בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר
4 באפריל 2018
גידול תאי אנדותל הם גורמים חשובים של microenvironment הגידול הקורס של המחלה. כאן, עבור בידוד תאי אנדותל טהורה ובת -קיימא מן האנושי קרצינומה של המעי הגס והמעי הגס רגיל כדי לשמש בדיקות סמים ומחקר פתוגנזה פרוטוקול המתואר.
המטרה הכוללת של פרוטוקול בידוד תאים זה היא להשיג תאי אנדותל טהורים וברי-קיימא מחולים הסובלים מקרצינומה של המעי הגס, הן מהגידול והן מהמעי הגס הרגיל המתאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הגידול ואנגיוגנזה, כגון להעריך ולנתח את ההשפעה של מערכת כלי הדם על גידול המעי הגס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לקבל אחוזי הצלחה גבוהים יחסית בהשגת תאי אנדותל אנושיים טהורים וברי-קיימא מחולים עם קרצינומה של המעי הגס.
כדי להשיג את דגימת הרקמה מחולי קרצינומה של המעי הגס, השתמש באזמל טרי כדי להשיג חתיכות רקמה במשקל של כגרם. לאחר מכן, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את חתיכות הרקמה הטריות ב-40 מיליליטר של מאגר HBSS קר כקרח עם אנטיביוטיקה בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש במלקחיים סטריליים נפרדים כדי להעביר את הקרצינומה ואת הרקמה הרגילה ברצף מצינור צנטריפוגה אחד למשנהו כדי לשטוף 40 מיליליטר של חיץ HBSS קר כקרח עם אנטיביוטיקה ארבע פעמים.
כדי להסיר את כל השומן, הרקמה הלא גידולית או חלקי הרקמה הנמקית הפוטנציאליים, השתמש במלקחיים סטריליים והעביר את חלקי הרקמה לצלחת פטרי של תרבית תאים סטרילית. לאחר מכן, הוסיפו שלושה עד חמישה מיליליטר של מאגר HBSS בתוספת אנטיביוטיקה כדי להשאיר את חלקי הרקמה לחים. לאחר מכן, השתמש באזמל טרי כדי לקצץ את חתיכות הרקמה.
לאחר מכן, השתמש באזמל עם להב מעוקל כדי לטחון את הרקמה שנותרה לחתיכות קטנות. העבירו את חתיכות הרקמה הטחונה לצינור דיסוציאציה של רקמות מלא במדיום תרבית תאים שחומם מראש. נתק את חלקי הרקמה הטחונה באמצעות דיסוציאטור רקמות, יחד עם ערכת דיסוציאציה של גידול לרקמות אנושיות בהתאם להוראות היצרן.
השלב הקריטי הראשון הוא לעבד נכון ולנתח את דגימת הניתוח על מנת להשיג חתיכות רקמה בגודל ובסוג הרקמה הנכונים. לאחר פירוק חלקי הרקמה, יש לצנטריפוגה בטמפרטורת החדר בכוח הכבידה פי 300 למשך דקה אחת. לאחר מכן, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להוסיף 10 מיליליטר של מדיום DMEM Low מחומם מראש לצינור ה-MACS.
לאחר מכן, שפכו את תרחיף התאים מהצינור על מסננת תאים בגודל נקבוביות של 100 מיקרומטר המונחת על גבי צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. פיפטה 10 מיליליטר נוספים של DMEM Low בינוני בצינור ה-MACS כדי לשטוף את התאים הנוספים מהצינור דרך המסננת בצינור הצנטריפוגה. לאחר סינון מתלה התא כולו, שטפו את מסננת התאים עם 10 מיליליטר נוספים של מדיום DMEM Low.
צנטריפוגה את תרחיף התא בטמפרטורת החדר בכוח הכבידה פי 300 למשך שבע דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט לאחר סיום הצנטריפוגה. לאחר מכן, ממיסים את כדור התא בחמישה מיליליטר של אנטיביוטיקה בתוספת מדיום EBM-2-MV מחומם מראש באותו צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.
