Name: הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: למד שיטה כמותית לבדיקת תיקון חלבון-דנ"א crosslinks בפלסמידים transfected בתאי יונקים באמצעות primer extension ו-qPCR. הטכניקה מאפשרת מדידת קינטיקת תיקון כבר לאחר שעתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (ES023350). ליסה צ'סנר נתמך על ידי מענק הדרכה 5T32HL007741. אנו מודים נטליה Tretyakova (אונ' מינסוטה) Ashis Basu (אוניברסיטת קונטיקט) ואת חבריהן מעבדה עבור תמיכה עצות טכניות במהלך המוקדמות ואת שלבי ביניים של עבודה זו.

1. דור של פלסמיד המכיל DPC
<ol><li>משלבים pmol 80 של oligonucleotide המכילה שאריות של 8-oxoguanine (20 µL) עם 10 יחידות של T4 polynucleotide קינאז (1 µL) במאגר 10 x ליגאז (5 µL). מוסיפים מים כדי להגיע הנפח הכולל של 50 µL, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים מחוממות.<ol>
<li>לשלב את phosphorylated oligonucleotide (50 µL), 80 pmol של דנ א חד גדילי (80 μL), 100 יחידות אנזימים (20 µL) 10 x Taq התגובה מאגר (25 µL), 100 מ מ ATP (20 µL), dNTPs 10 מ מ (20 µL), נב מאגר 2 (25 µL) ו- 8 µg BSA (µL 20) כדי סה כ 260 µL. Incubate מדגם thermocycler להגדיר ב 75 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחריו 37 º C למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף U של T4 60 פולימראז (20 µL), U T4 8,000 ליגאז (20 µL), 100 מ מ ATP (20 µL), dNTPs 10 מ מ (20 µL), נב מאגר 2 (15 µL) ו- 8 µg BSA (µL 20) לסך 375 µL. דגירה התגובה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס (איור 1 א').</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליצור תערובת רווי-מאגר פנול: כלורופורם 50: 50. להוסיף נפחים שווים של כל מרכיב, מיקס, ולסובב ומפרידה שולחני ב 21,130 x g עבור 5 דק כלורופורם כוננים מים מן פנול רווי-מאגר כדי ליצור שתי שכבות: שכבת העליון, מימית, התחתון שכבה אורגני. להוסיף 375 µL של השכבה התחתונה, אורגני התגובה סיומת פריימר, מיקס, ולסובב ומפרידה שולחני ב 21,130 x g במשך 5 דקות. התראה: פנול, כלורופורם חומרים מסוכנים הינם אמצעי זהירות יש לנקוט כדי להימנע ממגע עם העיניים או העור.<ol>
<li>בעקבות צנטריפוגה, בזהירות לחלץ את השכבה העליונה ומערבבים עם אמוניום אצטט נוספו ריכוז סופי של 0.3 M ואחריו 2 כרכים של 100% אתנול. אחסן את הפתרון ב-20 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 30 דקות או לילה.</li>
		<li>ספין המדגם ומפרידה שולחני-15,000 סל ד x ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר ב 1 מ"ל אתנול 70%. ספין המדגם ומפרידה שולחני-15,000 סל ד x ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע resuspend בגדר ב 100 µL של מים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשלב 50 µL של ה-DNA של השלב הקודם עם 16 µL 6 x העמסה ג'ל צבע ומים µL 34, בכפוף אלקטרופורזה על agarose נמוך-להמיס 0.8% ג'ל המכיל µg 0.5/mL אתידיום ברומיד. להפעיל את הג'ל ב V 2/ס על ג'ל ס מ-10 עבור 6-אייץ ' במאגר x TAE 1. לסלק את הלהקה supercoiled באמצעות גילוח שוקלים הפרוסה ג'ל (איור 1 א'). להפעיל פקד חיובי כדי לשמש סמן איפה ה-DNA covalently סגור, supercoiled נודד. התראה: אתידיום ברומיד מוטגן הינם אמצעי זהירות יש לנקוט כדי למנוע מגע עם העור. כמו כן, חשוב למזער את הזמן המדגם פלסמיד החשוף ל- UV על מנת לצמצם את היווצרות UV photoproducts.<ol>
<li>לעכל את הפרוסה ג'ל על-ידי הוספת 10% β-agarase התגובה המאגר עבור כל מ"ג של ג'ל משקל. דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות וקריר ל 42 º C. להוסיף 10 U של β-agarase, דגירה ב 42 ° C עבור 1 h.</li>
		<li>הדגירה הבאים, למדוד את עוצמת הקול, הוספת אמוניום אצטט ריכוז סופי של 0.3 M ותירגע בקרח במשך 15 דקות צנטריפוגה ב g x 15,000 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את תגובת שיקוע והוסף 2 כרכים של אלכוהול איזופרופיל. מקררים למשך הלילה ב-20 ° C.</li>
		<li>Centrifuge ה-DNA מטוהרים, supercoiled 10 דקות ב 15,000 סל ד x ומפרידה שולחני ב 4 ° C, resuspend בגדר ב 40 µL של מים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crosslink 12 pmol (15 µL) של ה-DNA כדי pmol 36 של oxoguanine glycosylase (1 µL) מאגר המכיל 100 מ מ NaCl (3 µL), 1 מ MgCl2 (3 µL), 20 מ מ טריס-HCl pH 7.0 (6 µL) ו- 10 מ"מ נתרן cyanoborohydride (2 µL) כדי להגיע נפח סופי של µL 30-37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות26. הסר µL 1 מדגם תפור, לדלל ב 500 µL של מים כדי לשמש הו נתוני הצבע ולנתח ב- PCR בשלב 3.</li>
</ol>2. אשלגן כלורי/מרחביות משקעים
<ol><li>כדי להמחיש crosslinking יעילות, הגבלת לעכל µg 1 של פלסמיד תפור עם 1 μL BspDI במאגר x 10 ב 37 ° C עבור h 1 כדי ליצור שני שברים שונים בגדלים הדי. הערה: קטע אחד יהיה תפור לחלבון (4.4 kb), והשני יהיה לא (2.8 kB) (איור 1B).<ol>
<li>לחלק את הדגימות לשניים, להוסיף מרחביות לשניהם כדי ריכוז סופי של 0.5%, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		<li>להוסיף אשלגן כלורי (ריכוז סופי 100 מ מ) לאחד הדגימות דגירה על קרח למשך 5 דקות.</li>
		<li>Centrifuge שתי דוגמאות ב g x 12,000 למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהפעיל את supernatants ג'ל agarose כדי להעריך את ההטיה אחוז החלבון ל- DNA12. הערה: אשלגן כלורי/מרחביות משקעים משמש לבקרת איכות, לא הכנת הרקע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תרביות תאים בתרבית של תאים
<ol><li>יום אחד לפני תרביות תאים, צלחת 0.5 x 106 תאים/טוב בצלחת 6-. טוב. למחרת, לערבב µg 1.5 (30 µL) של פלסמיד המכיל DPC (מתוך שלב 1.6) עם 300 µL של סרום ללא תרבות המדיה. צינור אחר, לערבב 12 µL של תרביות תאים ריאגנט µL 300 של סרום ללא תרבות המדיה. לשלב µL 300 של DNA מדולל עם 300 µL של ריאגנט מדולל תרביות תאים, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 250 µL של מתחמי לכל אחד שתי בארות, תקופת דגירה של מינימום של 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בעקבות דגירה, להסיר מדיה, להוסיף 1 מ"ל של 0.6% מרחביות/0.01 M EDTA, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10-15 דקות. לגרד את התאים באמצעות שוטר גומי, להעביר צינור microfuge 1.5 mL. להוסיף 200 µL של ' היפוך ' (הריכוז הסופי של 1 מ'), M NaCl 5 בעדינות 5 פעמים, דגירה-לילה 4 ° C-27.</li>
	<li>Centrifuge את הדגימות ב g 21,130 x ומפרידה שולחני ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לאסוף את התמיסה אתנול supernatant, כמתואר לעיל, resuspend ב 50 µL של מים.</li>
</ol>4. הצהבת-qPCR
<ol><li>מערבבים יחד µL 1 של DNA שנמצאו בכל נקודת זמן (כולל h 0), 2 x SYBR ירוק PCR מיקס מאסטר (30 µL), µL 27 של מים, 1 µL (100 pMol) של פריימר משלימים לחוף נזק של פלסמיד (פריימר R, איור 2). לבצע PCR תוך שימוש בתנאים הבאים: הראשוני להמיס לפני 10 דקות ב 90 מעלות צלזיוס, ואחריו 8 מחזורי: 90 ° C 15 s, 65 ° C, 1 דקות. בסיום מחזור 8 להוסיף 1 µL (100 pMol) של מן המפתח השני לסך µL (פריימר L, איור 2) 6028 (ראה טבלה של חומרים לפרטים ריאגנט).</li>
	<li>לערבב 1 µL של unamplified התאוששה הדנ א כל נקודת זמן (כולל h 0), 2 x מיקס מאסטר (30 µL), µL 27 של מים, 1 µL של כל פריימר (100 pMol) לסך 60 µL.</li>
	<li>לטעון צלחת PCR 96-ובכן עם הדוגמיות מ שלבים 4.1 ו- 4.2 (20 µL/טוב, שהפקידים) ולבצע qPCR עבור 30 מחזורי שימוש בתנאים המתוארים לעיל.</li>
