Name: כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למד כיצד לכמת את התפלגות התרופה אתמבוטול ברקמות שחפת הריאה באמצעות לייזר ללכידת מיקרודיסקציה וניתוח LC/MS. שיטה זו מאפשרת למדוד ריכוזי תרופות ברזולוציה מרחבית גבוהה בתוך מבני רקמה ספציפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים פול אובריאן, מינה Marizel, איזבלה פרידמן לניסויים בבעלי חיים, Jacquie גונזלס, ויינר דניאל מ- NIH/NIAID לעזרה עם גמא הקרנה של רקמות ארנב לפני לייזר לכידת microdissection ו Jansy Sarathy עבור כתב יד מחשבות ועצות. עבודה זו נתמכה על ידי מימון הצעת החוק ולהעניק ומלינדה גייטס (OPP1174780) ומכשור NIH משותפים 1S10OD018072. אנו מודים Eliseo א Eugenin על מתן גישה המיקרוסקופ לייקה LMD 6500 ושיתוף מומחיות וייעוץ. הרכישה, ותמיכה מתמשכת של, 6500 LMD מומן על ידי מענק של לאומי המכון לבריאות הנפש, MH096625, המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, שבץ מוחי, NS105584, PHRI מימון (E.A.E) GSK תרומות (E.A.E).

