הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

המטרה של פרוטוקול זה נועד לכמת תיקון crosslinks DNA-חלבון מוגדר על פלסמיד ה-DNA. פלסמידים lesioned הם transfected לתוך שורות תאים בתרבית של הנמען, משקל נמוך-מולקולרי נקצרו תקנים שלאחר נקודות זמן מרובים. קינטיקה תיקון ה-DNA יש לכמת באמצעות הארכת תחל סטרנד ספציפיים ואחריו qPCR.

המטרה הכוללת של מאמר QPCR זה של הרחבת פריימר טרנס-פסיפית, היא להעריך כמותית את התיקון של תוספות, המקושרות ל-DNA פלסמיד, לאחר טרנספקציה לתאי יונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA. כגון אילו מסלולים מעורבים בתיקון קישורים צולבים של חלבון DNA.

לטכניקה זו יש פוטנציאל לספק הבנה טובה יותר של תגובת הנזק ל-DNA. מכיוון שהוא מאפשר לחקור באופן סלקטיבי את התיקון של קישורים צולבים של חלבון DNA והיעדר סוגים אחרים של נזק ל-DNA. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תיקון קישורים צולבים של חלבון DNA, ניתן ליישם אותה גם על סוגים אחרים של נזק ל-DNA.

כגון אתרים בסיסיים, ותוספות אחרות החוסמות פולימראז. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא יכולה לזהות תיקון של פלסמידים המכילים אדוקט, בנקודות זמן כבר שעתיים. בתחילה התכוונו להשתמש בהפעלה מחדש של תאי בית כדי לחקור תיקון, אולם בדיקות אלה אינן מודדות ישירות תיקון או עשויות להעריך יתר על המידה את יעילות התיקון.

במיוחד אם RNA פולימראז יכול לקרוא דרך מוצרי תיקון לא שלמים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לדמיין את שלבי הטיהור והארכת הפריימר הספציפיים לגדיל. מערבבים 20 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 80 פיקומולים של שמונה אוקסוגונין המכילים אוליגונוקלאוטיד עם חמישה מיקרוליטרים של מאגר ליגאז פי 10.

והוסף מיקרוליטר אחד של תמיסה המכילה 10 יחידות של T4 פולינוקלאוטיד קינאז. כוונן את הנפח הסופי ל -50 מיקרוליטר ודגר את הצינור באמבט מים למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מהווים את תגובת הארכת הפריימר על הקרח.

הגדר את התוכנית על התרמו-סייקלר והתחל את הריצה. לאחר הדגירה, התאם את הנפח הכולל ל -375 מיקרוליטר על ידי הוספת ריאגנטים, אנזימים ומאגר שונים. לאחר מכן דגרו את התגובה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.

להכנת תערובת פניל-כלורופורם ביחס של 50:50, הוסיפו כמויות שוות של פנול וכלורופורם. לאחר מכן מערבבים את שני הרכיבים ומסובבים בצנטריפוגה שולחנית בחום של 21, 130 גרם למשך חמש דקות. לאחר סיום הסחיטה, הוסף 375 מיקרוליטר מהשכבה האורגנית לתגובת הארכת הפריימר. לערבב.

ושוב צנטריפוגה ב 21, 130 גרם למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, פיפטה בזהירות את השכבה העליונה. ומערבבים עם אמוניום אצטט לריכוז סופי של 0.3 טוחנת.

ואז להוסיף אליו שני נפחים של 100% אתנול. אחסן את התערובת בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות עד לילה. לאחר סיום תקופת הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה ב-15,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה באתנול 70%. סובב את הדגימה שוב בצנטריפוגה שולחנית ב-15,000 סל"ד למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והמיסו את הגלולה ב-100 מיקרוליטר מים.

שלב 50 מיקרוליטר של ה-DNA עם 34 מיקרוליטר מים ו-16 מיקרוליטר של צבע טעון ג'ל פי 6. הפעל את הדגימה על ג'ל אגרוז בגודל 10 סנטימטר, 0.8% נמס נמוך המכיל 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד בשני וולט לסנטימטר למשך שש שעות במאגר TAE 1x. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי לכרות את ה-DNA המפותל.

ושקלו את פרוסת הג'ל. לאחר מכן, הוסף מאגר תגובה אחד של מיקרוליטר בטא-אגראז לעיכול כל 10 מיליגרם של פרוסת ג'ל. לאחר מכן דוגרים את הפרוסה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן מצננים ב-42 מעלות צלזיוס במחזור תרמי.