	<li>ממוצע הערכים CT מכל ערכה של דגימות triplicate. חיסור הערכים של CT שנוצר בשלב 4.1 מאלה בשלב 4.2 כדי להשיג את הדלתא של CT ערך עבור כל דגימה. להחסיר את נקודת הזמן הו מהערך דלתא CT כדי להסיר את כל הרקע (ראה תוצאות נציג בחלק לתיאור מפורט).</li>
	<li>להמיר הדלתא CT ערך תיקון אחוז תוך שימוש בנוסחה: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57413/57413eq1v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Protein+Cross-links%3A+Formation%2C+Structural+Identities%2C+and+Biological+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+chemical+research%22%5BJournal%5D)">DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes.</a> Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li>
<li>Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslinks%3A+their+induction%2C+repair%2C+and+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences.</a> Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).</li>
<li>At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Tools+to+Characterize+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Bis-Electrophiles%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Clin+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles.</a> Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).</li>
<li>Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+proteins+cross-linked+to+DNA+by+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation.</a> J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).</li>
<li>Dizdaroglu, M., Gajewski, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+hydroxyl+radical-induced+formation+of+a+DNA-protein+cross-link+involving+thymine+and+lysine+in+nucleohistone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone.</a> Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).</li>
<li>Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+formation+of+DNA-protein+cross-links+by+antitumor+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).</li>
<li>Speit, G., Schutz, P., Merk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+repair+of+formaldehyde-induced+DNA-protein+crosslinks+in+repair-deficient+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines.</a> Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+DNA+from+mammalian+cells+by+alkaline+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution.</a> Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).</li>
<li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+in+mouse+leukemia+L1210+cells+treated+with+nitrogen+mustard%2C+1%2C3-bis%282-chloroethyl%29-1-nitrosourea%2C+and+other+nitrosoureas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas.</a> Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).</li>
<li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+cross-linking+and+DNA+interstrand+cross-linking+by+haloethylnitrosoureas+in+L1210+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells.</a> Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).</li>
<li>Zhitkovich, A., Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+sensitive+assay+to+detect+DNA-protein+crosslinks+in+intact+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo.</a> Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).</li>
<li>Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+ultraviolet+or+ionizing+radiation-induced+DNA-protein+cross-links+in+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol+Relat+Stud+Phys+Chem+Med%22%5BJournal%5D)">Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells.</a> Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).</li>
<li>Merk, O., Reiser, K., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chromate-induced+DNA-protein+crosslinks+with+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay.</a> Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).</li>
<li>Loeber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+DNA-protein+cross-linking+by+antitumor+nitrogen+mustards%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Res+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards.</a> Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).</li>
<li>Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C2%2C3%2C4-Diepoxybutane-induced+DNA-protein+cross-linking+in+human+fibrosarcoma+%28HT1080%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells.</a> J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).</li>
<li>Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Phosphoramide+Mustard+and+Nornitrogen+Mustard+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Res+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells.</a> Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).</li>
<li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+assay+for+DNA-protein+covalent+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), e104(2013).</li>
<li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+isolation%2C+identification+and+quantification+of+DNA-protein+adducts+by+ELISA-based+RADAR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e108(2014).</li>
<li>Stingele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+Regulation+of+DNA-Protein+Crosslink+Repair+by+the+DNA-Dependent+Metalloprotease+SPRTN%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN.</a> Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).</li>
<li>Vaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloprotease+SPRTN%2FDVC1+Orchestrates+Replication-Coupled+DNA-Protein+Crosslink+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair.</a> Mol Cell. 64, 704-719 (2016).</li>
<li>Maskey, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spartan+deficiency+causes+accumulation+of+Topoisomerase+1+cleavage+complexes+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).</li>
<li>Lessel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SPRTN+cause+early+onset+hepatocellular+carcinoma%2C+genomic+instability+and+progeroid+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+eliminates+unique+DNA-protein+cross-links+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells.</a> J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).</li>
<li>Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+mitomycin+C+cross-linked+DNA+in+mammalian+cells+measured+by+a+host+cell+reactivation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay.</a> Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).</li>
<li>Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-assisted+catalysis+in+base-excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair.</a> Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).</li>
