לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בהדמיית תאים חיים כדי להעריך את החלטות גורל התאים לאחר טיפול בתרופה האנטי-מיטוטית פקליטקסל. שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין כיצד תאים בודדים מגיבים למינונים שונים של התרופה האנטי-מיטוטית פקליטקסל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שפע של מידע על תאים בודדים או אוכלוסיות שלמות שאינו ניתן להשגה מהדמיית תאים קבועים או מבחנים מבוססי אוכלוסייה.

מדגים שיטה זו הוא מארק ויטוריה, מועמד לרפואה ודוקטורט במעבדת גאנם. כדי להתחיל, נקה את תחתית הזכוכית של צלחת ההדמיה עם חומר ניקוי אופטי כדי להסיר טביעות אצבע או אבק שעלולים להפריע להדמיה. השתמש בחומר ניקוי אופטי מספיק כדי להרטיב את כל משטח הזכוכית.

הנח את צלחת הזכוכית עם תאים על שלב המיקרוסקופ במתאם צלחת ההדמיה. הסר את מכסה הפלסטיק מהצלחת וכסה את הכלי בתא זכוכית. ודא שלתא יש שסתום המאפשר זרימה קבועה של אוויר המורכב מ-5% פחמן דו חמצני.

כדי להרטיב את הפחמן הדו חמצני של 5%, הגז מוזרם דרך צינורות המוחדרים לבית אמבט מים סטרילי. זה מאפשר לגז להיות מאוזן ל-95% לחות. התחל וכיול את השלב המקודד באמצעות התוכנה השולטת במיקרוסקופ.

זה יבטיח קואורדינטות XY מדויקות וימנע סחיפה מוקדית. לאחר מכן, בצע את תאורת קוהלר על ידי הרמת המעבה וסגירת הצמצם כך שהשדה יהיה חשוך. הורד את הקבל עד שנראית צורת משושה חדה של אור.

לאחר מכן, השתמש בברגי המרכוז כדי למרכז את משושה האור בשדה הראייה. לאחר שהצורה המשושה נראית לעין, פתח את הצמצם עד שכל שדה הראייה מואר. הפעל את המיקוד האוטומטי של המיקרוסקופ כדי להבטיח שכל הנקודות נשמרות במיקוד לאורך כל הניסוי.

השתמש בתוכנת הרכישה כדי לבחור מספר שדות ראייה לא חופפים מכל באר להדמיה. בחר אזורי הדמיה שבהם התאים נדבקו היטב לתחתית הזכוכית והם בין 50 ל-70% מתלכדים. הימנע מאזורים של תאים גושים, מכיוון שהדבר יקשה על הניתוח שלאחר מכן.

כדי להעריך את גורל התא המיטוטי, הגדר את תוכנת ההדמיה לאסוף תמונות מכל שדה ראייה שנבחר כל 10 דקות למשך עד 96 שעות. מיטוזה לא מופרעת נמשכת 20 עד 40 דקות, ולכן מרווחים של 10 דקות יספקו מספיק דגימה כדי לזהות מתי תאים מתחלקים. כדי לזהות קרע גרעיני, שהוא אירוע חולף, רכשו תמונות כל חמש דקות.

זיהוי תאים הנכנסים למיטוזה על ידי התבוננות בעיגול תאים, באמצעות אופטיקה של ניגודיות פאזה ו/או עיבוי כרומוזומים, באמצעות היסטון H2B אנושי המותך ל-GFP. גם עיגול התאים וגם עיבוי הכרומוזומים נראים בקלות על ידי העין. הערות על השעה בה התא נכנס למיטוזה.

המשך לעקוב אחר התא עד שהוא מגיע לגורלו. תאי בקרה צריכים ליישר ביעילות את הכרומוזומים שלהם ולהיכנס לאנפאזה תוך שעה. דמיין אנפאזה על ידי אופטיקה של ניגודיות פאזה כאשר התא מתחיל לצבוט לשניים או באמצעות הדמיה של כרומוזומים הנעים לכיוון הקוטב המסומנים ב-H2B-GFP.

ביאורים לזמן שבו התא עובר אנאפאזה. לעומת זאת, תאים שטופלו בפקליטקסל יישארו מעוגלים עם כרומוזומים מרוכזים למשך מספר שעות. לזהות תאים שנעצרו מיטוטית שעוברים מוות תאי.

תאים שמתים במהלך המיטוזה מוצגים על ידי מיקרוסקופ ניגוד פאזה, שכן תאים יתכווצו, יתכווצו ו/או ייקרעו. אם מדמים H2B-GFP, הכרומוזומים יתפצלו גם במהלך מוות תאי. לזהות תאים שנעצרו מיטוטית שעוברים זליגת תאים.

