סריקת שקופיות אוטומטיים, פילוח ברקמות שכותרתו Fluorescently באמצעות מערכת ניתוח Widefield גבוהה-תוכן
3 במאי 2018
כאן נתאר פילוח אוטומטיות של רקמות fluorescently עם תוויות עבור פרוטוקול על שקופיות באמצעות מערכת ניתוח תוכן גבוהה widefield (WHCAS). פרוטוקול זה יש יישומים נרחב בכל תחום אשר מערבת את כימות של סמני פלורסנט ברקמות ביולוגיות, לרבות מדעי הביולוגיה, הנדסה רפואית, מדעי הבריאות.
המטרה הכוללת של שיטת הדמיה וניתוח זו היא ליצור זרימת עבודה קלה להגדרה לפילוח אוטומטי של כל דגימת רקמה המותקנת על שקופיות עם תווית פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי הביולוגיה לגבי כמה מחלבון נתון נמצא באזור ספציפי של דגימת רקמה מעניינת. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לחסוך את פרוטוקולי אופטימיזציה של הזמן לפילוח אוטומטי, מה שמאפשר ליישם שיטה זו על דגימות רקמה המותקנות על שקופיות עם תווית פלואורסצנטית.
הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהיינו צריכים לכמת תאים חדשים ברקמת המוח בהגדלה גבוהה. לאחר ייבוא היומן, פתח את תיבת הדו-שיח הגדרת רכישת לוחית ופתח את הכרטיסייה מטרה ומצלמה. הגדר את ההגדלה לארבע פעמים, את שילוב המצלמה לאחד ואת הרווח לשתיים.
פתח את הכרטיסייה סריקת שקופיות צלחת והזן את הגדרות הניסוי המתאימות. תחת הכרטיסייה אתרים לביקור, מלא את הבארות באופן אחיד באתרים ופתח את הכרטיסייה ערוך הגדרות תחתית לוחית כדי להזין את ערכי הניסוי המתאימים. לאחר שמירת הגדרות אלה כהגדרה A, פתח את הכרטיסייה מטרה ומצלמה והגדר את ההגדלה ל-40 פעמים, את המצלמה ל-1 ואת ה-Gain ל-2.
ודא שכל ההגדרות תחת הכרטיסיות סריקת שקופיות צלחת וערוך הגדרות תחתית צלחת זהות לאלה שהוזנו עבור הגדרה א.ופתח את לולאת הרכישה. הזן את מספר אורכי הגל הקיימים בדוגמה וסמן את אפשר מיקוד מבוסס לייזר ואפשר אפשרויות מיקוד מבוססות תמונה. לאחר מכן שמור הגדרות אלה כהגדרה ב'.לאחר מכן, הנח עד שלוש שקופיות, החלקת המכסה פונה כלפי מטה עם התווית בצד החריץ לתוך מתאם השקופיות.
ולחץ F4 כדי לפתוח את התפריט הראשי. בחר סריקת שקופיות ולחץ על פתח דלת הוצאת שקופית כדי להכניס את מתאם השקופיות למערכת ניתוח התוכן הגבוה של השדה הרחב. לאחר מכן לחץ על סגור שקופית טעינת דלת.
כדי להתחיל, ודא שנבחר אורך הגל המתאים. עבור לאתרים שונים בתוך תמונת התכונה החיה עד לאיתור אזור העניין. התמקדו באזור.
אם הוא אינו ממוקד, השתמש בלחצן המיקוד האוטומטי או התאם את גודל הצעד עד שהוא יהיה ממוקד. השתמש בהצמדה כדי ללכוד את התמונה, אם אתה מכוונן את המיקוד באופן ידני על-ידי שינוי גודל הצעד. כדי להגדיר סריקה קודמת, טען תחילה את הגדרה A ובחר תצוגה מקדימה של שקופיות.
ציין את מספר השקופיות ובחר אישור. בחר ארבע פעמים כהגדלה. לאחר מכן בחר Coverslip Down והמשך לבחור את הגדרות הבסיס שלך עבור הסריקה הקודמת. ודא שגם הגדרת הרכישה וגם הכיולים מסומנים לפני שתבחר ביטול ולחץ על המשך.
תחת הכרטיסייה W1:DAPI, לחץ על שידור חי ולאחר מכן, חשיפה אוטומטית, ואחריה הצמד. לאחר מכן, לחץ על סגור. בחר את הספרייה והזן שם סריקה קודם.
תיבת הדו-שיח אזור ציור תופיע באופן אוטומטי. השתמש בכלי האזור המלבני כדי לבחור את כל אזור הסריקה הקודם ולחץ על Continue. בסיום הסריקה הקודמת, טען את הגדרה B ופתח את הכרטיסייה אתרים לביקור.
כדי להתחיל, ודא שנבחר אורך הגל המתאים. עבור לאתרים שונים בתוך תמונת התכונה החיה עד לאיתור אזור העניין. התמקדו באזור.
אם הוא אינו ממוקד, השתמש בלחצן המיקוד האוטומטי או התאם את גודל הצעד עד שהוא יהיה ממוקד. השתמש בהצמדה כדי ללכוד את התמונה, אם אתה מכוונן את המיקוד באופן ידני על-ידי שינוי גודל הצעד. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה W1 DAPI, לחץ על חשיפה אוטומטית וודא שתמונת ה- DAPI של רכישת לוחית היא חדה.
