Name: הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: למדו להעריך אלקליניזציה ליזוזומלית במעי של Caenorhabditis elegans באמצעות צביעת cDCFDA. שיטה זו פשוטה, זולה ושימושית למחקר אוטופאגיה ופונקציה ליזוזומלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למרכז גנטיקה Caenorhabditis זנים, מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), קרן קנדה עבור חדשנות (CFI) למימון. ברצוננו להודות ד ר ליזהן חן (החוג למערכות תא ו אנטומיה, UT בריאות סן אנטוניו) עבור המאפשר שימוש בלתי מוגבל של מתקני המעבדה שלה עבור כל הניסויים C. elegans , כמו גם ד ר וואנג Exing (מנהל שותף, מתקן הדמיה אופטית UT בריאות סן אנטוניו) לקבלת סיוע עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו רוצים גם תודה ד ר מירון איגנטיוס למתן תמיכה ועידוד כדי להקל את. הצילומים.

1. כתם, תמונה lysosomes מעיים
<ol><li>זרע הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות עם OP50
	<ol>
<li>הכינו צלחות NGM לפי הפרוטוקול המומלץ19 ולאפשר את הצלחות סגור להתייבש במשך יומיים בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לחסן OP50 חיידקים לתוך ציר מרק לוריא (LB) סטרילי ולגדול בתוך אמבט מים או חממה חזק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות או עד OD היא בין 0.2 0.4. הימנע משימוש תרבות חיידקי עם יתר > 1 או OD < 0.2.</li>
		<li>לאחר הצלחות NGM יבש, מקום טיפה (~ 30 µL) OP50 inoculum במרכז הצלחת, ולאחר מכן התפשטה הירידה לתוך תיקון בערך זה 2 ס"מ על 2 ס"מ בגודל. הערה: כל inoculum OP50 הנותרים ניתן לאחסן ב 4 ° C עבור עד חודש.</li>
		<li>היפוך הלוחות OP50 ברגע inoculum יבש (בערך 10 או 15 דקות) ולאחר מכן דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 36 שעות.</li>
		<li>לאחר 36 ה', להסיר את הלוחות מן החממה החנות ב 4 ° C עד לשימוש בעתיד. הערה: הלוחות צריך להיות טוב עבור חודש אחד עד 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>שכשהם cDCFDA כדי OP50
	<ol>
<li>כדי להשלים את cDCFDA על גבי לוחות OP50, להכין מלאי עבודה של 10 מ מ cDCFDA ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). שמור את הפתרון cDCFDA מוגן מפני אור וחנות ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.</li>
		<li>הנח בעדינות µL 100 בפתרון cDCFDA 10 מ מ על גבי המשטח של התיקון OP50 2 ס"מ x 2-ס מ, כך התיקון כולו מכוסה בצורה אחידה cDCFDA. הערה: חשוב מאוד כי התיקון כולו של OP50 מכוסה cDCFDA. אם נדרש, השתמש µL עד 150 של cDCFDA על כל צלחת. . זה גם הכרחי כי הפתרון cDCFDA לא להרחיב מעבר לגבולות התיקון OP50, מאז כל cDCFDA שזורם מתוך התיקון OP50 לא ישולבו לתוך האוכל, והתוצאה מכתימים בעוצמה מופחתת.</li>
		<li>למקם את הצלחות OP50 בקופסה כהה על גבי ספסל עד כל הפתרון cDCFDA נספג לתוך התיקון חיידקי (בדרך כלל כ- 25-30 דקות).</li>
	</ol></li>
	<li>צביעת תולעים באמצעות cDCFDA
	<ol>
<li>ברגע cDCFDA יש חילחלו לחלוטין את התיקון OP50, במקום לא יותר מ-20 תולעים לכל צלחת, דגירה הלוחות הפוכה ב 20 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 14 h. הערה: מומלץ למקם את הצלחות cDCFDA בתיבה אטומה כדי למזער את החשיפה לאור.</li>
		<li>כדי לשלוט על צריכת ההבדלים בין ניסויים, לנרמל את אותות cDCFDA, (מומלץ) כתם משותף עם 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( difluoro) בורון (2.5 µL של פתרון טרי 1 מ מ), צבע אמין חלש acidotropic אשר הוא שאינו משתנה במידה רבה על הספקטרום pH חומצי (ראה טבלה של חומרים עבור שמות נפוצים של ריאגנטים). הערה: אינו מכתים תולעים בשביל פחות מ 14 h, מאז זה עשוי לספק עוצמת מוכתמים cDCFDA לקוי ולתת פרשנות שווא של lysosomal pH.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת שקופיות מיקרוסקופ