לאחר שפרוסת הג'ל התמוססה והתקררה ל-42 מעלות צלזיוס, הוסיפו 10 יחידות בטא-אגראז והשאירו בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה במחזור התרמו. לאחר שעה מודדים את נפח פרוסת הג'ל המומסת ומוסיפים אמוניום אצטט לריכוז סופי של 0.3 מולארי ודוגרים על קרח למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התערובת בחום של 15, 000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן אוספים את הסופר נטנט ופיפטה אליו שני נפחים של איזופרופנול ומערבבים. לאחר מכן אחסן את התערובת בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, צנטריפוגה את ה-DNA המטוהר בצנטריפוגה שולחנית ב-15,000 סל"ד למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את הסופר נטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -40 מיקרוליטר מים. לאחר מכן שלבו 15 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 12 פיקומולים של DNA עם מיקרוליטר אחד של תמיסה של 36 פיקומולים של אוקסוגונין גליקוזילאז במאגר והתאימו את הנפח הסופי ל-30 מיקרוליטר. לאחר מכן דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים.

יום לפני הטרנספקציה, זרעו את התאים בצלחת תרבית של שש בארות. למחרת מערבבים 1.5 מיקרוגרם של הפלסמיד המקושר עם 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית נטול סרום בשפופרת אחת, תוך הקפדה על שמירת מיקרוליטר אחד של DNA כנקודת סימן של אפס שעות. בשפופרת אחרת מערבבים 12 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה עם 300 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום.

לאחר מכן שלב 300 מיקרוליטר של ה- DNA המקושר עם נפח שווה של מגיב טרנספקציה מדולל. ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינרית. לאחר הדגירה מוסיפים 250 מיקרוליטר מהמתחם לכל אחת משתי הבארות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מינימום שעה, הסר את המדיום והוסף מיליליטר אחד של תמיסת נתרן דודציל סולפט 0.6% עם 0.1 EDTA מולארי ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן נתק את התאים על ידי גירוד עם שוטר גומי והעביר לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלוריד 5 מולרית לריכוז סופי של טוחנת אחת והפוך את הצינור חמש פעמים.

לאחר מכן דגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת צנטריפוגה את הדגימה ב-21, 130 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, אסוף את הסופר נטנט.

ולהוסיף אמוניום אצטט לריכוז סופי של 0.3 טוחנת, לערבב ולהוסיף שני נפחים של 100% אתנול כדי לזרז את ה- DNA. אחסן את התערובת בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. לאחר משקעי אתנול והשעיה מחדש של דגימות ה-DNA ששוחזרו ב-50 מיקרוליטר מים, יש לדלל את דגימת האפס שעות ב-500 מיקרוליטר מים וליצור את תגובות ה-PCR באמצעות הדגימות הלא מועברות והטרנספטציה.

לאחר מכן הגדר את התוכנית על ה-thermo cycler והתחל את הריצה. שלב הארכת פריימר טרנס-ספציפי זה הוא קריטי מכיוון שהוא קונה לנו הגברה של הגדיל הפגום. אם לא נעשה בו שימוש, ערכי דלתא CT יהיו פחות מאחד, מה שמקשה על זיהוי רמות נמוכות של תיקון DPC.

לאחר השלמת שמונה מחזורים, הוסף 100 פיקומולים של הפריימר השני. לאחר מכן מערבבים מיקרוליטר אחד של ה-DNA הלא מוגבר מהדגימות הלא מועברות והטרנספטציה עם תערובת מאסטר פי 2, מים ו-100 פיקומולים משני הפריימרים לנפח סופי של 60 מיקרוליטר. טען את הדגימות בשלוש פעמים על צלחת PCR של 96 בארות.

בצע PCR כמותי עבור 30 מחזורים וממוצע סף המחזור עבור כל אחת מהדגימות המשולשות. במחקר זה QPCR מבוצע עם ובלי הארכת פריימר ספציפית לגדיל על מנת לחשב את אחוז ה-DNA של הפלסמיד שתוקן. ההבדל בערכי סף המחזור בין הדגימות המורחבות בפריימר לבין הדגימות שאינן מורחבות בפריימר מכונה דלתא CT.As שנראה כאן, לדגימה מתוקנת הנתונה ל-SSPE-QPCR יש CT דלתא גדול יותר מאשר לדגימה לא מתוקנת.

נתונים מייצגים של אחוז התיקון המחושבים מערכי דלתא CT מראים שדגימות ששוחזרו לאחר שלוש שעות של טרנספקציה תוקנו ב-66% בעוד שדגימות ששוחזרו לאחר שמונה שעות תוקנו ב-93%. ערכי רקע באחוזים המחושבים משתי דגימות בקרה עם יעילות הצלבת חלבון גבוהה ונמוכה בהתאמה מוצגים כאן. הרקע באחוז הנמוך הקיים בבקרה, מצביע על כך שרק מצעים צולבים ביעילות משמשים לטרנספקציות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לקחת זמן אפס דגימות כדי להפחית כל רקע מהבדיקה הזו. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח רצף כדי לענות על שאלות נוספות כמו: האם תיקון DPC נוטה לשגיאות?

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להכין, להעביר ולכמת תיקון של פלסמידים המכילים אדווקטים בתאי יונקים. אל תשכח שעבודה עם פנול, כלורופורם ואתידיום ברומיד עלולה להיות מסוכנת. ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת כפפות ועבודה במכסה אדים.