הסר את תמיסת הציפוי מבקבוק התרבית, והעביר את תרחיף התא ישירות לבקבוק תרבית T-25 הנשמר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כאשר המפגש מגיע לכ-80 עד 90% הוסף מיליליטר אחד של אקוטאז כדי לנתק את התאים בבקבוק. לאחר מכן, השאירו את התאים עם ה- Accutase למשך 10 דקות.
לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום EBM-2-MV הנשמר ב-37 מעלות לתאים. לאחר מכן, השתמש במכשיר אוטומטי לספירת תאים עם טווח של 10 עד 25 מיקרומטר כדי לספור את התאים. השלב השני הקריטי ביותר הוא כל השלבים שבהם צריך לפצל את התאים.
הערכת נקודת הזמן הנכונה דורשת ניסיון. אם הפיצול מוקדם מדי, התאים ימותו. אם הפיצול מאוחר מדי, תאי האנדותל יגיעו להזדקנות או שצמיחת יתר של פיברובלסטים תהיה בעיה.
לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים בטמפרטורת החדר בכוח הכבידה פי 250 למשך ארבע דקות, והוציאו את הסופרנטנט בסוף הריצה. לאחר מכן, ממיסים את כדור התא במאגר FACS שחומם מראש. לאחר מכן, הוסף את הנוגדנים לצביעה של FACS לתאים.
מערבבים ולאחר מכן דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בסך הכל. לאחר מחצית מתקופת הדגירה הזו, החלק את הצינור פעם אחת. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להוסיף שני מיליליטר של מאגר FACS לתרחיף התא המסומן.
לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא בטמפרטורת החדר בכוח הכבידה פי 250 למשך ארבע דקות, ושפכו את הסופרנטנט לאחר סיום הצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של חוצץ FACS כדי להמיס את גלולת התא, וצנטריפוגה את התרחיף הסלולרי בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות בכוח הכבידה פי 250. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום EBM-2-MV בתוספת אנטיביוטיקה.
לאחר מכן, העבירו את התאים למכשיר המיון של FACS. זהה תאים חיוביים משולשים, ותן להם לזרוע לתוך צלחת התרבית בת 24 הבארות המלאה במדיום EBM-2-MV טרי ומחומם מראש. תרבית התאים במשך 48 השעות הבאות, ואז חידוש המדיום.
המשך לשנות את המדיום כל יומיים עד שהמפגש יגיע ל-90 עד 100% תוך חמישה עד 10 ימים. לאחר מכן, הרחב את אוכלוסיית התאים בהתאם למנת התרבות הרצויה. לאחר מכן, קצרו ברגע שמגיעים למפגש, והמשיכו לאפיון.
ראשית, דגימת הגידול המתקבלת מנותקת ונזרעת בצלחת תרבית תאים. התאים הלא נדבקים נשטפים, והתאים הדבקים עוברים תרבית למפגש של 80 עד 90% לפני מיון FACS. לאחר מכן, ניתוח FACS נעשה כדי לזהות את אוכלוסיית הגידול הבר-קיימא בעל התווית החיסונית ותאי אנדותל נורמליים.
לשם כך, תיוג משולש ספציפי לנוגדנים בצימוד פלואורוכרום של תאי האנדותל הנורמליים והגידול נעשה למיון באמצעות FACS. בממוצע 3.6 ו-5.6% מכלל אוכלוסיית התאים הממוינים הם תאי גידול ותאי אנדותל רגילים, בהתאמה. לאחר מכן, כדי לזהות את הביטוי של סמני תאי האנדותל, תאי האנדותל הרגילים והגידול המתקבלים נתונים לאימונוציטוכימיה.
התמונות כאן מראות תאים נורמליים ותאי אנדותל גידול חיוביים ל-CD31. לאחר מכן, ה-RNA מבודד מאוכלוסיית תאי האנדותל החיוביים ל-CD31 ונתון ל-RT-qPCR כדי לזהות את הסמנים הספציפיים לתאי האנדותל האחרים. מהגרף מתגלה גם ביטוי של סמני תאי אנדותל, כגון CD105, VE-cadherin וגורם פון ווילברנד, אך חסר ביטוי של סמנים מאוכלוסיות תאים שעלולות לזהם, מה שמעיד על טוהר תרביות תאי האנדותל המבודדות.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלושה שבועות אם היא מבוצעת כראוי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיא דורשת ניסיון בתרביות תאי אנדותל ראשוניות על מנת להעריך מתי ובאילו יחסים ניתן לפצל את התאים או לעבד אותם עוד יותר לניתוח המיון של FACS. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בקרצינומה של המעי הגס מכיוון שניתן להשתמש בתרביות התאים לזיהוי מנגנונים של תגובה לטיפול בגידול או עמידות בקרצינומה של המעי הגס.
הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר קראנו דיווחים רבים בספרות המצביעים על בעיות בהקמת תאי אנדותל טהורים וברי-קיימא מגידולים מוצקים אנושיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים של מיקרו-דיסקציה או עיבוד רקמות לניתוח מיון FACS או פיצול נוסף של תאי אנדותל דורשים ניסיון על מנת להעריך את נקודת הזמן הנכונה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להקים תחילה רשת שיתוף פעולה פונקציונלית עם ניתוחים, פתולוגיה ורישום גידולים.
יתר על כן, עליך להיות מאומן בפעילות גופנית לעבודה עם תרביות תאי אנדותל ראשוניות, מכיוון שתאים אלה שבירים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי אנדותל מקרצינומה של המעי הגס האנושי ומהמעי הגס התקין המתאים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד של תאי אנדותל טהורים וחיוניים מרקמות של קרצינומה קולורקטלית אנושית ומרקמות מעי גס נורמליות. השיטה נועדה להקל על בדיקת תרופות ומחקר של הפתוגנזה של סרטן המעי הגס והחלק התחתון של המעי הדק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
רקע
- תאי אנדותל של גידולים משפיעים באופן משמעותי על הסביבה המיקרוסקופית של הגידול.
- הבנת תאים אלה יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה של גידולים ותהליכי אנגיוגנזה.
- בידוד תאי אנדותל חיוניים הוא קריטי לחקר קרצינומה קולורקטלית.
- פרוטוקול זה נועד להעלות את שיעור ההצלחה בהשגת תאים אלו מחולים.
מטרת המחקר
- בידוד תאי אנדותל מרקמות של קרצינומה קולורקטלית ומרקמות מעי נורמליות.
- ניתוח תפקידו של מערכת כלי הדם בתהליך הקרצינוגנזה הקולורקטלית.
- מתן שיטה מהימנה לבדיקת תרופות ולמחקר פתוגנזה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות רקמה מחולי קרצינומה קולורקטלית.
- שטיפה ועיבוד רצופים של דגימות הרקמה.
- פירוק של רקמה קצוצה באמצעות מפריד רקמות (tissue dissociator).
- מיון באמצעות FACS לזיהוי ובידוד של תאי אנדותל חיוניים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי אנדותל גידוליים ותאי אנדותל נורמליים.
- זיהוי אוכלוסיות תאים באמצעות אנליזת FACS.
- אימונוציטוכימיה אישרה את הביטוי של סממני תאי אנדותל.
- תפוקה של 3.6% תאי אנדותל גידוליים ו-5.6% תאי אנדותל נורמליים מכלל האוכלוסייה.
מסקנות
- הפרוטוקול מבודד ביעילות תאי אנדותל חיוניים לצורכי מחקר.
- התובנות שניתן להפיק עשויות לקדם את ההבנה של הביולוגיה של סרטן המעי הגס.