	<ol>
<li>במקום שתי רצועות מקבילים של תיוג הקלטת כ 3 ס מ זו מזו על משטח שטוח חלקה, כגון מראה (איור 1).</li>
		<li>מעיל השטח של המראה עם ספריי דוחה מים, תנגבי את הנוזל העודף.</li>
		<li>להמיס agarose 2% (מומס מזוקקים H2O) במיקרוגל עד נוזלי לגמרי, ואז תעברו במהירות הירידה עם מגלשת מיקרוסקופ, כך לשקופית ניצב הרצועות של מקום טיפת µL 50 agarose בין שתי רצועות של נייר דבק הקלטת. לאחר agarose התחזק, ויוצרים כרית מעגליות מתחת למגלשה, נהפוך את השקופית ולהוסיף 10-15 µL של אזיד הנתרן 5 מ מ (נאן3) על גבי משטח agarose. הערה: נאן3 הוא מעכב ציטוכרום C כי כאשר נעשה שימוש בריכוזים נמוכים, הפיכה anesthetizes תולעים, כך שהם לא יזוז במהלך דימות.</li>
		<li>לבחור תולעים מהצלחת OP50 בתוספת cDCFDA, ומעבירים אותם אל צלחת NGM נקי ללא כל OP50. לאפשר את התולעים לנוע לכמה שניות לאפשר רוב OP50 להסיר פני השטח של התולעים, ולאחר מכן להעביר את התולעים כדי לרפד את agarose המכיל אזיד הנתרן 5 מ מ.</li>
		<li>מיד לכסות את משטח agarose עם מכסה. הקפד הנח בעדינות בתגית כיסוי מבלי להחיל מדי לחץ, שכן התוצאה יכולה להיות תולעים מתפוצץ. הערה: חיידקים OP50 בתוספת cDCFDA לזרוח כאשר visualized באמצעות מיקרוסקופ, ולכן חשוב לנקות את התולעים הטובה ביותר ככל האפשר לפני שמניחים אותם על משטח agarose המכיל אזיד הנתרן. אם מכינים יותר מ 6 זנים של C. elegans (כולל N2, פראי סוג הבקרה), רצוי להכין את הדגימות בקבוצות של 6, על מנת להבטיח כי התולעים לא להתייבש על משטח agarose. ב זנים מסוימים, הפות מתחילה להיקרע לאחר תקופות זמן בעקבות לחץ הרכב מכסה, לכן חשוב לתכנן בהתאם.</li>
	</ol></li>
	<li>מיקרוסקופיה קונפוקלית הערה: כמה מיקרוסקופים יש תכונה מובנית באופן אוטומטי מגביר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כדי לפצות על רמות מגוונות של זריחה. מיקרוסקופים כזה עשוי שלא לפעול היטב עבור הדמיה תולעים מוכתם cDCFDA, מאז הם מטבעם יאריכו את עוצמת קרינה פלואורסצנטית דגימות.<ol>
<li>לבצע הדמיה-מיקרוסקופ קונפוקלי הרגיל באמצעות עירור/פליטה אורכי גל מוגדר 488/530 ננומטר עבור cDCFDA. תמונות מטוס יחיד (לא Z-ערימות) של המעי lysosomes ולהשתמש רק lysosomes כי הם בפוקוס (עוצמת האות המקסימלי) על כימות עוצמת. הערה: אולי בגלל הבדלי צבע זמינות, lysosomes של תאי המעי האחורי ישירות אל הלוע לשמור על cDCFDA מכתים בעוצמה ללא התחשבות גנוטיפ או גיל, ומכאן להקפיד להימנע הדמיה lysosomes בתאים אלה.</li>
		<li>תמונה של השקופית המכילה 2 בן יום פראי סוג ש-n2 תולעים קודם. תוך כדי כך, להתאים את הפרמטרים הדמיה קונאפוקלית כגון עוצמת הלייזר, חריר, הצמצם כדי להבטיח כי cDCFDA מכתים בעוצמה הוא לא רווי. הערה: לאחר קביעת הגדרות אלה, אינם משנים אותם למשך כל ההדמיה ליום הזה.</li>
		<li>לכידת תמונות 1024 x 1024 פיקסלים של מטוס בודד של המעי (3 עד 4 תמונות לכל תולעת) באמצעות 60 X עדשת הגדלה. הערה: ספקטרום הפליטה cDCFDA בעיר וורמס תניב לשיא בולט יחיד-520 nm בד בבד עם שלה פלורסצנטיות דווח על הספקטרום20, המספקת הבדיקה אות מסוים כי הוא נבדל autofluorescence מעיים (איור 3).</li>
		<li>לייצא תמונת raw קונאפוקלית (קבצי. .lsm) .tiff קבצים לכל ערוץ.</li>
		<li>לאחר מכן, פתח ImageJ ולחץ על קובץ | פתח כדי לפתוח את קובץ התמונה כדי ניתן לכמת. לאחר טעינת התמונה, להשתמש בכלי בחירת צורת אליפסה ב ImageJ כדי לבחור אזור בעל עניין (ROI).</li>
		<li>לאחר מכן, לחץ על נתח | מדד לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור זה רועי. בחר 4 – 5 lysosomes בפוקוס שונה לכל תמונה, לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי הממוצע של כל אזור בעל עניין (ROI).</li>
