סינתזה של צינורות פחמן עם קירות רב שופרת סילבר חלקיקים והערכה של פעילות אנטיבקטריאליות שלהם ומאפיינים ציטוטוקסיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר ננו-קומפלקסים אנטיבקטריאליים המורכבים מננו-צינורות פחמן עם ננו-חלקיקי כסף המסונתזים על פני הננו-צינורית. ניתן להשתמש בשיטה זו בפיתוח ננו-חומרים חיידקיים חדשים בעלי רעילות נמוכה לבני אדם ובעלי תכונות ספיגה חזקות לסוגים שונים של חיידקים וביופילמים. הפרוטוקול מתאר הערכה של ננו-קומפלקסים בהדברת חיידקים תוך שמירה על יכולת ההשוואה הביולוגית שלהם לבני אדם.

כדי להתחיל בהליך, הניחו 30 עד 50 מיליגרם של MWCNTs בבקבוקון של 50 מיליליטר. בעזרת מיקרופיפטה המצוידת בקצות פיפטה של מיליליטר אחד, הוסף לאט שמונה מיליליטר של תמיסה של שלושה לאחד בנפח של חומצה גופרתית וחומצה חנקתית ל-MWCNTs. המתן 30 דקות לסיום התגובה האקסותרמית, ולאחר מכן סוניקציה של התמיסה ב-60 עד 80 מעלות צלזיוס ו-160 וואט עד שה-MWCNTs יתייצבו בתחתית הבקבוקון, מה שבדרך כלל לוקח כשעה.

מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה. השתמש במיקרופיפטה כדי להוסיף בזהירות 30 מיליליטר מים מזוקקים טיפה ל-MWCNTs הפונקציונליים של חומצה קרבוקסילית, והשהה כדי לאפשר לתערובת להתקרר לפי הצורך. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת בחום של 12, 000 גרם למשך 15 דקות.

הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה המצוידת בקצה פיפטה של מיליליטר אחד. הוסף חמישה מיליליטר אתנול למוצק ושטוף את קירות הבקבוקון באתנול נוסף. צנטריפוגה את התערובת שוב עם אותן הגדרות ובדוק את ה-pH של הסופרנטנט עם נייר pH.

המשיכו לשטוף את המוצקים על ידי צנטריפוגה באתנול עד שה-pH הסופרנטנט יהיה ניטרלי, ואז הסירו את הסופרנטנט והוסיפו מיליליטר אחד של מים מזוקקים למשקעים. פזרו את ה-MWCNTs המתפקדים של חומצה קרבוקסילית במים והקפיא את הפיזור במינוס 60 מעלות צלזיוס בוואקום. הנח 10 מיליגרם של MWCNTs מתפקדים של חומצה קרבוקסילית מיובשת בהקפאה בצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר.

הוסף 30 מיליליטר מים מזוקקים לשפופרת. שלב שישה מיליליטר של 0.1 חנקת כסף רגילה ו -18 מיליליטר מים מזוקקים בצינור חרוטי נוסף של 50 מיליליטר. סוניקציה של שתי התערובות ב-60 מעלות צלזיוס ו-160 וואט למשך שעה.

לאחר מכן, תוך כדי סוניקציה של פיזור ה-MWCNT ב-60 מעלות צלזיוס ו-160 וואט, הוסף את תמיסת חנקת הכסף טיפה לפיזור MWCNT באמצעות פיפטה המצוידת בקצה פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר השלמת ההוספה, המשיכו לסוניקציה של התערובת למשך שעה, ולאחר מכן צנטריפוגה את התערובת למשך 15 דקות בחום של 12,000 גרם בטמפרטורת החדר והסירו את הסופרנטנט. פזרו מחדש את ה-MWCNTs הכסופים ב-30 מיליליטר של מים מזוקקים על ידי סוניקציה ב-24 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

חזור על הצנטריפוגה ב -30 מיליליטר מים מזוקקים והסר את הסופרנטנט פעמיים. לאחר מכן, פזרו את ה-MWCNTs הכסופים השטופים במיליליטר אחד של מים מזוקקים על ידי סוניקציה למשך חמש דקות. מוסיפים לפיזור חמישה מיליליטר אתנול ומערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת למשך 15 דקות בחום של 12, 000 גרם בטמפרטורת החדר ובדקו את ה- pH של הסופרנטנט. הסר את הסופרנטנט ופזר מחדש את התערובת בחמישה מיליליטר אתנול על ידי מערבולת. המשך לשטוף את המשקעים באתנול על ידי צנטריפוגה עד שה-pH הסופרנטנט יהיה ניטרלי.

לבסוף, פזרו את ה-MWCNTs הכסופים השטופים במיליליטר אחד של מים מזוקקים. מקפיאים לייבש את הפיזור במינוס 70 מעלות צלזיוס בוואקום למשך 24 שעות ולאחסן את הפיזור בכלי אטום. כדי להתחיל בהכנת הבדיקה, מערבבים ומחטאים 18.12 גרם אגר R2A וליטר מים מזוקקים.