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל בוצעו על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים באישור בעלי חיים מוסדיים אכפת והוועדה שימוש של NIAID (NIH), בבתסדה, מרילנד
1. הניסויים ואוסף רקמות
סעיף זה של הפרוטוקול מתאר נהלים בעלי חיים וגבייה מדגם בתנאים אבטחה ברמה 3 (BSL3). הפרוטוקולים מפורט של שחפת Mycobacterium תרסיס זיהום הליך התרופות, המינהל היה הפרוטוקולים ארנבים שתוארה לעיל11,12.
<ol><li>להדביק ארנבים ניו זילנד הלבן (זכר ונקבה -בת 4-5 חודשים) עם מ. שחפת HN878 באמצעות מערכת תרסיס האף בלבד, כפי שצוין בעבר תיאר11.</li>
	<li>לנהל את הסמים שבחרת (Ethambutol בדוגמה המובאת כאן) דרך המסלול המועדף, המתת חסד החיות של 2, 6 ו- 24 שעות לאחר ניהול. ראשית, עזים ומתנגד הארנב בזריקה תוך שרירית של קטמין 35 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים-5 מ"ג/ק"ג. לחכות 10 דקות ואשר ההרדמה המתאים על-ידי צובט את הזנב ונגיעה בעדינות את העין. אם אין תגובה, המתת חסד על ידי עירוי לוריד של פנטוברביטל, פניטואין (ראה טבלה של חומרים) ב 1 מ"ל/4.5 ק"ג ב 2 מ ל תמיסת מלח סטרילית. הערה: אלה timepoints אופטימלית לחפות את הפרופיל פרמוקוקינטיים Ethambutol, מחייבים התאמת/אופטימיזציה עבור תרופות מחקר אחרות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מספריים, ו/או אזמל, להסיר את הריאות בחלל החזה, נכרות ביופסיות הריאה המכיל גדול גרנולומות נמק נעוץ סביב רקמת הריאה מעורב (כמתואר קודם לכן3). נמק גרנולומות מופיעות בז, צבע, בדרך כלל בולטות מעט מן הריאות שצבעו אדום/ורוד שמסביב. כדי להקל על cryosectioning קל, ודא ביופסיות יותר מ- 2 x 1.5 x 1.5 ס מ.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מקם את הביופסיה על גבי מגש cryomold שכותרתו מראש עם משטח החיתוך הרצוי במגע ישיר עם הבסיס של המגש. לאחר הקפאה, פעולה זו תספק משטח שטוח שממנו יהיה לחתוך cryosections.</li>
	<li>להקפיא את הביופסיה ב אדי חנקן נוזלי. למלא את מיכל קלקר עד לעומק של 2 ס מ עם חנקן נוזלי ומניחים מתלה צינור מתכת. המתלה צריכים לבלוט מעל פני השטח של החנקן הנוזלי מתן משטח שטוח שעליו ממוקמים המגשים רקמות. מקם את המכסה על המכולה קלקר ולהשאיר רקמות ל-10 דקות להקפיא באופן מלא.</li>
	<li>להסיר את המגשים רקמות, במהירות לעטוף בסרט אלומיניום, למקם באופן אינדיבידואלי עם התווית שקיות פלסטיק לסגירה חוזרת וחותמת. להעביר ל-80 מעלות צלזיוס מקפיא לאחסון. הערה: השלבים 1.1-1.6 מבוצעות בתנאים BSL3 (כולל כל העבודה בעלי חיים וטיפול של האיברים הנגועים). גמא שקסמה מקרין והביופסיות ריאות ב- 3 Megarads כדי לאפשר טיפול מחוץ BSL3 הבלימה. ניתן לבצע לייזר microdissection לכידת על רקמות הפטריה בתוך BLS3 המתקן אם תאושר פרוטוקול הבטיחות נמצאים במקום. עם זאת, השארית של פרוטוקול זה מתאר עיבוד במורד הזרם במתקן BSL-2.</li>
</ol>2. רקמת חלוקתה
<ol><li>הגדר את cryostat הטמפרטורה הרצויה חיתוך. להעביר את הביופסיה ריאות מוקרן-גמא-80 ° C אחסון cryostat ולהשאיר למשך 30 דקות equilibrate הטמפרטורה ברקמות. הערה:-20 ל-22 ° C הוא אופטימלי ביופסיות הנגע טרה-בתים.</li>
	<li>באמצעות פינצטה, לתקן את הביופסיה לצ'אק cryostat באמצעות כמות קטנה של דבק טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) לדבוק הבסיס של רקמות הצ'אק. אוריינט הרקמה כך משטח שטוח (זה היה בקשר עם בסיס cryomold) הוא השטח החשוף לחיתוך. ודא ש-OCT לא לזהם את השטח רקמות, כמו זה עלולים להפריע הניתוח ספקטרומטר מסה עוקבות.</li>
	<li>חותכים לשלושה חלקים רקמות-עובי 25 מיקרומטר והר אל מחמד ממברנה שקופיות. בעדינות לגעת הקרום בסעיף רקמות והסר. אם מוחל מדי לחץ, קרום דק לגזרים.<ol>
<li>הימנע טיפול מופרז של השקופיות לפני הרכבה כפי התוצאה תהיה קרום חיית המחמד להיות טעון ועניים הידבקות של הסעיפים רקמות. ודא כי השקופית הממברנה נשמרת בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר אדהזיה ההפשרה-הרכבה ומוצלח של הרקמה למוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את השקופית cryostat, מאפשרים מילה נהדרת. במשך 3 דקות. אם הפונקציה LCM-LC/MS/MS לא תתבצע באופן מיידי, חותם את השקופית בתיק קטן אטום sealable, העברת אחסון-80 ° C עד נדרש ניתוח.</li>
	<li>לגזור מקטע הסמוך ב 10-12 מיקרומטר, הפשרה-mount על משטח זכוכית רגילה עבור Hematoxylin ואאוזין (H &amp; E) צביעת והפניה. סעיפים נוספים ניתן לחתוך בשלב זה עבור אחרים כתמים להסטולוגיה הרצוי (כגון צביעה-Niellsen להמחשת שחפת Mycobacterium (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>להסיר את שקית אטומה המכילה את השקופית מ-80 מעלות צלזיוס אחסון ומאפשרים להגיע בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הערה: אם השקופית קר חשוף מיד לאווירה מעבדה, הרקמה להפוך מצופה עיבוי, עלולה לסכן את שלמות המרחבי של התרופה.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ ואת לייזר (לייזר דורש 5-10 דקות להתחמם לפני חיתוך יכול להתחיל). לטעון mL 0.20 כובע שטוח המבחנות לתוך למחזיק.</li>
	<li>הסר שקופיות מתוך התיק ולקחת תמונה אופטי של סעיף הרקמה בשקופית מחמד באמצעות סורק משטח אופקי.</li>
	<li>מקם את השקופית לתוך מחזיק שקופיות (רקמות פונה כלפי מטה) והקצה אוסף נפרד צינורות לאזורים ספציפיים גרנולומה עניין שימוש בתוכנה מיקרוסקופ. בדרך כלל, אלה יהיו 'ריאות מעורב,' 'הסלולר גרנולומה,' ו- 'caseum' (נמק במרכז), אבל עשוי להשתנות בהתאם פתולוגיה ספציפית של גרנולומה/הביופסיה.</li>
	<li>מתמקדים הרקמה באמצעות 5 X מיקרוסקופ אובייקטיבי. ההגדלה זה צריך לספק תמונה כללית של הרקמה המכילה בשני התחומים גרנולומה הסלולר, נמק. התוכנה בחר את הצינור המיועד 'caseum' כדי להעבירו למצב תחת הרקמה.</li>
	<li>הזן את הפרמטרים הרצויים לנתיחה. הגדרות אופייניות עבור מקטע ריאות עבה מיקרומטר 25 הם עוצמת הלייזר 30, 15, ומהירות צמצם 35 (שרירותי יחידות). עם זאת, אלו ישתנו בהתאם המיקרוסקופ משמש ופוטנציאל פוחתת כוח בגלל גילו של הלייזר.</li>
	<li>בחרו בכלי 'חינם-draw' ו, באמצעות עט או עכבר או מסך מגע, המתאר את האזור הרצוי לצורך ניתוח. פני השטח של האזור יוצג בתוכנה. לשמור על אזורים שנבחרו תחת 500,000 מיקרומטר2 (0.5 מ מ2) כדי להקל על ניתוח קל יותר. חזור על הקרע עד 3 מיליון מיקרומטר2 (3 מ מ2) שנאסף בסך הכל הצינורית.<ol>