<li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+repair+of+DNA+damage+in+cell+lines+and+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells.</a> Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).</li>
<li>Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+reduces+Taq+DNA+polymerase+fidelity+and+PCR+amplification+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency.</a> Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+sequence-specific+DNA-protein+conjugates+via+a+reductive+amination+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy.</a> Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).</li>
<li>George, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+nucleotide+excision+repair+in+a+helicase-deficient+XPD+mutant+from+intragenic+suppression+by+a+trichothiodystrophy+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation.</a> Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).</li>
<li>Minko, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Repair+of+DNA-Polypeptide+Cross-Links+by+the+UvrABC+Nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease.</a> Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).</li>
<li>Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incision+of+DNA-protein+crosslinks+by+UvrABC+nuclease+suggests+a+potential+repair+pathway+involving+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).</li>
<li>Reardon, J. T., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA-polypeptide+crosslinks+by+human+excision+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease.</a> PNAS. 103, 4056-4061 (2006).</li>
<li>Lopez-Mosqueda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPRTN+is+a+mammalian+DNA-binding+metalloprotease+that+resolves+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks.</a> eLife. 5, e21491(2016).</li>
<li>Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-dependent+protease+involved+in+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair.</a> Cell. 158 (2), 327-338 (2014).</li>
<li>Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+DNA-Protein+Crosslink+by+Replication-Coupled+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis.</a> Cell. 159 (2), 346-357 (2014).</li>
<li>Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslink+repair%3A+proteases+as+DNA+repair+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).</li>
<li>Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPotter%2C+H+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה הצהבת-qPCR מציע יתרונות רבים על פני גישות אחרות על-ידי בדיקת התיקון של אוכלוסיה הומוגנית המכיל פצע DPC יחיד, הגדרה. ראוי לציין בנוסף לשליטה זהותו של החלבון ואת הסוג של crosslink כימיים המשמשים להתחברות החלבון ה-DNA, שזה אפשרי לתמרן בקלות את ההקשר רצף שאליו הנגע DPC הוא הציג. בחנו את ההשפעה על תיקון DPC של היכרות עם הנגע בשני התבנית או קידוד לשריד פלסמיד במורד הזרם של לוקוס promotor פעיל. באופן דומה, אנחנו בתהליך של חוקרים את ההשפעה על תיקון DPC של שכפול באמצעות פלסמיד M13 המכיל בדר SV40 של שכפול transfected לתאים HEK293T. וזמינותו המתוארים בזאת ישירות DPC אמצעי תיקון, לעומת שיטות אחרות כגון הפעלה מחדש התא המארח בעקיפין הערכות לתקן פעילות24,25. בנוסף, המערכת היא חזקה, רגיש, כמותית. בניגוד למערכות אחרות, אשר מודדת להסרת DPC, וזמינותו הזה רק מזהה אירועי תיקון מלא, קרי, זה דורש לא רק כי הנגע DPC להסירו אלא כי התקינות של ה-DNA דופלקס להיות מלא שוחזר17. זה בגלל abasic אתרים ו ניקס או מעברי ב עמוד השדרה phosphodiester לחסום וזמינותו בצורה יעילה כמו המקורי DPC הנגע29.
בעוד דוח זה מתמקד מסוג מסוים DPC, אשר נוצר על ידי השמנה borohydride של תגובה אנזימטית ביניים, אנו כעת מפתחים גישות ללמוד תיקון ה-Dpc מעורבים אחרים חלבונים נגעים שבו הצמדה חלבון ה-DNA מתרחשת דרך הבסיס nucleoside, יותר מאשר המיקום ריבוז. שימוש amination חותכות, יצרנו crosslinks חלבון ופפטיד מצורף גואנין או ציטוזין הבסיס של פריימר הדנ א30. Oligonucleotides אלה היו לטהר את ההומוגניות, המשמש ליצירת פלסמידים supercoiled המכיל חלבון-דנ א של ה-DNA-פפטיד crosslinks. בעוד היעילות של תגובות אלו מעט מופחת ביחס לזה של הגישה crosslink glycosylase oxoguanine תיאר בפירוט לעיל, הם אף על פי כן הוכתרו בהצלחה, לאפשר הבחינה של התיקון של סובסטרטים אלה בפראי-סוג וקווים נוקלאוטיד כריתה חשוכת-תיקון בתרבית של תאים. השתמשנו גם וזמינותו הצהבת-qPCR ללמוד התיקון של נגעים oxoguanine ואת המספר של כולסטרול ריבוז סינתטי המשלים, אשר הוצג בעבר לתיקון באמצעות מכונות31תיקון כריתה נוקלאוטיד הסלולר. כמו באיור 2 מתארת בצורה גרפית, תיקון של כל הנגע כי הארכת תחל בלוקים על ידי אנזימים, באופן עקרוני, ניתן למדוד באמצעות וזמינותו הצהבת-qPCR.
המודלים הנוכחיים של תיקון DPC מראים כי קריאות Dpc גדול (> 10 kDa) ותוחלת הפרוטאוליטי עיבוד כדי הנגע פפטיד קטן לפני הסרת32,33,34. אחראי על proteolysis הזה ככל הנראה מועמדים את פרוטאוזום או פרוטאז ספציפיים בתאי אדם בשם ספרטה20,21,35,36,37, 38. חקירות נוסף התפקידים של פרוטאזות אלו יכול להתבצע באמצעות וזמינותו הצהבת-qPCR. מעכבי פרוטאוזום יכול לשמש pretreat תאים לפני תרביות תאים עם המכילות DPC סובסטרטים. לחלופין, שורות תאים תמונות ציפורים ספרטני יכול להיות transfected עם פלסמידים פגום התירי את תפקידה proteolysis קריאות ה-Dpc גדול יותר.
ללא קשר השיטה שבה נעשה שימוש כדי ליצור את crosslink או את טיב הנגע דנ א, זה שווה והדגיש כי המתודולוגיה הצהבת-qPCR תלויה באופן ביקורתי היכולת להפיק כמויות ניכרות של המצע DPC-פלסמיד הומוגנית. צעדים חיוניים עבור ניתוח זה כוללים טיהור של covalently, פלסמיד עגול סגור בעקבות הארכת תחל כדי לחסל את כל גנב או מולקולות פלסמיד ליניארי. חייב להיות מחוסל מזהמים אלה כדי להבטיח כי כל תיקון DPC שלאחר מכן נצפתה ואינו מכוון לשבור תיקון מכוון ניק או כפול-strand תהליכים. כשל להצטייד בכמות מספקת של supercoiled ה-DNA בעקבות תגובות סיומת פריימר יכול להתגבר על ידי משתנה היחס בין oligonucleotide ל- DNA חד-גדילי. צעד חשוב נוסף עבור שיטת הצהבת-qPCR, הוא יעילות crosslinking החלבון פלסמיד. במחקר זה, שימש תגובה בלתי יעילה, אנזימטי כדי crosslink החלבון glycosylase oxoguanine כדי הנגע 8-אוקסו-גואנין. Crosslinking משנה אופטימלית יכולים להשתפר על ידי שינוי כמות חלבון להוסיף את התגובה.
בעוד הממצאים המתוארים בדו ח זה הסתמך על lipofection להציג DPC תיקון סובסטרטים לתוך תאים הנמען, אין שום סיבה, א-פריורי, לא יכול להיות מועסק בשיטות אחרות transfections. יש לבצע מחקרים ראשוניים ואנו ציין שכי אלקטרופורציה39 יכול לשמש גם. עם זאת, ראוי לציין כי מניסיוננו אלקטרופורציה תרביות תאים יעילות מופחתת בהשוואה ל- lipofection, זה הכרחי להשתמש DNA המוביל (עד 5 µg) בנוסף µg 1.5 של מצע DPC כדי לקבל תיקון נתונים. בסך הכל, השיטה הצהבת-qPCR המתוארת לעיל מספק דרך חדשנית כדי לבחון DPC תיקון על פלסמיד ה-DNA ולהפיק תובנה חדשה התגובה נזק DNA באופן בלעדי.

