרון ולאחר מכן למעלה 200 מיקרון כדי לאפשר ייצוב מכני של הרקמה.

העומק הסופי של הקצה הוא 300 מיקרון. לאחר תכנות המשאבה להזרקת 300 ננוליטר במהירות הזרקה של 50 ננוליטר לדקה, לחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל בעירוי. לאחר השלמת ההזרקה, בדוק את האבנית על המיקרופיפטה כדי לראות אם רמת הנגיף ירדה.

השאירו את המיקרופיפטה במקומה למשך שלוש דקות נוספות כדי לאפשר ללחץ להתאזן. לאחר שלוש דקות, החזר לאט את המיקרופיפטה ולאחר מכן חזור על ההליך עבור שני אתרי ההזרקה האחרים. לאחר ההזרקה האחרונה, הסר את מהדקי עמוד השדרה ואת הכרית מתחת לעכבר.

סגור את שכבות החתך בתפרים קטועים, תפר את שכבות הרקמה השטחיות בתפרים נספגים ואת העור בתפרים שאינם נספגים. מרחו חומר חיטוי יוד על הפצע התפור. יש להפסיק את ההרדמה ולהשאיר את בעל החיים על מחצלת החום עד שיתאושש לפני החזרתו לכלוב הביתי שלו.

רקמת עמוד השדרה באתר ההזרקה תיבדק בתום הניסוי. זה הכרחי כדי לוודא הזרקה והעברה מוצלחות וכדי לא לכלול נזק מוגזם לרקמות כתוצאה מהניתוח. כדי להמחיש את רמות הביטוי שניתן להשיג על ידי הזרקה תוך-שדרתית של AAV רקומביננטי, הוזרק נגיף המקודד את החלבון הפלואורסצנטי eGFP לחוט השדרה המותני של עכברים מסוג בר.

שלוש זריקות במרווח של כמילימטר אחד זו מזו יצרו זיהום כמעט מתמשך של מקטעי עמוד השדרה המותני L3 עד L5. הזרקת וירוס בעומק של 300 מיקרון משטח עמוד השדרה מובילה לזיהום דומיננטי של תאים בקרן הגב של חוט השדרה. עם זאת, ניתן למצוא תאים נגועים גם בקרן הגחון. וקטור גמיש תלוי cre המבטא eGFP הוזרק לחוט השדרה של עכברים טרנסגניים GlyT2:Cre.

זה הביא לביטוי eGFP מוגבל יותר המשקף את התפלגות הנוירונים החיוביים של GLYT2. ביצוע פרוטוקול זה יאפשר מיקוד של שלושה מקטעי עמוד שדרה עוקבים. מצאנו שזה מספיק כדי להשיג תוצאות התנהגותיות חזקות.

טכניקה זו תאפשר לחקור את התפקוד של אוכלוסיות נוירונים ותאים ספציפיים ומסלולים חושיים.