<li>לעיתים, באזור גזור עשוי להשאר תקועים למוח שמסביב (למשל עקב משיכה סטטית), אל תיפול לתוך הכיפה אוסף. להסיר אזורים אלה מצטברים שטח הפנים הכולל על-ידי בחירת והסרה ידנית בתוך התוכנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר את הכובע על 'הנגע הסלולר' ולאסוף 3 מיליון מיקרומטר2 של רקמות שימוש באותו התהליך כמתואר בשלב 3.7.</li>
	<li>בחר את הכובע 'ריאות מעורב' ולאסוף 3 מיליון מיקרומטר2 של רקמות שימוש באותו התהליך כמתואר בשלב 3.7. שימו לב כי רקמת הריאה מעורב מכיל bronchioles רבים ורווחים מכתשי. שים לב כדי לא לכלול את אלה מאזורים רקמות שהוגדרו עבור ניתוח.</li>
	<li>בעל כיפה, בזהירות להיפרם, חותם, שלוף כל שפופרת. להגן על הרקמות גזור סביב אוויר הפרעות (למשל מאנטנת זרימת אוויר התפרצותם דלת הפתיחה). לנתח את רקמות גזור באופן מיידי, או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס, להפשיר לפני עיבוד וניתוח איכות המזון.</li>
</ol>4. הפקת וניתוח איכות המזון
<ol><li>הכנת מיצוי פתרון של acetonitrile 1:1 / Ethambutol d-10 תקן פנימי המכיל מתנול. בעת בחירת תקן פנימי, שימוש טופס שכותרתו יציב של התרופה analyte (כגון התווית על-ידי דאוטריום EMB המשמש ההדגמה) עם shift המוני מספיק כדי להימנע איזוטופ לחצות לדבר בין סמים analyte תקן (בדרך כלל מינימום של 4 daltons) . הערה: יצירת תקנים ב- homogenate של כל אחד מסוגי רקמות בהתאמה קשה כי יש שליטה מוגבלת מאוד רקמות עם אשר כדי ליצור סטנדרטים homogenate. בתור חלופה להפיכת תקנים מתוך מדגם homogenate מחודדים, תקן יכולים להיווצר על-ידי הוספת רקמות ריק מבחן מתחם יחד, לחילוץ. נפח של רקמות שליטה homogenate שמתאים האחסון היעד מהסעיפים המחקר דגימת רקמה משולבת ישירות עם כמות של הבדיקה מתחם זה יהיה נוכח ריכוז נתון.</li>
	<li>לחשב האחסון רקמות יישוב מבוסס על פני השטח ואת עובי של סעיף הרקמה ולקבוע את גורם הכרחי דילול homogenate שימוש באמצעי האחסון של homogenate אשר יתווספו תקן ו- QC דגימות. חישובים מומחשים מתחת לאזור היעד גזור2 (3 מ מ2) 3 מיליון מיקרומטר עם מיקרומטר עובי 25, 2 µL נפח של homogenate. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>בהנחה צפיפות רקמה של 1 g/mL, להכין את המניה homogenate על-ידי במשקל של 50 מ"ג של רקמות שליטה והוספת PBS מאגר לדלל (באמצעות הגורם דילול 26.67 homogenate שחושבו בצעד 4.2, diluent זה 1.283 מ"ל). Homogenize על ידי להכות רקמת הריאה ומאגר PBS במשך 5 דקות ב- 1750 סל"ד על מהמגן חרוז חרוז. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>למהול 1 מ"ג/מ"ל ריכוז התרופה מניות ב- 1:1 acetonitrile/מים כדי ליצור עיקול רגיל עולה פתרונות. לקבוע עולה ריכוז רגיל המבוסס על ספייק ונפח האחסון רקמת המטרה. הדוגמה מאויר מיועדת 100 ננוגרם למ"ל רגיל באמצעות אמצעי אחסון ספייק µL 10. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>להסיר את הצינורות המכילים הרקמות microdissected מ-80 מעלות צלזיוס אחסון ומאפשרים להגיע בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של פתרון 1:1 acetonitrile/מים ו- 2 µL PBS מאגר הצינורות המכיל רקמות microdissected.</li>
	<li>עיקול רגיל וצינורות בקרת איכות, להוסיף 10 µL של עולה פתרון 2 µL של שליטה ריאות homogenate.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של פתרון מיצוי כל שפופרת.</li>
	<li>מערבולת כל שפופרת למשך 5 דקות, sonicate במשך 5 דקות, צנטריפוגה-5000 סל ד למשך 5 דקות כדי ליצור גלולה של הסרט ורקמות בתוך כל שפופרת.</li>
	<li>להעביר 50 µL של תגובת שיקוע צלחת עמוקה 96-טוב-טוב, לדלל עם µL 50 נוספים מים יונים מכל קידוח.</li>
	<li>לבצע ניתוח LC/MS/MS באמצעות כלי אופטימיזציה פרמטרים עבור Ethambutol ו- Ethambutol-d10 תקן פנימי (כאמור שמתואר פרט12).</li>
	<li>השתמש גורם לדילול כדי לתקן את הסכום המדויק של רקמות גזור עבור כל דגימה. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. שיטת אימות
<ol><li>ליצור homogenate של רקמת הריאה שליטה על-ידי שילוב ריאות חלק 1, PBS חלקים 2 ו- 3-4 חרוזים פלדה. לנצח את רקמת הריאה ומאגר PBS למשך 5 דקות ב- 1750 סל"ד באמצעות מהמגן חרוז.</li>
	<li>ספייק homogenate על-ידי הוספת 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל Ethambutol דימתיל סולפוקסיד מניות לתוך 990 homogenate µL כדי ליצור ריכוז סופי של 10,000 ng/mL (10 mg/mL) ו מערבולת במשך דקה אחת.</li>
	<li>יצירת בלוק קפוא homogenate על-ידי לשפוך את homogenate לתוך cryomold במהירות קפוא בקרח יבש למשך 5 דקות.</li>
	<li>להכין 25 סעיפים עבה מיקרומטר מהגוש homogenate כמתואר בצעדים 2.1-2.5.</li>
	<li>לנתח אזור הרקמה היעד כמפורט בשלבים 3.2-3.10.</li>
	<li>להוסיף 10 µL 1:1 acetonitrile/מים ו- 2 µL PBS מאגר הצינורות המכיל רקמות microdissected.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של פתרון מיצוי כל שפופרת. בצע שלבים 4.9-4.12 כדי ליצור עיקול רגיל ולקבוע את ריכוז התרופה בבלוק homogenate רקמות.</li>
	<li>לחשב יעילות חילוץ באמצעות הנוסחה שלהלן: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
<li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+%28DESI%29+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li>
<li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li>
<li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li>
<li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+laser+capture+microdissection%2C+and+LC-MS%2FMS+of+the+same+tissue+section%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li>
<li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics%3A+methodologies+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li>
<li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+A+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016(2011).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li>
<li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li>
<li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