		<li>עבור כל תמונה, למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע באזור המעי בין lysosomes. להחסיר את ערכי העוצמה של קרינה פלואורסצנטית רקע מ ערכי העוצמה של זריחה lysosomal.</li>
		<li>בסך הכל, לאסוף את הערכים הבודדים בסביבות 30 עד 50 מנורמלת עבור עוצמת cDCFDA (בעלי חיים 6 עד 10) עבור כל זן נבדק. השתמש בערכים אלה כדי להתוות מגרש משערה ותיבת באמצעות תוכנה סטטיסטית המתאים. הערה: צביעת יכול להשתנות במידה ניכרת בהתאם גורמים כמו טמפרטורה, זמן הדגירה, הבריאות/עידן הכוללת של בעלי חיים כך השוואות עוצמת קרינה פלואורסצנטית הרלוונטיים רק בתוך דגימות בתהליך הניסוי מכתימים אותה. לכן חשוב לעבד את הפקדים בכל ניסוי מוכתמים. לחשב הבדלים סטטיסטיים (t-בדיקות) באמצעות תוכנה סטטיסטית המתאים.</li>
		<li>כל תמונה זנים מאותו הניסוי (מוכתם באותו יום) ברצף, מקפיד לא לשנות הפרמטרים הדמיה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li>
<li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2758740/">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li>
<li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li>
<li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+the+importance+of+maintaining+%26%2334%3Bclean%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: the importance of maintaining &#34;clean&#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li>
<li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li>
<li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+amyloid+formation%2C+and+neurodegeneration%3A+a+critical+role+for+molecular+chaperones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10806201">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li>
<li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li>
<li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li>
<li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li>
<li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+function+and+dysfunction%3A+mechanism+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li>
<li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">How do intracellular proteolytic systems change with age?</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10767573">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li>
<li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((btn1%2C+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3%2C+regulates+vacuole+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/?report=reader">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li>
<li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li>
<li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li>
<li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li>
<li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging%3A+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li>
<li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8%2B+T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li>
<li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li>
<li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+basis+of+lipofuscin%2C+ceroid%2C+and+age+pigment-like+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li>
<li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