כפי שיתואר בהמשך assay המבוסס על ה-PCR הנקרא הצהבת-qPCR. מטרת שיטה זו היא לכמת DPC תיקון על פלסמיד ש-DNA transfected תיקון לקוי ומיומן בתרבית של תאים. זה וזמינותו היא מהירה, כמותיים, גמיש במיוחד, ותיקון ישירות אמצעים פעילות. בעוד דוח זה מתמקד בשימוש מתודולוגיה זו ללמוד תיקון ה-Dpc, תוצאות שיובאו להלן ממחישים את התיקון של כל הנגע החוסמת. אנזימים יכולים להילמד באמצעות מתודולוגיה זו.
הרציונל מאחורי הפיתוח של שיטה זו הוא להשיג תובנה המנגנון שדרכו תאים בתרבית של תיקון Dpc. בניגוד לסוגים אחרים של נזק לדנ א, קריאות Dpc הן מגוונות בנפט1,2. מחקרים הראו כי מאות החלבונים יכול להיות תפור ל- DNA ואת זה עבור כל חלבון יש, באופן עקרוני, רבים שרשראות צד חומצת אמינו יכול להיות מצורפת covalently DNA הסלולר3. בנוסף, ישנן נקודות רבות מצורף כימי חלבונים על גבי עמוד השדרה ה-DNA, כולל מספר תנוחות על הבסיסים נוקלאוטיד, כמו גם על ה4,סוכר ריבוז5. המגוון הכימי מעלה את האפשרות כי ברורים משעולים הביוכימי ייתכן סמכינן על תיקון סוגים שונים של קריאות Dpc. זה היה עם חשש זה בראש כי וזמינותו הצהבת-qPCR פותחה.
מספר טכניקות פותחו כדי לזכות בתובנה ביולוגיה מולקולרית של תיקון DPC הסלולר. הבאות מספק סקירה של הגישות הגדולות אשר פותחו, עם סיכום של הרב-סרן חולשות כל יש איכויות. ראוי לציין כי בעוד סיכום זה מתמקד מחקרים של תיקון DPC במערכות תרבות בתרבית של תאים, תרומות משמעותיות על הדגם הנוכחי של תיקון DPC נעשו באמצעות מערכות מיקרוביאלי ונטולת תא לא דנו בזה כתב היד.
אולי האסטרטגיה הקלה ביותר שניתן לנקוט כדי לזכות בתובנה הגנטיקה של תיקון DPC הוא להעריך את הרגישות בהתאמה למוות תא שנצפו בתאי פראי-סוג של מוטציה נחשפים סוכנים זירוז Dpc6,7. אסטרטגיה זו היא יחסית מהירה, זולה, לא דורשת מומחיות ייחודית מעבר היכולת לבצע טכניקות התרבות התא הבסיסי. לניסיוני יתרונות אלה הם מגבלות רבות לגישה זו כולל את הפעולות הבאות. ראשית, וזמינותו לא ישירות למדוד DNA לתקן. ההנחה שבבסיס אסטרטגיה זו היא כי inactivating מוטציות בגנים קידוד חלבונים תיקון ה-DNA הרלוונטיים תוצאות הצטברות של ה-DNA נזק זה מוות תאי מתוכנת גורמים מפעילים. עם זאת, מוטציות בגנים קידוד חלבונים שאינם-ה-DNA לתקן יכול, שבעיקרון לשפר (או לצמצם) רגישות הסלולר מוות תאי xenobiotic-induced. שנית, סוכנים יוצר Dpc תמיד לגרום סוגים אחרים של נזק לדנ א (יוצאת דופן היא 5-עזה-2'-deoxycytadine, אך סוכן זה גם מכלה methyltransferase הסלולר רמות8). כתוצאה מכך, זה מתקבל על הדעת כי רגישות יתר הסלולר משופרת לסוכן המדובר עשוי לשקף פגמים תיקון interstrand crosslinks או נגעים אחרים. שלישית, כאמור לעיל, קריאות Dpc מייצגים כיתה הטרוגנית מאוד מורכבת מסוגים שונים של crosslinks כימיים, מעורבים שותפים חלבונים שונים. זה אפשרי בזמן תיקון של אחד או יותר תת סוגים של נגעים אלה עשויים להשתנות ב רקע גנטי מסוים, ייתכן ההבדל הזה לא יספיק לשנות משמעותית את הסלולר רגישות יתר עד מוות הנגרם על ידי סוכן זה. לסיכום, בעוד אסטרטגיה זו מייצג נקודת אטרקטיבי, המפורטות לעיל להדגיש את החשיבות של מרדף אחר שיטות אחרות, ישירה יותר ללמוד את קינטיקה של DPC תיקון.
מספר גישות קשורים פותחו להשגת מטרה זו. למשל, חוקרים פיתחו שיטות כדי להבחין בין DNA 'חינם' ו- 'חלבון מכורך' DNA9,10,11. באמצעות הגישות האלה, זה אפשרי להשוות בין רמות מצב יציב של קריאות Dpc או עקב חשיפה סוכן מייצרי DPC ב מרקע גנטי. שתי אסטרטגיות נעשה בהם שימוש נרחב ביותר לערב הפרדת DNA המכיל DPC מ- DNA חינם באמצעות ניטרוצלולוזה ממברנה מחייב אסטרטגיה או אשלגן כלורי/מרחביות משקעים12,13. בגישה לשעבר תאים lysed, עברו דרך מסנן ניטרוצלולוזה. מכיוון ניטרוצלולוזה נקשר חלבון, המסנן שומר על DNA מקושרים-חלבון, המתיר DNA חופשי לעבור. באסטרטגיית האחרון חלבון מכורך DNA מופרד DNA חופשי מבוססת על העובדה מרחביות נקשר חלבון אבל לא ה-DNA, יכול להיות זירז ידי התוספת של אשלגן כלורי. כתוצאה מכך, DNA מקושרים-חלבון הופך לא מסיסים בעוד דנ א לא מאוגד נשאר בפתרון. DNA המכיל DPC יכול אז ניתן quantitated באמצעות תימידין radiolabeled (אם תאים הודבקו תוויות בתחילה סמויה) או על-ידי סלקטיבית הדי הפלורסנט כמו Hoechst 33258. שיטות אלה לשחזור, לדרוש מספר צעדים קטנים. עם זאת, הם אינם מספקים מידע לגבי האופי של crosslink כימי שדרכו חלבון מחובר ל- DNA. יתר על כן, חשוב לציין, אלה מבחני יתר עשויים להעריך DPC לתקן כשקלע שקרית תיקון לא שלם, קרי, הפרוטאוליטי עיבוד כדי crosslinks DNA-פפטיד קטן זה לא יכול להיות בקלות לכוד או זירז, כמו DNA בתום-לב תיקון.
מבחני שביט ניתן להמחיש DPC היווצרות תאים14. בניסויים אלה, הנוכחות של קריאות Dpc להקטין את ההעברה דנ א אשר יכול להיות הפוך על-ידי pretreating עם proteinase ק. לכן, אורך הזנב יכול לשמש כדי להעריך DPC היווצרות. עם זאת, כפי שהוזכר לעיל, סמים להיוות DPC ליצור סוגים אחרים של נזק לדנ א אשר יכול לשנות את אורך הזנב. פרוטוקול זה גם מיומנויות טכניות גבוהות, דורש התמחות והכשרה בתחום ההדמיה קונפוקלי.
ספקטרומטר מסה ניתן ללמוד DPC תיקון קינטיקה לאחר הטיפול עם crosslinking סוכנים15,16,17. ניסויים אלה יטפל בתאים עם סוכנים להיוות DPC ולבודד Dpc ויה ביוטין לכידה או פנול: כלורופורם החילוץ (1:1). ספקטרומטר מסה יכול לשמש לאחר מכן כדי לזהות את החלבונים תפור או quantitate את כמות קריאות Dpc נוצר לאורך זמן. היתרון העיקרי של גישה זו היא מהות הנתונים הופק. זה אפשרי בדיוק קטלוג סוגי חלבונים להיות תפור בעקבות חשיפה xenobiotic, עם זאת, פרוטוקול זה יקר, זמן רב, והוא מוגבל לפי סוג crosslink שניתן לאתר.
. מייזלס ואח פיתח רגישות 'מכ ם' (גישה מהירה ל- DNA adduct השחזור) הנועד quantitate immunodetection של חלבון-דנ א adducts כמו גם מכ ם מבוסס על אליסה assay18,19. אלה מבחני שימושיות במיוחד עבור השמנה intermediates חלבון-דנ א זה transiently טופס בתאים ולהפיק דוגמיות מתאים לספקטרומטרית לזיהוי חלבון חדש adducts. Assay immunodetection הזה מסתמך על הזמינות של נוגדנים כדי ללכוד את crosslink חלבון-דנ א ו, לכן, עשויים להיות מסוגלים זיהוי ה-DNA מפורק-פפטיד adducts טופס זה במהלך תיקון. לאחרונה, מסוים DPC תיקון מסלול מקושר שכפול ה-DNA, על metalloprotease תלויי-DNA הספרטני התגלה ב Dpc אשר הם proteolyzed כדי פפטידים קטנים במהלך תיקון20,21. בירושה מוטציות בגן הזה קשורים עם תסמונת Ruijs-Aalfs בבני אדם, מחלה המאופיינת על ידי אי יציבות גנומית, הזדקנות מוקדמת, סרטן הכבד22. עכברים עם פגמים הגן ספרטני מהונדס גנטית להציג פנוטיפים דומה23.
התא המארח שהפעלה של פעילות גנים ברמת השעתוק שימש ללמוד התיקון הנוכחי על פלסמיד transfected DNA סובסטרטים24,25מוגדר נגעים. בניסויים אלה, פלסמיד המכיל קריאות Dpc (או סוגים אחרים של נגעים DNA) זה לחסום שעתוק של עיתונאי, כגון לוציפראז, הן transfected לתוך התאים. הפריה חוץ גופית מדידות לקח 24-72 שעות מאוחר יותר הם מכן בקורלציה עם DPC תיקון. אולם, מבחני תיקון עקיף אלה אינם מסוגלים גילוי תיקון אירועים מוקדם יותר תקנים לאחר 24 שעות, לא יכולים להבדיל בין RNA פולימראז מעקף של סובסטרטים תוקן חלקית ותיקון מלא.
כל אחת מהשיטות שתוארו לעיל יש יתרונות, תרמה המודל הנוכחי של DPC תיקון. עם זאת, וזמינותו הצהבת-qPCR עוקף כמה מן המגבלות הקשורות אלה גישות אחרות, וכתוצאה מכך יכול לספק יותר ספציפי תובנה DPC תיקון מנגנונים. לדוגמה, וזמינותו הצהבת-qPCR יכול למדוד ישירות תיקון ה-Dpc בייעודי לאתר על ה-DNA בתאים בתרבית של שלם. בשיטה זו הוא תכליתי, נעשה כדי להשיג תוצאות תיקון בעקבות תרביות תאים האוגרים ואת שורות תאים אנושיים. תרביות תאים של פלסמיד יכולה להתבצע באמצעות lipofection או אלקטרופורציה בקווים בתרבית של תאים בתרבית. זה גם מבטיח כי רק תיקון ה-Dpc מוגדר נמדד, לא סוגים אחרים של נזק לדנ א המושרה על ידי סוכנים להיוות DPC רוב. הצהבת-qPCR הוא קל לביצוע, זולה, מהירה. התוצאות המתקבלות באמצעות assay הזה גילו תיקון אירועים מוקדם ככל תקנים שלאחר 2 h. באמצעות שיטה זו, משתני שעשוי להשפיע על תוצאות התיקון DPC ניתן יהיה ללמוד באופן רגיש ויעיל. לדוגמה, התפקיד של שעתוק DPC תיקון טרם ניתן להעריך בקפדנות. בשל הגמישות של וזמינותו הצהבת-qPCR, אתר crosslinking DPC ניתן לטפל כדי להתייחס לשאלה זו. בנוסף, מבוא מוצא של שכפול לתוך פלסמיד DPC מניבי ניתן לפנות את ההשפעה של שכפול-DPC תיקון. בנוסף, crosslinks מרובים יכולים להיווצר על פלסמיד לבחון הבדלים תיקון DPC יחיד לעומת crosslinks מרובים. . אלו שאלות יהיה קשה לענות עליהן באמצעות בהכפלת ה-DNA, אבל בקלות ניתן לטפל באמצעות וזמינותו הצהבת-qPCR הכללית, וזמינותו הצהבת-qPCR דורש מטוהרים, דנ א פלסמיד בכמויות מיקרוגרם המכיל פצע של מיקום מוכר. Adducts חוץ assay זו יכולה לשמש DPC, עם זאת, הנגע חייב להיות מסוגל חסימת הרחבה על ידי אנזימים.