נפתרה במרחב כימות של סמים בתוך נגעים שחפת הריאה נדרשת כדי לקבוע אם התרופה חשיפה מגיע ריכוזים לחיטוי על אוכלוסיות חיידקים השוכנים התאים הנגע שונים. השיטה LCM-LC/MS המתוארות כאן מאפשר כימות מוחלטת של תכשירים נגד שחפת בתוך הנגע התאים, כולל את caseum חיידקים-עשיר, שימוש רק 1-3 מקטעי רקמת בסך הכל. רקמה מסורתית המגון וגישות LC/MS על כימות סמים בתוך הרקמה לעיתים קרובות חסר יחודיות המרחבי לפתרון תאים ספציפיים הנגע, גם כאשר זה אפשרי, ויש פוטנציאל משמעותי צלב לזהם סלולריים ו נמקי אזורים במהלך תהליך הוצאה ידנית.
<p class="jove_...

היכולת לזהות ולכמת רמות התרופה במרחב היא דרישה חיונית לקביעת אם תרופות נגד שחפת להגיע subpopulations חיידקי בתוך נגעים ריאתי-לחיטוי ריכוזים1. חשיבות מיוחדת הוא בקביעת סמים חדירה לתוך הליבה נמק של הנגע (שנקרא caseum), אשר בדרך כלל מכילה את המספר הגבוה ביותר של החיידקים, וייתכן שהוא לקוי נגיש לסמים עקב העדר vascularization.
שיטות מסורתיות כדי להעריך את הנגע חדירה, שכרוכים המגון הנגעים ריאתי נכרת ואחריו החילוץ הממס וניתוח ספקטרומטר מסה (LC/MS) כרומטוגרפיה נוזלית, הם מאוד רגישים, סלקטיבי עבור הסמים של ריבית. עם זאת, שיטות אלה מציעים מידע מרחבי המסכן, מוגבל לגודל של הרקמה homogenized המקורי. מסה ספקטרומטר הדמיה גישות, כגון לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון (MALDI)2,3, desorption ספקטרומטריית electrospray יינון (דסי)4 או חילוץ שטח משופרת נוזל5, 6 מציעים יכולות הדמיה מאוד במרחב-נפתרה, אבל כימות ישיר יכול להיות מאתגר מאוד או בלתי אפשרי בשל היעילות חילוץ שונות של analyte מהתא שונים ואפקטים של דיכוי יון הטרוגניות או רקמות סוגי7. בנוסף, גישות הדמיה הישירה ביותר של רקמות MS הם מטבעם פחות רגישים יותר LC/MS עקב חוסר ההפרדה כרומטוגרפי של אנדוגני מינים מתחרים על יינון ואת היעילות החילוץ הממס נמוכה יותר של הסם מרקמות.
לייזר לכידת microdissection (LCM) בשילוב עם ניתוח LC/MS יש כבר מיושם באופן שגרתי כדי לבודד לאפיין אזורים רקמה נפרדות עבור פרוטיאומיה מבנית מחקרים8,9 , לאחרונה מנוצל על כימות סמים ב עצומות ברקמות בעלי חיים10. כאן אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת החלת LCM בשילוב עם ניתוח LC/MS (LCM-LC/MS) לכמת תכשירים נגד שחפת בתוך תאים נפרדים גרנולומה. בתהליך microdissection לכידת לייזר, לייזר UV הוא מרוכז באמצעות המטרה מיקרוסקופ לתוך מקטע רקמות, אשר חותך ומבודד אזור הרקמה הרצויה על-ידי ביצוע נתיב המוגדר על-ידי המשתמש. עבור בסיוע הכובד LCM (בטכניקה השתמשו לצורך מחקר זה), סעיף הרקמה הוא רכוב לשקופית קרום דק פולימרי (PET או עט), הרקמה נלכד בתוך הצינורית אוסף מוצב מתחת לשקופית. הסמים מופקים מכל רקמת נכרת, לכמת באמצעות גישות LC/MS סטנדרטי. כמות רקמת נדרש להיות שנאספו נקבעת בסופו של דבר את ריכוז התרופה נוכח הרקמה הצפוי, הרגישות של שיטת ביופידבק. עבור רוב ניתוחים של סמים עצומות ברמות טיפולית וניתח באמצעות ספקטרומטר מסה פאול טריפל שגרתית, 3 מיליון מיקרומטר2 (3 מ מ2) של רקמת שטח מספיקה.
פרוטוקול זה מתאר שילוב רב עוצמה של פרופיל המרחבי, כימות מלא מוצעים על ידי אופנת LCM-LC/MS, מתן סמים מוחלטת ריכוזים בתוך התאים של גרנולומות טרה-בתים. ניתן להחיל את הטכניקה גם לקביעת ריכוזי התרופה ברקמות רבות חולה אחר מתן מידע חיוני סמים בגילוי ופיתוח.

<table><tbody><tr><td>ניו זילנד ארנבים לבנים</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (קטמין) 100 מ"ג/מ"ל C3N</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (קסילזין) 100 מ"ג/מ"ל</td><td>Henry Schein בריאות בעלי חיים</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Euthasol (נתרן פנטוברביטל ופניטואין נתרן)</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל (דרגת LC-MS)</td><td>פישר</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>מתנול (דרגת LC-MS)</td><td>פישר</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית (דרגת LC-MS)</td><td>פישר</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>מים (דרגת LC-MS)</td><td>פישר</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינורות PCR שטוחים עם מכסה</td><td>שטוח קורנינג</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>מסגרות פלדה, קרום PET</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ חלביות פרימיום</td><td>פישר</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת באר עמוקה 2.0 מ"ל PP RB</td><td>עמודת פישר</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 (4.6 על 50 מ"מ; גודל חלקיקים, 3.5 &mu; m)</td> <td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>"רוכסן" חותם שקיות לדוגמא</td><td>פישר</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 קריוסטט</td><td>Leica</td><td>הופסק</td><td>Leica CM1860 הוא הדגם הנוכחי</td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-דיסקציה בלייזר 6500</td><td>Leica</td><td>הופסק</td><td>Leica LMD 6 הוא הדגם הנוכחי</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP ספקטרומטר מסה</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (lcm-lc/ms)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