מגוון רחב של אירועים תאית ומולקולרית לתרום הזדקנות, מושפע תכונות היסטוריית החיים וגורמים גנטיים. המחקר האחרון שלנו22 מרמז כי מחזור הרבייה ממלא תפקיד חשוב בשליטה על הכושר של סומא באמצעות ויסות lysosomal pH dynamics. הראנו שאת proteolysis lysosomal בתיווך הוא קידם בעוד חיות להתרבות באופן פעיל על ידי קולטנים upregulation של v-ATPase שעתוק, אשר בתורו מבטיח lysosomes חומצי. עם סיום רבייה, טיפות הביטוי v-ATPase, lysosomes alkalinize, אגרגטים חלבון להצטבר בתאים אלה.
הפרעות שפו...

המראה של אגרגטים חלבון מקובל להיות סימן היכר של הזדקנות התאים האיקריוטים1,2,3, היווצרות אשר נחשבת בקרב הנהגים עיקרון של הזדקנות ביולוגית הסלולר4 , 5 , 6 , 7. גדל ראיות כי כמו תאים גיל, פירוק חלבון פגום, מובילה לעלייה צבירת חלבון. נפילת proteolysis ב הזדקנות תאים כרוך ליקוי autophagy8 , כמו גם חלבון בתיווך פרוטאוזום השפלה9. לבסוף, חמצון החלבון בלתי הפיך הוא גדל בתאים הישנים, בהמשך ופוגע קטבוליזם חלבון10.
Autophagy. בהתחלה חשבו להיות תהליך לא בררניים עבור השפלה בכמות גדולה של חלבונים פגומים, אבל מחקרים אחרונים הראו ש-autophagy הזה הוא סלקטיבי מאוד קטבוליזם של אגרגטים חלבון לקוי organelles שאינם נוטה השפלה באמצעות מנגנוני אישור11האחרים חלבון. במהלך התהליך של autophagy, חלבונים פגומים, צבורים הן מבודדות לתוך שלפוחית כפול-הממברנה קרא את autophagosome. ואז, autophagosome הזה בין עם organelles חומצי בשם lysosomes, אשר מוביל השפלה של מטענים autophagosome12. Lysosomes מייצגים את מובילים של הנתיב autophagic ולהשתתף תהליכים תאיים שונים כגון תיקון קרום, בקרת גנים ברמת השעתוק חישה מזין; הדגשת תפקידם מרוכזת של הומאוסטזיס הסלולר (שבתוך הפניה למעורר 13). מספר מחקרים הראו אסוציאציה בין תלויי-גיל ירידה בתפקוד lysosomal הפרעות ניווניות שונות13. באופן עקבי, שחזור פונקציה lysosomal בתאים בוגרים יכולים לעכב את התחלתה של זיקנה פנוטיפים14,15. מחקרים של ההרכב של הסביבה שבה התרחשה intralumen מראים כי קריסת פונקציית lysosomal תאים בוגרים אינה עקב ירידה בייצור של פרוטאזות lysosomal16. לחלופין, שהוא הוצע כי אובדן intralysosomal חומציות, דרישה קריטי של פעילותה אנזימטיות, עשויה ביסוד ירידה בתיווך ליזוזום proteolysis17. כדי שתוכל לחקור את השערה זו, זה חיוני לפתח נוגדנים ופרוטוקולים כדי לחקור דינאמי לשינויים lysosomal pH של תאים חיים בצורה עקבית לשכפול.
המעי של C. elegans הוא הרקמה חילוף החומרים העיקריים בעיר וורמס וזה מווסת קריטי של הומאוסטזיס מערכתית ואת תוחלת החיים. פיתחנו מבחני להעריך את השינויים בהחומציות של לומן של lysosomes מעיים של תולעים כדי לקבוע כיצד בתיווך ליזוזום proteolysis תורמת להזדקנות. למרות fluorophores pH רגיש שימשו בעבר C . elegans כדי לסמן lysosomes מעיים, לא עוד היה מאמץ כדי לבסס פרוטוקול מוצלח שיכול לזהות עליות קטנות ב- lysosomal pH ויוו18. כאן, אנו מספקים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות אובדן של חומציות lysosomal בתאים מעיים של C. elegans באמצעות פרוטוקול האכלה פשוטה ונוחה המשלבת של pH רגיש fluorophore (cDCFDA) למזון OP50.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>מרכז הגנטיקה של Caenorhabditis</td><td>הזמנה מקוונת בכתובת https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td>5(6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>הידוע בכינויו cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one ו-(3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>הידוע בכינויו Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscope (למשל Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>הורדה בחינם מ-https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB אבקת מרק</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>אבקת כולסטרול</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי החלקות</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr> מראה <tr><td>חממה</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>או משטח</td><td></td><td></td><td></td> שטוח חלק אחר</tr></tbody></table>