<table><tbody><tr><td>8-אוקסוגונין שונה אוליגו</td><td>מידלנד ריאגנט מוסמך חברת NA</td><td></td><td>רצף: 5' AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3'</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td></td><td>NEB M0201S</td><td></td></tr><tr><td>חד-גדילי M13</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>Taq פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>ATP, 100mM</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10mM כל אחד</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>T4 פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td></td><td>NEB M0202L</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-agarase</td><td>NEB</td><td>M0392S</td><td></td></tr><tr><td>Oxoguanine glycosylase 1</td><td>NEB</td><td>M0241S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR ירוק PCR מאסטר מיקס</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4309155</td><td>ירוק PCR מאסטר מיקס</td></tr><tr><td>פריימר R</td><td>UMN מרכז גנומי</td><td>NA</td><td>5' CGGCTCGTATGTTGTG 3'</td></tr><tr><td>פריימר L</td><td>UMN מרכז גנומי</td><td>NA</td><td>5' GCTGCAAGGCGATTAAGT 3'</td></tr><tr><td>מגיב ליפופקטמין</td><td>Invitrogen</td><td>18324-012</td><td>מגיב טרנספקציה&nbsp;</td></tr><tr><td>BspD1</td><td>NEB</td><td>R0557S</td><td></td></tr><tr><td>NEB buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Buffer</td><td>רווי פנול Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם, מגיב ACS, דרגת ספקטרו</td><td>ACROS</td><td>40463-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א crosslinks על פלסמידים transfected בתרבית של תאים

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

מטרת שיטה זו היא לספק שיטה כמותית, מהירה גמישות כדי לבחון את קינטיקה של חלבון-דנ א תיקון crosslink (DPC) בקווים בתרבית של תאים. במקום באופן גלובלי assaying הסרה של xenobiotic-induced או ספונטנית להסרת DPC כרומוזומלית, וזמינותו הזה בוחן את התיקון של פצע הומוגנית, הגדרה כימית הציג באופן ספציפי באתר אחד בתוך מצע דנ א פלסמיד. חשוב, גישה זו מונע את השימוש בחומרים רדיואקטיביים ואינה תלויה יקר או שהתשתית טכנולוגיות. במקום זאת, הוא מסתמך על הליכים סטנדרטיים דנ א רקומביננטי ומכשור תגובת שרשרת (qPCR) הנפוצה פולימראז בזמן אמת, כמותית. בהתחשב הגמישות של האסטרטגיה מנוצל, בגודל של החלבון תפור, כמו גם את טבעו של הצמדה כימי של ה-DNA מדויק רצף בהקשר של האתר המצורף יכולים להיות מגוונים לכתובת תרומות בהתאמה של אלה פרמטרים היעילות הכוללת של DPC תיקון. באמצעות שיטה זו, פלסמידים המכיל DPC בייעודי לאתר היו transfected לתוך תאים ושוחזר נמוך משקל מולקולרי דנ א שונים פעמים שלאחר תרביות תאים. DNA התאושש ואז נענשים הארכת תחל ספציפיים סטרנד (הצהבת) באמצעות פריימר משלימים לחוף פגום של פלסמיד. מאז DPC הנגע בלוקים Taq DNA פולימראז, היחס של DNA לתיקון כדי לא תוקן יכול להיות באופן כמותי מוערך באמצעות qPCR. ערכי הסף (CT) מחזור משמשים לחישוב אחוז לתקן בנקודות זמן שונות בשורות תאים המתאימים. שיטה זו הצהבת-qPCR יכול לשמש גם כדי להעריך באופן כמותי את התיקון קינטיקה של דנ adduct את רחובות אנזימים.

כדי לנצל את הצהבת-qPCR הנועד להעריך תיקון DPC הסלולר, בכמות מספקת (כמויות µg) באיכות גבוהה DPC תיקון המצע צריך להיות מוכן. כדי לקבל את המוצר הזה, oligonucleotide המכילה שאריות של 8-oxoguanine היה דנ א חד גדילי annealed כדי משלימים, פריימר מורחבת ו ג'ל טהור על מנת להבטיח כי רק covalently, המוצר עגול סגור שימשה עבור transfections (איור 1A). דוח זה מתמקד סובסטרטים שבו borohydride-השמנה משמש ליצירת crosslink קוולנטיות בין glycosylase oxoguanine האנושי רקומביננטי יחידה ריבוז על מולקולה כפול גדילי מעגלית פלסמיד, למרות מקביל גישות ניתן לקבל מצעים DPC מגוונת מבחינה כימית. האסטרטגיה השמנה glycosylase/borohydride oxoguanine הוא אטרקטיבי במיוחד בהתחשב יעילות גבוהה מאוד של התגובה crosslinking. כפי שמוצג באיור 1B, אשלגן כלורי/מרחביות משקעים מתבצע על מצע DPC זה היה מתעכל לתוך שני קטעים באופן סלקטיבי, כמעט באופן כמותי מרוקן את מקטע DNA מסתירים את DPC. תוצאות אלה תומכים במסקנה כי בעיקרו של דבר 100% של מולקולות המצע פלסמיד מכילים crosslink של חלבון.
וזמינותו הצהבת-qPCR המתוארות בסעיף פרוטוקול מנצל CT ערכים שנוצרו על-ידי qPCR כדי לחשב את האחוזים של תיקון DPC בעקבות תרביות תאים בתרבית של תאים. כמובא איור 2 , crosslink חלבון חוסם. אנזימים של הרחבת ומהצמיגים "R" annealed לחוף המכילות DPC. תכונה שנייה, קריטי assay הזה היא שילוב של 8 סיבובים של תגובות הצהבת (באמצעות ומהצמיגים R) לפני שתבצע את הבדיקה qPCR. בעוד ה-DNA תקינים (או לתיקון) יורחב במהלך תגובות אלו הצהבת, יצירת אתר איגוד ומהצמיגים 'L' במורד הזרם, דנ"א פגום (או שהיישום לתיקון DNA) לא יורחב. כתוצאה מכך, הצהבת מגביר את השפע של גדיל אחד ניזוק (או לתיקון) על ידי eight-fold. פירושו של דבר תוקן דגימות שבו הצעד הצהבת בוצעה לפני qPCR יציג ערך CT שלוש יחידות נמוך מזה שהתקבל עבור דוגמה זהה שבו הצהבת לא בוצעה לפני qPCR (איור 2). ההבדל שלוש יחידות ב- CT הערכים שנמדדו עבור שני הטיפולים, המכונה ΔCT, משקף העובדה הזאת 8 = 23. זה דלתא CT ערך יכול לשמש כדי לחשב את תאי ה-DNA לתקן את הפעילות באמצעות הנוסחה: תיקון ה-DNA אחוז = (2ΔCT /23) x 100. בקרת ניסויים אישר דלתא CT ערך של 3 נצפתה באופן עקבי כאשר המצע ניזוק פלסמידים היו נתונים הצהבת-qPCR (נתונים לא מוצג).
טבלה 1 מציג ערכים לדוגמה CT נוצרו מן המכילות DPC פלסמיד סובסטרטים שהיו התאוששה אוגר סיני ריאות fibroblasts h 3 עד 8 שעות שלאחר תרביות תאים (טבלה 1A), כמו גם מן בזמן מדגמים אפס, כלומר, דגימות מוכן כמתואר בסעיף פרוטוקול, אך לא transfected לתוך תאים (טבלה1B). הטבלה מציגה גם את ΔCT, אחוז לתקן ערכים (מחושבת באמצעות הנוסחה 2ΔCT/23 x 100) שהתקבל מן הדגימות. כמופיע ב טבלה 1A, התיקון אחוז מחושב מדגימות נקצרו 3 שעות, 8 שעות שלאחר תרביות תאים היה 66% ו- 93%, בהתאמה. ערכים אלה הם ואז יש לחסר אותם זה מזה המתקבל ניתוח המדגם 0 h כדי לקבוע האחוז לתקן. טבלה 1 ב מתארת CT ערכים עבור שני מדגמים שונים הו שבו היה crosslinking יעיל או לא הושג לפני תרביות תאים. ביעילות תפור לדוגמה כתוצאה באזור הדלתא CT הערך של 0.8 ואילו מדגם תפור גרוע, גרמו דלתא CT ערך של 2.5. עד כה, זה לא היה ניתן לקבוע במדויק את מקור האות רקע 0.8 ב ביעילות תפור מדגם 0 h. אין זה סביר כי הרקע הזה משקף רמה נמוכה של או הסרת DPC ספונטנית, או הוא עקב רמה נמוכה של Taq פולימראז 'לעקוף' באמצעות הנגע DPC: ניסויים נרחבים שבוצעו על המצע M13 חד גדילי נקיים במיוחד באופן עקבי הניב דלתא CT ערך של 0.8, קרי, בעיקרו של דבר זהה לזה 'רקע' סיומת ראיתי המכילות DPC סובסטרטים. כתוצאה מכך, סביר כי יש מידה קטן לראשוניות שגויה של ומהצמיגים "R" במהלך הצהבת תוצאות דור של כמות קטנה של מוצר זה ניתן על הגברה לאחר מכן כאשר מתווסף ומהצמיגים 'L', qPCR לבצע. יש מאמצים כדי לחסל את הרקע הזה על-ידי מניפולציה PCR תנאים, עד כה, לא הצליח לתקן פגם זה. עם זאת, האסטרטגיה חיסור שתוארו לעיל מאפשר אומדן מדויק של DPC תיקון פעילות. זה שווה וציין כי crosslinking לא יעיל של החלבון לתוך פלסמיד יביא ערך רקע מוגברות. זה מתואר ב הנתונים לדוגמה הניתנים 1B שולחן שבו חלבון לא יעיל-DNA crosslinking הביא דלתא גבוה CT ערך זמן 0. לכן, שליטה הניסויים מתבצעים תמיד לפני ייזום transfections ותערובות עם ערכי דלתא CT מוגבה מעל 0.8 רמת סף יימחקו. כאמור בפרוטוקול qPCR, כל מדגם מחולק 3 בארות כדי להבטיח עקביות pipetting. אלה משכפל ואז חישוב הממוצע כדי לקבל את הערך CT עבור הדגימה. משכפל חורגים יותר ± 0.1 מסולקות של ערכת הנתונים. אם כל שלושת משכפל לסטות יותר ± 0.1 אחד מהשני, וזמינותו הצהבת-qPCR הוא משופץ עד ערכים עקביים מתקבלים. הניסיון מלמד כי לפחות 3 transfections עצמאי חייב להתבצע כדי לחשב ערכי הממוצע אמין זה יכול ואז יהיה נתון סטטיסטי כדי לקבוע את ההשפעה של פרמטרים שונים על יעילות תיקון DPC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig1.jpg"> איור 1. מהדור פלסמיד המכיל DPC. (א) oligonucleotide המכילה שאריות 8-אוקסו-גואנין (אדום) annealed ל- DNA חד-גדילי (עיגול שחור מודגש), מורחב כדי ליצור זוגיות גדילי פלסמיד (פריימר הרחבת המוצר שצוין על-ידי קו מקווקו). בעקבות אלקטרופורזה של אתידיום ברומיד, הלהקה התואם ל- DNA supercoiled (התיבה האדומה) טוחנות של ג'ל נמוכה-להמיס agarose, מתעכל עם β-agarase. נתיבים: (1) משקל מולקולרי מרקר, דנ א חד גדילי (2), (3) שני גדילי ה-DNA, (4) פריימר מורחב הדגימה. (B) Oxoguanine glycosylase (מקוצרת hOGG1, ו"כדור עיגול כתום) הוא תפור על השאריות 8-אוקסו-גואנין באמצעות סודיום cyanoborohydride, המצע DPC וכתוצאה מכך מתעכל כדי ליצור בסיס-זוג 2,800, קטע DNA חופשי, של ה-4400 שבר בסיס-זוג מחובר החלבון. מרחביות מתווסף המדגם אשר ואז מחולק לשני חלקים, אחד מהם שטופלו אשלגן כלורי, centrifuged את המשקע DNA המכיל DPC (ו"כדור של גלולה כתומה). תגובת שיקוע של זה האחרון (ו"כדור נוזל כחול בצינור צנטריפוגה) ולדגום את הדגימה אינה נחשפת אשלגן כלורי ותוחלת בג'ל. נתיבים: (1) משקל מולקולרי מרקר, (2) - אשלגן כלורי, (3) + אשלגן כלורי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig2.jpg"> איור 2: כימות של פלסמיד פגום באמצעות הצהבת-qPCR. דנ א פלסמיד הוא שפגע בסימני וה -פריימר משלימים לחוף פגום (R) annealed מורחב. תהליך זה חוזר על עצמו עבור סכום כולל של 8 מחזורים. עם מצע פגום (למעלה), אנזימים חסומה על-ידי הנגע DPC, לא יפיק גדילי המוצר באורך מלא. לעומת זאת, עם מצע המתוקן (למטה), אנזימים יפיקו המוצר באורך מלא גדילי המכיל את אתר איגוד פריימר ל' אחרי 8 מחזורים, פריימר L נוסף, ערכי הסף מחזור נקבעים באמצעות qPCR. דוגמה הגברה תוצאות סובסטרטים פגום ולא פגומה מומחשים בצד הימין עם הקו האדום המייצג DNA שעברו הארכת תחל לפני qPCR וכחול המייצג DNA שלא היה פריימר מורחב לפני qPCR. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">טבלה 1 א</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">זמן</td>
			<td rowspan="2">-הארכת תחל</td>
			<td rowspan="2">+ הארכת תחל</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>תיקון אחוז</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT/23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 h</td>
			<td>23.5</td>
			<td>21.1</td>
			<td>2.4</td>
			<td>66</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 שעות</td>
			<td>29.4</td>
			<td>26.5</td>
			<td>2.9</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">טבלה 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">זמן</td>
			<td rowspan="2">-הארכת תחל</td>
			<td rowspan="2">+ הארכת תחל</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>רקע אחוז</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT/23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>הו</td>
			<td>15.4</td>
			<td>14.6</td>
			<td>0.8</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>הו</td>
			<td>15.4</td>
			<td>12.9</td>
			<td>2.5</td>
			<td>71</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: חישוב אחוז לתקן באמצעות CT ערכים שנוצרו מן הצהבת-qPCR. (א) תיקון של מצע המכיל DPC transfected ב V79 אוגר סיני ריאות fibroblasts 3 h, תרביות תאים לאחר 8 שעות. (B) הצהבת-qPCR של דגימות הו לא transfected לתוך התאים. Glycosylase היה מדגם אחד היעילות של התגובה crosslinking בין DNA ל- oxoguanine גבוה (דוגמה זו הניבה ערך נמוך דלתא CT) תוך במדגם אחר היעילות של חלבון crosslinking היה נמוך (דוגמה זו הניבה דלתא גבוה יחסית ערך CT). עיין בטקסט של התוצאות נציג לקבלת פרטים.

המטרה של פרוטוקול זה נועד לכמת תיקון crosslinks DNA-חלבון מוגדר על פלסמיד ה-DNA. פלסמידים lesioned הם transfected לתוך שורות תאים בתרבית של הנמען, משקל נמוך-מולקולרי נקצרו תקנים שלאחר נקודות זמן מרובים. קינטיקה תיקון ה-DNA יש לכמת באמצעות הארכת תחל סטרנד ספציפיים ואחריו qPCR.

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

המטרה הכוללת של מאמר QPCR זה של הרחבת פריימר טרנס-פסיפית, היא להעריך כמותית את התיקון של תוספות, המקושרות ל-DNA פלסמיד, לאחר טרנספקציה לתאי יונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA. כגון אילו מסלולים מעורבים בתיקון קישורים צולבים של חלבון DNA.לטכניקה זו יש פוטנציאל לספק הבנה טובה יותר של תגובת הנזק ל-DNA. מכיוון שהוא מאפשר לחקור באופן סלקטיבי את התיקון של קישורים צולבים של חלבון DNA והיעדר סוגים אחרים של נזק ל-DNA. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תיקון קישורים צולבים של חלבון DNA, ניתן ליישם אותה גם על סוגים אחרים של נזק ל-DNA.כגון אתרים בסיסיים, ותוספות אחרות החוסמות פולימראז. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא יכולה לזהות תיקון של פלסמידים המכילים אדוקט, בנקודות זמן כבר שעתיים. בתחילה התכוונו להשתמש בהפעלה מחדש של תאי בית כדי לחקור תיקון, אולם בדיקות אלה אינן מודדות ישירות תיקון או עשויות להעריך יתר על המידה את יעילות התיקון.במיוחד אם RNA פולימראז יכול לקרוא דרך מוצרי תיקון לא שלמים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לדמיין את שלבי הטיהור והארכת הפריימר הספציפיים לגדיל. מערבבים 20 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 80 פיקומולים של שמונה אוקסוגונין המכילים אוליגונוקלאוטיד עם חמישה מיקרוליטרים של מאגר ליגאז פי 10.והוסף מיקרוליטר אחד של תמיסה המכילה 10 יחידות של T4 פולינוקלאוטיד קינאז. כוונן את הנפח הסופי ל -50 מיקרוליטר ודגר את הצינור באמבט מים למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מהווים את תגובת הארכת הפריימר על הקרח.הגדר את התוכנית על התרמו-סייקלר והתחל את הריצה. לאחר הדגירה, התאם את הנפח הכולל ל -375 מיקרוליטר על ידי הוספת ריאגנטים, אנזימים ומאגר שונים. לאחר מכן דגרו את התגובה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.להכנת תערובת פניל-כלורופורם ביחס של 50:50, הוסיפו כמויות שוות של פנול וכלורופורם. לאחר מכן מערבבים את שני הרכיבים ומסובבים בצנטריפוגה שולחנית בחום של 21, 130 גרם למשך חמש דקות. לאחר סיום הסחיטה, הוסף 375 מיקרוליטר מהשכבה האורגנית לתגובת הארכת הפריימר. לערבב.ושוב צנטריפוגה ב 21, 130 גרם למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, פיפטה בזהירות את השכבה העליונה. ומערבבים עם אמוניום אצטט לריכוז סופי של 0.3 טוחנת.ואז להוסיף אליו שני נפחים של 100% אתנול. אחסן את התערובת בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות עד לילה. לאחר סיום תקופת הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה ב-15,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה באתנול 70%. סובב את הדגימה שוב בצנטריפוגה שולחנית ב-15,000 סל"ד למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והמיסו את הגלולה ב-100 מיקרוליטר מים.שלב 50 מיקרוליטר של ה-DNA עם 34 מיקרוליטר מים ו-16 מיקרוליטר של צבע טעון ג'ל פי 6. הפעל את הדגימה על ג'ל אגרוז בגודל 10 סנטימטר, 0.8% נמס נמוך המכיל 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד בשני וולט לסנטימטר למשך שש שעות במאגר TAE 1x. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי לכרות את ה-DNA המפותל.ושקלו את פרוסת הג'ל. לאחר מכן, הוסף מאגר תגובה אחד של מיקרוליטר בטא-אגראז לעיכול כל 10 מיליגרם של פרוסת ג'ל. לאחר מכן דוגרים את הפרוסה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן מצננים ב-42 מעלות צלזיוס במחזור תרמי.לאחר שפרוסת הג'ל התמוססה והתקררה ל-42 מעלות צלזיוס, הוסיפו 10 יחידות בטא-אגראז והשאירו בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה במחזור התרמו. לאחר שעה מודדים את נפח פרוסת הג'ל המומסת ומוסיפים אמוניום אצטט לריכוז סופי של 0.3 מולארי ודוגרים על קרח למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התערובת בחום של 15, 000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן אוספים את הסופר נטנט ופיפטה אליו שני נפחים של איזופרופנול ומערבבים. לאחר מכן אחסן את התערובת בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, צנטריפוגה את ה-DNA המטוהר בצנטריפוגה שולחנית ב-15,000 סל"ד למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את הסופר נטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -40 מיקרוליטר מים. לאחר מכן שלבו 15 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 12 פיקומולים של DNA עם מיקרוליטר אחד של תמיסה של 36 פיקומולים של אוקסוגונין גליקוזילאז במאגר והתאימו את הנפח הסופי ל-30 מיקרוליטר. לאחר מכן דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים.יום לפני הטרנספקציה, זרעו את התאים בצלחת תרבית של שש בארות. למחרת מערבבים 1.5 מיקרוגרם של הפלסמיד המקושר עם 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית נטול סרום בשפופרת אחת, תוך הקפדה על שמירת מיקרוליטר אחד של DNA כנקודת סימן של אפס שעות. בשפופרת אחרת מערבבים 12 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה עם 300 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום.לאחר מכן שלב 300 מיקרוליטר של ה- DNA המקושר עם נפח שווה של מגיב טרנספקציה מדולל. ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינרית. לאחר הדגירה מוסיפים 250 מיקרוליטר מהמתחם לכל אחת משתי הבארות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מינימום שעה, הסר את המדיום והוסף מיליליטר אחד של תמיסת נתרן דודציל סולפט 0.6% עם 0.1 EDTA מולארי ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן נתק את התאים על ידי גירוד עם שוטר גומי והעביר לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלוריד 5 מולרית לריכוז סופי של טוחנת אחת והפוך את הצינור חמש פעמים.לאחר מכן דגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת צנטריפוגה את הדגימה ב-21, 130 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, אסוף את הסופר נטנט.ולהוסיף אמוניום אצטט לריכוז סופי של 0.3 טוחנת, לערבב ולהוסיף שני נפחים של 100% אתנול כדי לזרז את ה- DNA. אחסן את התערובת בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. לאחר משקעי אתנול והשעיה מחדש של דגימות ה-DNA ששוחזרו ב-50 מיקרוליטר מים, יש לדלל את דגימת האפס שעות ב-500 מיקרוליטר מים וליצור את תגובות ה-PCR באמצעות הדגימות הלא מועברות והטרנספטציה.לאחר מכן הגדר את התוכנית על ה-thermo cycler והתחל את הריצה. שלב הארכת פריימר טרנס-ספציפי זה הוא קריטי מכיוון שהוא קונה לנו הגברה של הגדיל הפגום. אם לא נעשה בו שימוש, ערכי דלתא CT יהיו פחות מאחד, מה שמקשה על זיהוי רמות נמוכות של תיקון DPC.לאחר השלמת שמונה מחזורים, הוסף 100 פיקומולים של הפריימר השני. לאחר מכן מערבבים מיקרוליטר אחד של ה-DNA הלא מוגבר מהדגימות הלא מועברות והטרנספטציה עם תערובת מאסטר פי 2, מים ו-100 פיקומולים משני הפריימרים לנפח סופי של 60 מיקרוליטר. טען את הדגימות בשלוש פעמים על צלחת PCR של 96 בארות.בצע PCR כמותי עבור 30 מחזורים וממוצע סף המחזור עבור כל אחת מהדגימות המשולשות. במחקר זה QPCR מבוצע עם ובלי הארכת פריימר ספציפית לגדיל על מנת לחשב את אחוז ה-DNA של הפלסמיד שתוקן. ההבדל בערכי סף המחזור בין הדגימות המורחבות בפריימר לבין הדגימות שאינן מורחבות בפריימר מכונה דלתא CT.As שנראה כאן, לדגימה מתוקנת הנתונה ל-SSPE-QPCR יש CT דלתא גדול יותר מאשר לדגימה לא מתוקנת.נתונים מייצגים של אחוז התיקון המחושבים מערכי דלתא CT מראים שדגימות ששוחזרו לאחר שלוש שעות של טרנספקציה תוקנו ב-66% בעוד שדגימות ששוחזרו לאחר שמונה שעות תוקנו ב-93%. ערכי רקע באחוזים המחושבים משתי דגימות בקרה עם יעילות הצלבת חלבון גבוהה ונמוכה בהתאמה מוצגים כאן. הרקע באחוז הנמוך הקיים בבקרה, מצביע על כך שרק מצעים צולבים ביעילות משמשים לטרנספקציות.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לקחת זמן אפס דגימות כדי להפחית כל רקע מהבדיקה הזו. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח רצף כדי לענות על שאלות נוספות כמו: האם תיקון DPC נוטה לשגיאות?לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להכין, להעביר ולכמת תיקון של פלסמידים המכילים אדווקטים בתאי יונקים. אל תשכח שעבודה עם פנול, כלורופורם ואתידיום ברומיד עלולה להיות מסוכנת. ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת כפפות ועבודה במכסה אדים.

a-simple-rapid-quantitative-assay-to-measure-repair-dna-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מאמר זה מתאר GFP מבוססי...

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התא. Assay מניב שיעורי פעילות תיקון דנ"א מקובל ניתוח הקינטית ניתנת להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates הגידול או עם חלבונים מטוהרים.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הצטרפות קצה חוץ-כרומוזומלית לא הומולוגית (NHEJ) ובדיקת רקומבינציה הומולוגית (HR) כדי לכמת את היעילות של NHEJ ו- HR בתאי HEK-293T.

ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

כאן, אנו מתארים שיטה לוויזואליזציה מבוססת תאים, לוקאליזציה תת-תאית וניתוח כמותי של מוקדים מועשרים בפולי(ADP-ריבוז) (PAR) בתאי יונקים קבועים. מבחן זה מאפשר לכימות אתרים של הפעלת PARP הנגרמת מנזק DNA, כולל זה הקשור לתיקון כריתת בסיס או תיקון שבירה חד-גדילית, בגרעינים של תאים שנחשפו לגנוטוקסין.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של הפעלת PARP1/PARP2 המושרת על ידי גנוטוקסין בתאים באמצעות מדווח מבוסס חלבון פיוז'ן פלואורסצנטי

למד שיטה כמותית לבדיקת תיקון חלבון-דנ"א crosslinks בפלסמידים transfected בתאי יונקים באמצעות primer extension ו-qPCR. הטכניקה מאפשרת מדידת קינטיקת תיקון כבר לאחר שעתיים.

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

גלה סרטונים נוספים