השחפת היא עדיין גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. שיפורים משטרי סמים הקיים ופיתוח של הריפוי דרושים בדחיפות. היכולת של תרופות במינון טרה-בתים כדי להגיע, לעקר את החיידקים בתוך גרוע vascularized נמק מחוזות (caseum) גרנולומות ריאתי חיונית התערבות טיפולית מוצלחת. משטרי טיפולית יעילה ולכן חייב להכיל תרופות עם סגולות חדירה caseum חיובית. השיטות הקיימות LC/MS עבור לכימות רמות התרופה ברקמות ביולוגיות מוגבלת ליכולות הרזולוציה המרחבית, ולכן קשה לקבוע במדויק ריכוז סמים מוחלטת בתוך תאי רקמת קטן כמו אלה שנמצאו בתוך גרנולומות נמק. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב לייזר לכידת microdissection (LCM) של רקמות באופן פתולוגי, נבדל אזורים עם ביופידבק כמת. טכניקה זו מספקת כימות מוחלטת של סמים בתוך caseum גרנולומה, סביב הנגע הסלולר ואת רקמת הריאה מעורב, לכן, באופן מדויק קובע אם ריכוזים אחרים להיות מושגת. בנוסף המחקר שחפת, הטכניקה יש יישומים פוטנציאליים רבים על כימות נפתרה במרחב של סמים לרקמות החולות.

סקירה כללית של הגישה LCM-LC/MS מוצג באיור1. לאחר לחיטוי הרקמה על ידי גמא-הקרנה, כל השלבים הבאים (מתוך רקמת חלוקתה ואילך) מתקיימים מחוץ BSL3 תנאים. איור 2 מציג הנגע מקטעים ביופסיה לפני ואחרי רקמות בידוד על ידי אופנת LCM. אזורי נמק הסלולר של נגעים טרה-בתים יכול להיות בקלות לזהות, מבודדים על ידי בדיקה חזותית של התמונות אופטי לבד (ללא הדרישה כדי להפנות לסעיפים שהוכתמו בהיסטולוגיה רקמות סמוכים). דיסקציה יוצר חתך נקי עם הפרעה מינימלית ...

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות לייזר לכידת microdissection בשילוב עם ניתוח LC/MS במרחב-לכמת הפצות סמים בתוך גרנולומות שחפת הריאה. הגישה יש ישימות רחבה כדי לכימות ריכוז סמים בתוך רקמות-פירוט מרחבית גבוהה.

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

המטרה הכוללת של טכניקה אנליטית זו היא לכמת את התרופה נגד שחפת אתאמבוטול בתוך תאי רקמת נגע ריאתי של שחפת כדי לקבוע אם מגיעים לריכוזי תרופות חיידקיות. שיטה זו יכולה לענות על שאלות בתחום הגילוי והפיתוח של תרופות לשחפת על ידי קביעה אם תרופות הניתנות מגיעות לאוכלוסיות חיידקים בריכוזים מעוקרים בכל תאי רקמת הגרנולומה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות מלא של ריכוזי תרופות בפירוט מרחבי גבוה בתוך מבני רקמה ספציפיים ואוכלוסיות תאים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי חיתוך הרקמה וההרכבה בשל הפוטנציאל לזיהום רקמות והאופי השברירי של שקופיות הממברנה. התחל הליך זה באיסוף רקמות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע חיתוך רקמות, הגדר תחילה את הקריוסטט לטמפרטורת החיתוך הרצויה.העבירו את ביופסיית הריאה המוקרנת בגמא מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס לקריוסטט, והשאירו למשך 30 דקות כדי לאזן את טמפרטורת הרקמה. בעזרת פינצטה, קבע את הביופסיה לצ'אק הקריוסטט באמצעות כמות קטנה של דבק טמפרטורת חיתוך אופטימלי כדי להדביק את בסיס הרקמה לצ'אק. כוון את הרקמה כך שהמשטח השטוח יהיה המשטח החשוף לחיתוך.ודא שה-OCT אינו מזהם את פני הרקמה, מכיוון שהדבר עלול להפריע לניתוח ספקטרומטריית המסה שלאחר מכן. חותכים שלושה קטעי רקמה בעובי 25 מיקרון, ומרכיבים על שקופיות קרום PET. גע בעדינות בקרום לחלק הר

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא מקור של לחץ אטמוספרי יון עבור ספקטרומטריית מסה. במצב הדמיה, אמצע אינפרא אדום בדיקות הלייזר הפצות של מולקולות על פני קטע רקמה או biofilm. טכניקה זו מציגה גישה חדשה ללימודי bioanalytical מגוונים שבוצעו תחת תנאים ניסויים הילידים.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר מבוצעת על איבר דק ורקמת גידול זוהתה בהצלחה אלמנטים טבעיים וגדוליניום המוזרק באופן מלאכותי (ה '), שהונפקו מחלקיקים המבוססים על ה'. תמונות של יסודות כימיים הגיעו לרזולוציה של 100 מיקרומטר ורגישות תת מ"מ כמותית. התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק מספר רב של תמונות מאותה רקמה ביולוגית.

ספקטרוסקופיה התפלגות מושרה לייזר: גישה חדשה למיפוי של Nanoparticle וכימות ברקמות איברים

Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנולומות חפת Mycobacterium.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

זיהום בשחפת אנושית הוא תהליך מורכב, שקשה למדל במבחנה. כאן אנו מתארים מודל חדש של רקמת ריאה אנושית תלת מימדית המסכם את הדינמיקה המתרחשת במהלך זיהום, כולל נדידת תאי חיסון והיווצרות גרנולומה מוקדמת בסביבה פיזיולוגית.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה ​​קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum.

An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

פרוטוקול זה מציג את פלטפורמת משולבת ראמאן ספקטרוסקופית (MS) של המסה המסוגלת להשיג רזולוציה של תא בודד. ספקטרוסקופית ראמאן ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובה תאית לסמים, בעוד MS יכול לשמש ניתוח ממוקד וכמותי של ספיגת התרופה ואת חילוף החומרים.

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

שיטות נוכחיות של ניתוח הדבקות של המטופלים בטיפול תרופתי מורכב-שחפת (DR-TB) משטרי יכול להיות לא מדויק ואינטנסיבי משאבים. השיטה שלנו מנתחת שיער, מטריצה בקלות שנאסף ומאוחסן, עבור ריכוזי של 11 תרופות DR-TB. באמצעות LC-MS/MS, אנחנו יכולים לקבוע את רמות התרופות תת-ננוגרמה שניתן לנצל כדי להבין טוב יותר את הדבקות בסמים.

מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

פרוטוקול מוצג כדי לחלץ את התוכן השומנים הכולל של דופן התא של מגוון רחב של mycobacteria. יתר על כן, מיצוי ופרוטוקולים אנליטיים של סוגים שונים של חומצות מיקוליות מוצגים. פרוטוקול כרומטוגרפי בשכבה דקה לניטור תרכובות מיקובקטיות אלה מסופק גם כן.

ניתוח הרכב השומנים של מיקובקטריה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים ליצירת מודל תלת-ממדי של הפצת מטבוליטים במהלך זיהום טריפנוסמאטיד, כולל איסוף דגימות, מיצוי מטבוליט, סקירה כללית של רכישת נתוני ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית, יצירת מודל תלת-ממדי, ולבסוף, הדמיית נתונים.

גישות קרטוגרפיה כימית לחקר זיהום טריפנוסומטיד

למד כיצד לכמת את התפלגות התרופה אתמבוטול ברקמות שחפת הריאה באמצעות לייזר ללכידת מיקרודיסקציה וניתוח LC/MS. שיטה זו מאפשרת למדוד ריכוזי תרופות ברזולוציה מרחבית גבוהה בתוך מבני רקמה ספציפיים.

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

גלה סרטונים נוספים