הערכת alkalinization lysosomal ב המעי של חיים caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא מערכת מודל זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אריכות ימים מסלולים התפתחותית. מחקרים כאלה מתבצעים על ידי השקיפות של החיה, היכולת להעביר ולהפוך מבחני גנטי, הקלות היחסית ביצירת החלבונים fluorescently שכותרתו, השימוש של צבעי פלורסנט, זה גם יכול להיות microinjected לתוך המוקדמת העובר או שולבו אוכל שלה (e. coli זן OP50) כדי להדביק תווית organelles הסלולר (למשל 9-diethylamino-5 שעות-benzo (א) phenoxazine-5-1 ו (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). כאן, אנו מציגים את השימוש ה-pH רגיש הפלורסנט זה כתמים lysosomes מעיים, מתן של הבדיקה חזותית של שינויים דינמיים, פיזיולוגיים של חומציות lysosomal תולעים בשידור חי. פרוטוקול זה לא למדוד lysosomal pH, אבל מעדיף שואפת להקים שיטה אמינה של הערכת פיזיולוגיים וריאציות הרלוונטיים ב lysosomal חומציות. cDCFDA הוא תרכובת תא-permeant המרת ניאון fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) על הידרוליזה על ידי תאיים esterases. פרוטונציה בתוך lysosomes מבצע השמנה cDCF ב organelles האלה, איפה זה מצטבר. עקב pKa שלה נמוכה של 4.8, צבע זה שימש חיישן ה-pH של שמרים. כאן נתאר את השימוש cDCFDA כתוספת מזון כדי להעריך את החומציות במעיים lysosomes ב C. elegans. טכניקה זו מאפשרת איתור lysosomes alkalinizing בבעלי חיים, , יש מגוון רחב של יישומים ניסיונית כולל מחקרים על הזדקנות autophagy, lysosomal להן.

cDCFDA כתמים lysosomes באופן תלוי-pH, ומאפשרת שלה נמוך pKa, ספיגת מוכן לתוך lysosomes של חיישן ה-pH אידיאלי21. cDCFDA מכתים בעוצמה הוא ביחס הפוך ל18,lysosomal pH (קרי מכתימים בעוצמה מתגבר ככל pH יורדת)22. cDCFDA אותות חלשים באופן עקבי lysosomes של בעלי החיים מטופלים עם 20 מ מ כלורוקין, מעכב של lysosomal acidification, וכן תולעים של v-ATPase, החלבונים על הקרום של lysosomes הנדרשת עבור ייבוא פרוטון<s...

מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך אובדן יחסי של חומציות ליזוזומלית בליזוזומי המעי של C.elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האוטופגיה על ידי מתן מידע עקיף על תפקוד ליזוזומלי ופירוק חלבונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, זולה, נוחה וניתנת לשחזור.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר צפינו בטכניקת הצביעה המשמשת להערכת אלקליניזציה ואקואולרית בשמרים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון ששלבים מסוימים, כגון הוספת cDCFDA למזון OP50 ובקרת הדמיה של תולעים מסוג בר בנות יומיים הם קריטיים. לאחר הכנת צלחות ה- NGM, הניחו לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך יומיים כשהמכסה סגור.לאחר מכן, חסנו את חיידקי ה-OP50 במרק לוריא הסטרילי. לאחר החיסון, השאירו את החיסון באינקובטור עד שה-OD יהיה בין 0.2 ל-0.4. לאחר מכן, הניחו טיפה של חיסון OP50 במרכז צלחת ה-NGM היבשה.לאחר מכן, השתמש במפזר כדי לפזר את החיסון במדבקה בערך שניים על שני סנטימטרים. בערך לאחר 15 דקות, הפוך את צלחת ה-OP50 לאחר שהחיסון התייבש. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות.לאחר סיום הדגירה, העבירו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. לאחר מכן, הכינו מלאי עבודה של 10 מילי-מולרי cDCFDA במאגר M9. אחסן את תמיסת cDCFDA הרחק מהאור במינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של 10 מילי-מולר

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מקור: לה, ט. א. נ., ואחרים, מדידת השפעות חיידקים וכימיקלים על חדירות המעיים של Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לכמת חדירות המעי ב-C. elegans שנחשפו ל-Pseudomonas aeruginosa. בהשוואה לביקורת שקיבלו Escherichia coli, תולעים שטופלו בפתוגן מראות דליפת פלואורופור מוגברת לחלל הגוף, מה שמעיד על נזק למחסום האפיתליאלי.

הערכת חדירות המעי ב-C. elegans לאחר חשיפה לחיידקים

סרטון וידאו זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת לקטט בליזטים של תאים באמצעות האנזים לקטט דהידרוגנאז. אנזים זה ממיר לקטט לפירובט, יחד עם המרה של NAD ל-NADH שמגיב עם צבעי טטרזוליום ונותן תוצר צבעוני שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית כדי לכמת את הלקטט.

בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

התעלה excretory C. elegans הוא מודל תא בודד ייחודית לניתוח חזותי ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן. פרוטוקול זה מתאר שילוב של גישות, וישימה זיהוי ואפיון של מולקולות בימוי חד־תאיות tubulogenesis, הפסגה להן קרום ו לומן סטנדרטי גנטי/RNAi והדמיה.

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

נתאר החילוץ בקנה מידה קטן שונה ואת מבחני ערכי צבע מוחלטים של ו לקטט פירובט ב תולעים נימיות C. elegans. כאשר ניצול מסחרי assay ערכות, פיתוח טכני של הרגישות והדיוק שלהם חשובה. חלבון משקעים החילוץ הוא השלב הקריטי ביותר של הקביעה כמותית של מטבוליטים תאיים.

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה סלקטיבית ונטולת תווית של moieties כימיים ספציפיים והיא שימשה ביעילות כדי לדמות מולקולות השומנים ב vivo. כאן, אנו מספקים היכרות קצרה עם העיקרון של מיקרוסקופיה SRS ומתארים שיטות לשימוש בו באחסון השומנים הדמיה ב Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

הוראת המדעים הביולוגיים יכולה להיות מגרה יותר עבור התלמידים באמצעות שימוש בניסויים. כתב יד זה מציג שני פרוטוקולים שונים אך משלימים שניתן להשתמש בהם בכיתה כדי לעודד תלמידים לנסח ולבדוק השערות הקשורות לתזונה עתירת קלוריות, רעב והזדקנות.

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans

למדו להעריך אלקליניזציה ליזוזומלית במעי של Caenorhabditis elegans באמצעות צביעת cDCFDA. שיטה זו פשוטה, זולה ושימושית למחקר אוטופאגיה ופונקציה ליזוזומלית.

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים