ניקוב-Induced כורוידאלית איריס כמודל העכבר של Rubeosis Iridis
8 במרץ 2018
איריס כורוידאלית, סיבוך נפוץ של מחלת רשתית איסכמי, עלול להוביל סכנת הראייה neovascular גלאוקומה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מאתר להשראת כורוידאלית איריס ניסיוני העשויות לשמש להערכה לא פולשנית של חומרים להתכוונן אנגיוגנזה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לכלי דם בקשתית, המאפשרת הדמיה ישירה של תהליכים אנגיוגניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת העיניים, במיוחד במחלות ניאו-וסקולריות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בעכברים לבקנים כדי לאפשר הדמיה מכוונת של כלי הדם.
באמצעות שיטה זו יכול לתת תובנה לגבי מחלות ניאו-וסקולריות בעיניים. ניתן ליישם אותו גם כמודל כללי של אנגיוגנזה, כגון בדיקות לטיפולים אנגיוגניים חדשים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שדיסקציה של הקשתית מאתגרת בגלל גודלה הקטן של עין העכבר.
עם תרגול, לעומת זאת, ניתן לשלוט בו. לאחר הרדמת עכבר P12.5 והכנתו להליך, הכניסו אותו למצב שכיבה לרוחב מתחת לסטריאוסקופ וודאו שהמסכה ממוקמת היטב. העין צריכה למלא את שדה הראייה.
מיקוד ברור של העין הוא הכרחי. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים קטנים של קשירה ביד הלא דומיננטית, הבליטו בזהירות את העין על ידי הפעלת לחץ כלפי מטה על העפעפיים, הגב והגחון לעין. שמירה על אחיזה חזקה בעפעף עוזרת.
לפני שתמשיך, תעד את כלי הדם ב-40X. לאחר מכן, השתמש בסטריאוסקופ כדי לאתר את לימבוס הקרנית. ניתן לזהות בקלות את הלימבוס של עכברי BALB/c לבקנים כמקלעת כלי הדם העגולה האחורית לקרנית.
כעת, ביד הדומיננטית, החזק מחט משופעת בגודל 30 והשתמש בה כדי לבצע ניקוב ענבה קטן ליד הגבול הלימבלי האחורי של הענביה בין הגוף הריסי לאורה סראטה. בצע את הפנצ'ר באמצעות קצה המחט בלבד ולא יותר ממחצית השיפוע. הימנע מקרע בעדשה.
הניקוב צריך להיות אטום מעצמו אך עדיין לאפשר הזרקה תוך עינית של חומרי מחקר דרך הפצע. לאחר מכן, בצע ניקוב ענבה שני באתר הנגדי של העין. בצע אופטימיזציה של הפנצ'רים כך שיהיו במיקומים הגביים והגחוניים ביותר.
חזור על ניקוב הענבה באותם שני מצבים כל ארבעה ימים עד P24.5. ולפני שאתם חוזרים על הדקירה, בדקו תמיד אם יש קטרקט טראומטי. לאחר הוצאת העין וקיבוע העין כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הסר את התמיסה המקובעת ושטוף את העין שלוש פעמים עם PBS טרי.
לאחר מכן, הניחו את העין על משטח חלק ויבש כשהחדר הקדמי כלפי מעלה. לאחר מכן, הכנס מחט משופעת בגודל 30 אחורית ללימבוס כדי ליצור נקודת כניסה. לאחר מכן, אבטח את החלק הקדמי בעזרת מלקחיים קשירה קטנים והשתמש במספריים ישרים של קליימן-ואנס כדי לחתוך סביב הלימבוס תוך כדי סיבוב העין.
שימוש בחיתוכים חלקיים יכול להקל על התהליך. בסיום, החלק האחורי של העין אמור להשתחרר. לאחר מכן, מקם את החלק הקדמי כלפי מטה כדי לחשוף את העדשה.
הסר את העדשה בזהירות על ידי אחיזתה במלקחיים קטנים ומשיכה כלפי מעלה. כעת, מקם את הקטע הקדמי כשהקרנית פונה כלפי מטה ועם החתך בניצב לשדה הראייה. לאחר מכן, תפוס בעדינות את הרקמה האחורית לגוף הריסי באמצעות מלקחיים קשירה קטנים ביד הלא דומיננטית.
מספריים ישרים של קליימן-ואנאס לחיתוך ממש קדמי לגוף הריסי במטרה להסיר את הרשת הטרבקולרית ולבודד את הקשתית. לאחר מכן הקשתית צריכה לנוע בתוך הקרנית. לאחר מכן, השתמשו במלקחיים קטנים כדי לאחוז בקרנית והעבירו בזהירות את העין הקדמית לצלחת של 96 בארות המכילה 200 מיקרוליטר PBS.
שמרו על האחיזה בקרנית והמשיכו לנתח את הקשתית על ידי שטיפת הרקמה עם PBS. במידת הצורך, ניתן להשתמש במחט בגודל 30 כדי לסייע בעקירת הקשתית. כעת, הסר את הקרנית בעזרת מלקחיים הקשירה הקטנים.
לאחר מכן ניתן לאחסן את הקשתית המבודדת ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס באופן זמני עד לניסויים. עכברי BALB/c לבקנים ב-P12.5 היו נתונים לניקוב ענבה שחזר על עצמו כל יום רביעי עד P24.5, כפי שתואר. בשל השקיפות של הקרנית והמחסור במלנין בעכברי BALB/c, כלי הדם של הקשתית נראים בקלות בגורי P16.5 ומתעצמים לאורך כל הפרוטוקול.
ב-P27.5, עכברים הומתו בהמתת חסד וקשתית העשתית שלהם נותחה בקפידה. הנקבים גרמו לתגובה וסקולרית מהקשתית על ידי הפעלת מערכת ריפוי הפצעים. אימונוהיסטוכימיה בוצעה כנגד PECAM1.
הכתם שנוצר הראה עלייה בכלי הדם הכוללים בקשתית של עיניים מנוקבות בהשוואה לביקורת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לאנגיוגנזה של הקשתית ולבודד בהצלחה את קשתית העכבר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו QBCR על מנת לענות על שאלות מולקולריות ותאיות נוספות כגון בדיקת יעילותם של חומרים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור מחלות ניאו-וסקולריות בשיטות in-vivo ולא פולשניות תוך שימוש במכרסמים קטנים כמודל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול בעכברים להשראה של נאווסקולריזציה של הקשתית (iris neovascularization), מצב הקשור למחלה רשתית איסכמית ולגלאוקומה נאווסקולרית. השיטה מאפשרת הערכה לא פולשנית של חומרים המווסתים אנגיוגנזה באמצעות הדמיה ישירה של כלי הדם בקשתית in-vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ופתלמולוגיה
- אנגיוגנזה
- מחלות ניאו-וסקולריות
רקע
- ניאובסקולריזציה של הקשתה עלולה לסכן את הראייה.
- הבנת תהליך האנגיוגנזה (יצירת כלי דם חדשים) היא חיונית לפיתוח טיפולים.
- השימוש בעכברים לבנויים מקל על הדמיית כלי הדם.
- קיימים קשיים בדיסקציה של הקשתית בשל גודלו הרב של עין העכבר.
מטרת המחקר
- להשראת כלי דם בקשתית לצורך מחקרים in-vivo.
- לספק תובנות לגבי מחלות נאווסקולריות של העין.
- לבחון טיפולים אנגיוגניים חדשים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- השראה של ניאובסקלריזציה (יצירת כלי דם חדשים) בקשתית בעכברים אלבינו.
- טכניקות של הדמיה ב-in-vivo.
- הערכה ניסויית של חומרים המודולים אנגיוגנזה.
- הדגמה של טכניקות לדיסקציה של הקשתית.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של ניאובסקלריזציה (יצירת כלי דם חדשים) בקשתית.
- ויזואליזציה יעילה של תהליכים אנגיוגניים.
- השגת תובנות לגבי המנגנונים של מחלות ניאובסקלריות.
- יישומים פוטנציאליים לבדיקת טיפולים חדשים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך לחקר ניאובסקולריזציה של הקשתית.
- היא משפרת את ההבנה של מחלות ניאובסקולריות עיניות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש במודל זה לבדיקה של טיפולים תרופתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה מאפשר הערכה ארוכה ומסילית, לא פולשנית, של תהליכי אנגיוגנזה בקשתית העין, ובכך תומך בתיקוף של מטרות בשלב מוקדם עבור טיפולים נאו-וסקולריים. באמצעות ניצול השקיפות של עיני עכברים לבנו (albino), הוא מספק פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכת מודולטורים של אנגיוגנזה בהקשר עיני רלוונטי למחלה. גישה זו מפחיתה את ההסתמכות על היסטולוגיה בנקודת סיום ומגבירה את רמת הוודאות החיזויית בסריקות פרה-קליניות של אנגיוגנזה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מסלולים אנגיוגניים באמצעות ניאובסקולריזציה של הקשת הניתנת להשראה, המונעת על ידי מערכות דלקתיות ומערכות הפעלת פלסמינוגן.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ניקובים חוזרים ואוטומיים של הענבלית המעוררים תגובה וסקולרית מדידה.
- ערך חיזוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה in-vivo של מודולציה של אנגיוגנזה לאורך זמן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדד כמותי לתהליך האנגיוגנזה באמצעות אימונוהיסטוכימיה של PECAM1 והדמיה לא פולשנית in-vivo דרך קרנית השקיפה.
- ערך תפעולי: מאפשר השראה כלי דם סטנדרטית וחוזרת מדי ארבעה ימים מ-P12.5 עד P24.5, התומכת בחזרתיות של הבדיקה.
- ערך סקלאביליות: תואם להכנה של flatmount של קשתיות BALB/c חצאי-שקיפות לצורך אנליזה אימונוהיסטוכימית ברזולוציה גבוהה עם רקע נמוך.
מחקר תרגומי ופקליני
- ערך תרגומי: מדמה את הפתוגנזה של גלאוקומה ניאובסקולרית, סיבוך מאים על הראייה של רטינופתיה סוכרתית, ובכך מגביר את הרלוונטיות למחלה.
- המשכיות פרה-קלינית: מאפשר בדיקה של חומרים פרו-או אנטי-אנגיוגניים in vivo, ובכך מגשר בין שלב הגילוי להערכה טיפולית.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר ניטור אורך של תגובה וסקולרית, התומך בהחלטות המשך (go/no-go) המבוססות על יעילות אנגיוגנית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף גילוי התסמיכים של תהליך האנגיוגנזה, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני של יעילות המודולטור, במיוחד בתוכניות מחקר למחלות ניאובסקולריות עיניות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי השראת אנגיוגנזה באמצעות ריפוי פצעים וגירויים דלקתיים בקשתית.
- סריקה: מספק תוצרי כלי דם כמותיים וניתנים לשחזור, המתאימים לסריקה של חומרים אנגיוגניים בהקשר של רקמה חיה.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח של צפיפות ומורפולוגיה של כלי דם באמצעות צביעת PECAM1 وديמוי in-vivo, ובכך מקל על הערכה השוואית של תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מדמה מנגנונים של גלאוקומה ניאובסקולרית אנושית, ובכך תומך בתיקוף פרה-קליני המותאם לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה להשראת כלי דם הניתנת לשימוש חוזר ורלוונטית למספר פרויקטים המתמקדים באנגיוגנזה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון ביעד על ידי מידול של נאווסקולריזציה של הקשתית בדומה לאזו שבאדם, המונעת על ידי מסלולי אנגיוגנזה שמורים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות תזמון דקירה סטנדרטי, בחירת אתר וניטור לאחר ניתוח עבור קטרקט טראומטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקריאת יעילות מוקדמת ולא פולשנית, המפחיתה את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מועמדים אנגיוגניים בהתבסס על תגובת כלי הדם של הקשתית in-vivo.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של מיקרו-כירורגיה, כולל דקירה של הענביה ובידוד של הקשת תחת הדרכה סטריאוסקופית.
- תלוי בציוד כגון מחטים בעלות חוד משופע בכילוג 30, פינצטות קשירה ומספרי Clayman-Vannas למניפולציה מדויקת של רקמות.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לעיתוי הדקירה (כל 4 ימים מ-P12.5 עד P24.5) ומעקב לאחר הניתוח כדי להבטיח עקביות של המודל.
- שיקולי התאמה כוללים וריאציות בפיגמנטציה של זן העכברים ובשקיפות הקרנית, המשפיעות על איכות הוויזואליזציה של כלי הדם.
- מגבלות מעשיות כוללות את האתגר הטכני של דיסקציה של הקשת בשל גודל העין הקטן, דבר הדורש אימון לצורך בידוד אמין של הרקמה.