הניחו לג'ל להתקרר בטמפרטורת החדר. כשהג'ל מוכן למזיגה, מניחים 10 מיליליטר ג'ל בכלי פטרי 90 מילימטר ומאפשרים לאגר להתקשות. במכסה אדים, השתמש בלולאה ובמחט מעוקרות בלהבת אלכוהול כדי לפספס 100 מיקרוליטר של תערובת מיני מתילובקטריום על פני מדיום התרבות.

דגרו את הכלים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, ואז ערבבו 3.12 גרם מרק R2A עם ליטר מים מזוקקים וחיטוי את המדיום בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השתמש בלולאה ומחט מעוקרות כדי להעביר את המושבות למדיום הגידול R2A. דגרו את הדגימה באינקובטור רועד ב-30 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד.

מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר לשעה עד שהצפיפות האופטית גדולה מ-0.7. לאחר מכן, הכינו צלחת פטרי נוספת המכילה 10 מיליליטר אגר R2A. לאחר מכן מערבבים 3.12 גרם מרק R2A ושמונה גרם אגר עם ליטר אחד של מים מזוקקים.

חיטוי התערובת בחום של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מערבבים 100 מיקרוליטר מתרבית ה-methylobacterium לתערובת האגר. יוצקים 10 מיליליטר מהג'ל המכיל מתילובקטריום על השכבה התחתונה של אגר R2A בצלחת הפטרי, ואז מכינים פיזור של הריכוז הרצוי של MWCNTs כסף מיובשים בהקפאה במים מזוקקים.

השתמש במיקרופיפטה כדי לטעון 50 מיקרוליטר מפיזור זה על דיסק נייר סטרילי בגודל שישה על אחד. מרחו מים מזוקקים על דיסק נייר סטרילי אחר כבקרה. יבש ועיקר את שני הדיסקים בתא ואקום תחת אור UV למשך 30 דקות.

לאחר מכן הניחו את דגימת ה-MWCNT הכסופה ואת הבקרה על האגר ודגרו את צלחת האגר ב-30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. מדוד את אזור העיכוב סביב דגימת ה-MWCNT הכסופה בסיום. לפני הבדיקה, חיטוי מים מזוקקים משולש ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

הכן פיזור של 1000 מיקרוגרם למיליליטר של MWCNTs מתפקדים של חומצה קרבוקסילית ו-50 מיקרוגרם למיליליטר, 40 מיקרוגרם למיליליטר ו-30 מיקרוגרם למיליליטר של MWCNTs כסף במים סטריליים אלה. כדי להתחיל בהליך הבדיקה האנטיבקטריאלית, הכינו תרבית מתילובקטריום כפי שתואר קודם לכן ועקבו אחר הצפיפות האופטית שלה ב-600 ננומטר. כאשר הצפיפות האופטית היא מקסימאלית, יש לחסן 100 מיקרוליטר מתרבית המתילובקטריום לשלושה מיליליטר של מדיום תרבית R2A טרי.

הניחו 500 מיקרוליטר של תמיסה זו בכל אחד מחמשת הצינורות החרוטיים של 15 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר מתנול לאחד הצינורות כדי להכין את דגימת הייחוס של המתנול. הכן דגימה לכל אחד מארבעת הפיזורים באותו אופן.

דגרו את הדגימות ואת תרבית הבקרה הנותרת של מתילובקטריום ב-180 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס עד שהצפיפות האופטית של הבקרה מצביעה על פעילות מקסימלית. השתמש במפזר מעוקר כדי למרוח כל דגימה על ג'ל אגר R2A מוצק בצלחות פטרי. דגרו את הכלים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

ספרו את מושבות החיידקים המתקבלות וקבעו את הריכוז המינימלי של חיידקים. MWCNTs כסף סונתזו בהצלחה באמצעות ההליך המתואר. גודל חלקיקי הכסף הממוצע שהושקע היה כ-3.83 ננומטר.

צמיחת מתילובקטריום לא נצפתה בתרבית עם פיזור של 50 מיקרוגרם למיליליטר או 40 מיקרוגרם למיליליטר של MWCNTs כסף. אוכלוסיית החיידקים הצטמצמה פי 100,000 ביחס לדגימת הביקורת כאשר תרבית עם פיזור של 30 מיקרוגרם למיליליטר של MWCNTs כסף. אזור עיכוב נצפה סביב דגימה שהוכנה מפיזור של 10 מיקרוגרם למיליליטר של MWCNTs מכסף.

לא נצפה אזור עיכוב עבור דגימה שהוכנה מפיזור של מיקרוגרם אחד למיליליטר. ציטוטוקסיות מסוימת נצפתה כאשר נוספה פיזור של 40 מיקרוגרם למיליליטר של MWCNTs כסף. לא נצפתה ציטוטוקסיות משמעותית כאשר נוסף פיזור של 30 מיקרוגרם למיליליטר.

בדיקת טריפן כחול אישרה כי הייתה ציטוטוקסיות מינימלית כאשר נוספה פיזור של 30 מיקרוגרם למיליליטר של MWCNTs כסף. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים בהכנת ננו-קומפלקסים בעלי ננו-חלקיקי מתכת הפועלים ישירות על ננו-חומרים פחמניים. בעקבות פרוטוקול זה, החוקרים יוכלו גם להעריך את התכונות האנטיבקטריאליות של הננו-קומפלקסים המוכנים.