כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

המטרה הכוללת של טכניקה אנליטית זו היא לכמת את התרופה נגד שחפת אתאמבוטול בתוך תאי רקמת נגע ריאתי של שחפת כדי לקבוע אם מגיעים לריכוזי תרופות חיידקיות. שיטה זו יכולה לענות על שאלות בתחום הגילוי והפיתוח של תרופות לשחפת על ידי קביעה אם תרופות הניתנות מגיעות לאוכלוסיות חיידקים בריכוזים מעוקרים בכל תאי רקמת הגרנולומה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות מלא של ריכוזי תרופות בפירוט מרחבי גבוה בתוך מבני רקמה ספציפיים ואוכלוסיות תאים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי חיתוך הרקמה וההרכבה בשל הפוטנציאל לזיהום רקמות והאופי השברירי של שקופיות הממברנה. התחל הליך זה באיסוף רקמות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע חיתוך רקמות, הגדר תחילה את הקריוסטט לטמפרטורת החיתוך הרצויה.

העבירו את ביופסיית הריאה המוקרנת בגמא מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס לקריוסטט, והשאירו למשך 30 דקות כדי לאזן את טמפרטורת הרקמה. בעזרת פינצטה, קבע את הביופסיה לצ'אק הקריוסטט באמצעות כמות קטנה של דבק טמפרטורת חיתוך אופטימלי כדי להדביק את בסיס הרקמה לצ'אק. כוון את הרקמה כך שהמשטח השטוח יהיה המשטח החשוף לחיתוך.

ודא שה-OCT אינו מזהם את פני הרקמה, מכיוון שהדבר עלול להפריע לניתוח ספקטרומטריית המסה שלאחר מכן. חותכים שלושה קטעי רקמה בעובי 25 מיקרון, ומרכיבים על שקופיות קרום PET. גע בעדינות בקרום לחלק הרקמה, והסר את הקטע.

אם מופעל לחץ רב מדי, הקרום הדק עלול להיקרע. הימנע מטיפול מוגזם במגלשה לפני ההרכבה כדי לא לטעון את קרום ה-PET ולהפחית את ההידבקות של קטע הרקמה. שמור את שקופית הממברנה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הרכבה הפשרה והדבקה מוצלחת של הרקמה לממברנה.

הסר את המגלשה מהקריוסטט, ואפשר למגלשה להתייבש באוויר למשך שלוש דקות. אם LCM-LC-MS/MS לא יבוצע באופן מיידי, אטום את המגלשה בשקית קטנה אטומה לאטום והעביר לאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיידרש לדיסקציה. חותכים קטע סמוך בעובי של 10 עד 12 מיקרון, ומפשירים על מגלשת זכוכית רגילה לצביעה של המטוקסילין ואאוזין.

ניתן לחתוך חלקים נוספים בשלב זה עבור כתמים היסטוכימיים רצויים אחרים. הסר את השקית האטומה המכילה את השקופית מהאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס, והניח להגיע לטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. אם המגלשה הקרה נחשפת מיד לאטמוספירת המעבדה, הרקמה תתכסה בעיבוי והשלמות המרחבית של התרופה עלולה להיפגע.

הפעל את המיקרוסקופ והלייזר. הלייזר דורש חמש עד 10 דקות להתחמם לפני שניתן להתחיל בחיתוך. טען צינורות PCR שטוחים של 0.20 מיליליטר לתוך המחזיק.

לאחר הוצאת השקופית מהשקית, צלם תמונה אופטית של קטע הרקמה במגלשת ה-PET באמצעות סורק שטוח. הנח את השקופית לתוך מחזיק השקופיות, צד הרקמה פונה כלפי מטה. הקצה צינורות איסוף נפרדים לאזורי עניין ספציפיים של גרנולומה באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.

בדרך כלל, אלה יהיו ריאות לא מעורבות, גרנולומה תאית וקזאום, אך עשויים להשתנות בהתאם לפתולוגיה הספציפית של ביופסיית הגרנולומה. התמקדו ברקמה באמצעות מטרת המיקרוסקופ 5X. הגדלה זו אמורה לספק סקירה טובה של הרקמה המכילה אזורי גרנולומה תאיים ונמקיים כאחד.

בתוכנה, בחר את הצינור המיועד לקזאום כדי להזיז אותו למקומו מתחת לרקמה. הזן את פרמטרי החיתוך הרצויים. הגדרות אופייניות לקטע ריאה בעובי 25 מיקרון הן עוצמת לייזר 30, מהירות 15 וצמצם 35.

עם זאת, אלה ישתנו בהתאם למיקרוסקופ בו נעשה שימוש ולירידה פוטנציאלית בעוצמה עקב גיל הלייזר. בחרו בכלי 'ציור חופשי', ובעזרת עכבר או עט מגע, שרטטו את האזור הרצוי לחיתוך. שטח הפנים של האזור יוצג בתוכנה.