- ניתן ליישם שיטה זו במחקרים נוספים בתחום האנגיוגנזה של גידולים.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד מהימן של תאי אנדותל אנושיים טהורים וחיוניים, הן מרקמת מעי גס נורמלית והן מרקמת קרצינומה של המעי הגס, מאפשר בחינה מכניסטית של הסביבה המיקרובית של הגידול ותרומתם של כלי הדם לתהליך התומוריגנזה. פרוטוקול זה תומך בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף של מטרות טיפוליות, על ידי אספקת מודלים תאיים רלוונטיים למחלה עבור מחקרים פונקציונליים ובדיקת היפותזות טיפוליות. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיק מוצרים על ידי מתן אפשרות להערכה רבסטית של אסטרטגיות אנטי-אנגיוגניות ומנגנוני עמידות בסרטן המעי הגס.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מחקר ישיר של ביולוגיית תאי אנדותל של גידולים (TEC) ותפקידם במיקרו-סביבה של הגידול.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות כלי דם המעורבות בהתקדמות סרטן המעי הגס והחלחולת ובבתגובה לטיפול.
- מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין תאי אנדותל של גידול (TECs) לבין תאי אנדותל נורמליים (NECs) באמצעות מיון FACS מבוסס סמנים.
- מספקת פלטפורמה להערכת ההשפעה של גורמים מיקרו-סביבתיים ספציפיים על הפנוטיפ והתפקוד האנדותליאליים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק תרביות ראשוניות טהורות וחיוניות של TEC ו-NEC המתאימות לסריקת תרכובות ולפיתוח בדיקות בהמשך התהליך.
- מאפשר הערכה כמותית של ביטוי סמני תאי אנדותל ותוצרים תפקודיים באמצעות אימונוציטוכימיה ו-RT-qPCR.
- משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי הבטחת אוכלוסיות תאים בדרגת טוהר גבוהה באמצעות מיון FACS עם שלושה סמנים.
- תומך בסריקה של חומרים אנטי-אנגיוגניים בהקשר תאי רלוונטי למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים אנדותליאליים in vitro לביולוגיה של גידולים המופקים מחולים לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשרת חקירה של השפעות דמויות-זיכרון של TEC ותרומתן למיקרו-סביבה של הגידול.
- מקלה על ביצוע מחקרים על מנגנוני עמידות לטיפולים אנטי-אנגיוגניים באמצעות תאים אנושיים ראשוניים.
- תומכת בקידום מותאם-סיכון של טיפולים המכוונים לכלי דם במסלולי פיתוח פרה-קליניים.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת תרביות מאושרות של תאי אנדותל ראשוניים למחקרים מכניסטיים, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי בסרטן המעי הגס והחך הרך.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי תרומה של כלי דם לתהליכי תסבכת גידולים ותגובה לטיפול.
- סריקה: מספק אוכלוסיות תאים בטוהר גבוה ובצורה סטנדרטית לצורך הערכה הדירה של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה כמותית של סממנים אנדותליאליים ותוצרים פונקציונליים למחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro לביולוגיה של גידולים המופקים מחולים לצורך התאמת סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה הדיר לבידוד תאי אנדותל ראשוניים ממקורות רקמה מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות וסקולריות ובמחקרים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד ואפיון של תאי אנדותל ראשוניים עבור תהליכי מו"פ ניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) עבור טיפולים אנטי-אנגיוגניים וטיפולים המכוונים לסביבה המיקרוסקופית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של נכסים המכוונים למערכת כלי הדם בצינורות פיתוח אונקולוגיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרבית ראשונית של תאי אנדותל ובמיון תאים מבוסס FACS.
- נדרשת גישה לדגימות רקמה אנושיות טריות ותיאום עם צוותי כירורגיה ופתולוגיה.
- נדרשת ציוד ייעודי לפירוק רקמות, אנליזת FACS ובדיקות מולקולריות כמותיות.
- התהליך כולל סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי עיבוד רקמות ואפיון תאים.
- מגבלות מעשיות כוללות שבירות של התאים, תזמון של פיצול התאים ופוטנציאל לצמיחת יתר של פיברובלסטים אם התהליך לא מנוהל בקפידה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Surgery, Preparation of Tissue, and Generation of Single Cell Suspension
4:17
FACS Sorting, Harvesting and Characterization of Endothelial Cells
7:17
Results: Isolation of Normal and Tumor Endothelial Cells via FACS Sorting and Study of Endothelial Cell Specific Markers
8:59
Conclusion