תאים שעוברים החלקה מיטוטית נצפים על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, כשהם משתטחים בחזרה לכרומוזומים אינטרפאזיים ומפרקים מבלי לעבור אנאפאזה. תאים אלה מולידים תאים טטרפלואידים גדולים שלעתים קרובות הם מרובי גרעינים. המשך לעקוב אחר תאים משדה הראייה המקורי.

לאחר מעקב אחר שדה ראייה שלם, עבור לשדה ראייה נפרד שנרכש מאותה באר והמשך לעקוב אחר התאים. להעריך את גורל התא לאחר החלקה מיטוטית באמצעות קו תאי אפיתל פיגמנטי ברשתית שאינו מותמר ויציב כרומוזומלי המבטא את מערכת FUCCI. כדי לאשר שמערכת FUCCI פועלת כראוי, אמת שתאי הבקרה מחליפים ביטוי של החלבונים הפלואורסצנטיים האדומים והירוקים כראוי מניתוח נתוני הדמיית התאים החיים.

תאי בקרה צריכים לעבור מהצגת פלואורסצנציה אדומה גרעינית לחלוטין להצגת פלואורסצנציה ירוקה גרעינית לחלוטין במהלך האינטרפאזה כאשר התאים מתקדמים משלב G1 לשלב S. התאים צריכים להמשיך להפגין פלואורסצנטיות ירוקה לאורך כל השלמת המיטוזה. מיד לאחר המיטוזה, התאים אמורים להפגין שוב פלואורסצנטיות אדומה לחלוטין במהלך האינטרפאזה.

לזהות תאים שנעצרים במיטוזה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, ולעקוב אחריהם עד שהם עוברים החלקה מיטוטית. תאים שמחליקים מהמיטוזה וחוזרים לאינטרפאזה ישתנו מהצגת פלואורסצנטיות ירוקה במהלך המיטוזה לפלואורסצנטיות אדומה במהלך שלב G1. עקוב אחר תאים החליקו אלה באמצעות ניגודיות פאזה והדמיה אפיפלואורסצנטית בעין כדי להעריך את גורל התאים שלהם.

זהה תאים שנכנסים מחדש למחזור התא. תאים אלה מזוהים על ידי השינוי מאדום לירוק בביטוי הקרינה באמצעות מערכת FUCCI המציינת את המעבר G1/S. זיהוי תאים שעוברים מעצר מחזור תאי G1.

תאים אלה מזוהים על ידי ביטוי של פלואורסצנטיות אדומה שנמשכת יותר מ-24 שעות. כמו כן, זהה תאים שמתים באינטרפאזה. תאים אלה מזוהים על ידי קרע בתאים, בלבל והתכווצות באמצעות הדמיית ניגודיות פאזה.

דמיין את התאים כמו קודם. אות הקרינה מחזרת הדימר הטנדם של RFP התמזג לאות לוקליזציה גרעינית, או TDRFP-NLS, ו-H2B-GFP אמור להתמקם במהלך האינטרפאזה. מיטוזה מודגמת על ידי עיגול תאים באמצעות אופטיקה פאזה ו/או עיבוי כרומוזומים על ידי H2B-GFP.

עם המיטוזה, המעטפת הגרעינית תתפרק ואות TDRFP-NLS יהפוך לציטופלזמי. בעקבות המיטוזה, המעטפת הגרעינית תשתנה בתאי הבת ואות TDRFP-NLS יהפוך לגרעיני. עקוב אחר תאי בת לאורך שלב הביניים שלאחר מכן על ידי הדמיית תאים חיים.

זהה אירועי קרע גרעיני על ידי התבוננות בפרץ חולף של TDRFP-NLS מקומי גרעיני לתוך הציטופלזמה שמסביב. תוך דקות, המעטפת הגרעינית תתוקן וה-TDRFP-NLS יועבר לגרעין. מוצגות כאן תמונות מייצגות של תא שהחליק הופך לירוק ונכנס לשלב S לאחר החלקה מטיפול בפקליטקסל.

רוב התאים שהחליקו מטיפול בפקליטקסל עברו מעצר G1/G0 ונשארו אדומים במשך יותר מ-48 שעות מבלי לעבור אפופטוזיס. תאים אדומים לאחר החלקה יעברו גם הם אפופטוזיס, כפי שמיוצג בתמונה זו. קרע במעטפת הגרעין גדל בתאים שטופלו בפקליטקסל.

לתאי TDRFP-NLS ו-H2B-GFP שטופלו בפקליטקסל של 10 ננו-מולרי יש קרע גרעיני מוגבר שבו RFP יעבור דה-לוקליזציה מהגרעין לציטופלזמה בתאים בין-פאזיים. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להיות בעלי הבנה מוצקה כיצד לבצע דימות ארוך טווח של תאים חיים כדי להעריך את גורל התא בתגובה לטיפולים תרופתיים שונים.