שמור על אזורים נבחרים מתחת ל-500,000 מיקרון רבוע כדי להקל על חיתוך קל יותר. חזור על הדיסקציה עד שנאספו בסך הכל שלושה מיליון מיקרון רבוע במכסה הצינור. לעיתים, האזור המנותח עשוי להישאר דבוק לקרום שמסביב ולא ליפול למכסה האיסוף.

הסר אזורים אלה מסך שטח הפנים המצטבר על ידי בחירה והסרה ידנית בתוך התוכנה. לאחר מכן, בחר את המכסה לנגע תאי, ואסוף שלושה מיליון מיקרון רבוע של רקמה באותו תהליך. בחר את המכסה לריאה לא מעורבת, ואסוף שלושה מיליון מיקרון רבוע של רקמה באותו תהליך.

שימו לב שרקמת ריאה לא מעורבת מכילה סימפונות וחללים מכתשית רבים. שימו לב היטב כדי לא לכלול אותם מאזורי הרקמה המוגדרים לדיסקציה. הסר את מחזיק המכסה, ושחרר בזהירות, אטום ותייג כל צינור.

הגן על הרקמות המנותחות מפני הפרעות אוויר מסביב. יש לנתח את הרקמות המנותחות באופן מיידי, או לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס ולהפשיר לפני העיבוד וניתוח LC/MS. בהנחה של צפיפות רקמה של גרם אחד למיליליטר, הכינו את מלאי ההומוגנאט על ידי שקילת 50 מיליגרם של רקמת בקרה והוספת מאגר PBS לדילול.

הומוגניזציה של הרקמה על ידי הכאת רקמת הריאה וחוצץ PBS למשך חמש דקות ב-1750 סל"ד על הומוגנייזר חרוזים. לאחר מכן, יש לדלל מיליגרם אחד למיליליטר מלאי תרופות באצטוניטריל/מים אחד לאחד כדי ליצור פתרונות זינוק עקומה סטנדרטיים. קבע ריכוזים סטנדרטיים של זינוק על סמך נפח הספייק ונפח רקמת היעד.

הדוגמה המומחשת היא לתקן של 100 ננוגרם למיליליטר באמצעות נפח ספייק של 10 מיקרוליטר. הסר את הצינורות המכילים את הרקמה המיקרו-מנותחת מאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס, ואפשר להגיע לטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת אצטוניטריל/מים אחד לאחד ושני מיקרוליטר של מאגר PBS לצינורות המכילים את הרקמה המנותחת.

עבור צינורות עקומה סטנדרטיים ובקרת איכות, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת זינוק לשני מיקרוליטרים של הומוגנט ריאות בקרה. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי לכל צינור. מערבולת כל צינור למשך חמש דקות.

לאחר מכן, סוניקציה שלהם למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב-5,000 סל"ד למשך חמש דקות ליצירת כדור של סרט ורקמה בכל צינור. לאחר הצנטריפוגה, העבירו 50 מיקרוליטר של סופרנטנט לצלחת באר עמוקה של 96 בארות ודללו ב-50 מיקרוליטר נוספים של מים נטולי יונים בכל באר.

לבסוף, בצע ניתוח LC-MS/MS ואימות שיטה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שיטת LCM-LC/MS אומתה לראשונה על ידי ניתוח אזורים מיקרו-מנותחים בלייזר מרקמה הומוגנית של אתאמבוטול. כפי שמוצג כאן, השיטה הייתה ניתנת לשחזור והדגימה התאוששות מצוינת מתרופות.

ריכוזי אתאמבוטול שנמדדו על ידי LCM-LC/MS ברקמות ריאה מרובות אומתו עוד יותר על ידי השוואה ישירה לריכוזים שנקבעו על ידי גישת LC/MS מבוססת. ריכוזים שווים זוהו בשתי הטכניקות. ריכוזי אתמבוטול מוחלטים בתוך פרנכימת ריאות לא מעורבת, שפת נגע תאי וקזאום נמק נקבעו על ידי LCM-LC/MS.

רמות העיקור של מיקובקטריום טוברקולוזיס הושגו בכל תאי הנגע. מצוינים הריכוזים המינימליים הנדרשים כדי להרוג 99% מהבצילים המשכפלים החוץ-תאיים ו-99% מהבצילים התוך-תאיים במקרופאגים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח רקמות ולכמת את רמות התרופה בתוך מבני גרנולומה ריאתיים מוגדרים.

טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום מחקר התרופות האנטי-מיקרוביאליות להעריך באופן מדויק וכמותי אם תרופות שניתנו מגיעות לאוכלוסיות פתוגנים בריכוזים מעוקרים. לגישה זו יש ישימות רחבה על רקמות ומצבי מחלה רבים ושונים.