תחת התפריט הראשי, לחץ על יומן ובחר הפעל יומן בתפריט הנפתח. לחץ פעמיים על יומן ההתקנה של רכישת אזור שקופית כדי להפעיל ולחץ על המשך כאשר תיבת הדו-שיח הגדרת רכישת אזור שקופית מופיעה. כשתקבל הוראות, בחר בסריקת DAPI כדי לבחור את תמונת השקופית בהגדלה נמוכה ולחץ על אישור. כאשר תתבקש להזין את הצמד Plate Acquisition, סמן את Plate Acquisition Snap-DAPI ולחץ על OK. כשהתיבה Create or Load Regions מופיעה, השתמש בכלי Rectangular Region כדי לבחור את אזורי העניין בסריקת DAPI ולחץ על Continue.
באמצעות כלי האיתור, סמן את אזור העניין ולחץ על המשך, תחת תיבת הדו-שיח בחירת אזור. כאשר התיבה אשר אזורים מופיעה, לחץ על המשך והחלט אם יש לשמור את האזור כאשר תיבת הדו-שיח שמירת אזורים מופיעה. יופיעו שלוש תיבות דו-שיח.
לחץ על המשך כדי לסגור את התיבה ההתקנה הושלמה. כדי למנוע ניחושים במציאת אתרים לדוגמה, ודא שהצגת תמונות במהלך הרכישה תחת הכרטיסייה הגדרות תצוגה מסומנת ופתח את הכרטיסייה סיכום כדי ללחוץ על רכוש לוחית כדי למקם את הבמה של אזור העניין שנבחר מראש. כשהמצלמה עוברת מעל אתר הכולל את התאים המעניינים, לחצו על 'ביטול' כדי לעצור את רכישת התמונה.
אל תיבהל אם התמונה אינה ממוקדת. שלב זה נועד אך ורק למקם את הבמה של האתר הראשון באזור העניין שבחרת. ודא שהשלב ממוקם מעל הדוגמה ושהזנת את מספר האתרים כראוי.
מטב את הגדרות אורך הגל כדי להבטיח שמתקבלת תמונה ממוקדת בטווח דינמי גבוה. לאחר מכן, פתח שוב את הכרטיסייה סיכום ולחץ על רכוש לוחית. בסיום הניתוח, בחר בכרטיסיה תצוגה.
בתפריט הנפתח שכבת-על של תמונה, בחר הצג מידע באר כדי להציג את מספרי האתרים בפינה הימנית העליונה. גלול בין האתרים והוצא מכלל שימוש באתרים שאינם ממוקדים ו/או מכילים קפלי רקמה או בועות וקרעים ברקמה. בתמונה מייצגת זו מוצגות תמונות ממוזערות בהגדלה גבוהה של כל האתרים באזור העניין המוגדר.
יש לסקור כל אתר כדי לזהות את האתרים שיש להחריג מהניתוח. לדוגמה, בניסוי זה, אתר 149 היה מחוץ למוקד, אתר 219 הכיל בועות, ואתר 54 הכיל קפל. כל שלושת האתרים הללו לא נכללו בניתוח.
כאן, שכבות-על תואמות שנוצרו על ידי מודול ניקוד התאים הרב-אורכי גל מדגימות את תוצאות הפילוח האוטומטי שבוצע באתר 59 כפי שהותאמו אישית על פי מפרטי הניסוי. לאחר הפילוח ניתן לקבל את הנתונים הכמותיים של שיעור התאים הצבועים חיובי עבור כל סמן, שני הסמנים, ללא סמנים, שטח מוכתם ממוצע ועוצמת הקרינה הממוצעת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר את מערכת ניתוח התוכן הגבוה שלך בשדה הרחב כדי ליצור זרימת עבודה אוטומטית להדמיה ופילוח של דגימת רקמה המותקנת על שקופית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לסגמנטציה אוטומטית של רקמות המסומנות פלואורסצנטית באמצעות מערכת ניתוח בעלת תוכן גבוה בשדה רחב (WHCAS). שיטה זו מייעלת את הכימות של סממנים פלואורסצנטיים ברקמות ביולוגיות, ובכך תורמת לתחומים שונים, ביניהם מדעי הביולוגיה וההנדסה הרפואית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי הביולוגיה
- הנדסה רפואית
- מדעי הבריאות
רקע
- סגמנטציה אוטומטית משפרת את הניתוח של רקמות המסומנות פלואורסצנטית.
- מערכות ניתוח בעלות תוכן גבוה (High-content analysis) מאפשרות דימוי מפורט של דגימות ביולוגיות.
- כימות של חלבונים בדגימות רקמה הוא חיוני להבנת תהליכים ביולוגיים.
- שיטה זו פותחה כדי לתת מענה לאתגרים בכמות התאים החדשים ברקמת מוח.
מטרת המחקר
- ליצירת תהליך עבודה יעיל לסגמנטציה אוטומטית של דגימות רקמה.
- לשיפור הדיוק והמהירות של כימות סמנים פלואורסצנטיים.
- לספק פרוטוקול סטנדרטי שניתן ליישום על סוגי רקמות שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של מערכת ניתוח תכנים גבוהים (high-content analysis) בשדה רחב לצילום.
- הגדרת תנאי ניסוי לצילום אופטימלי.
- שימוש בכלי תוכנה לרכישת תמונות ולניתוחן.
- יישום של טכניקות פוקוס אוטומטי ומיקוד מבוסס תמונה.
תוצאות עיקריות
- הושגה סגמנטציה מוצלחת של רקמות המסומנות פלואורסצנטית.
- דימוי בהגדלה גבוהה סיפק מבטים מפורטים של דגימות הרקמה.
- אזורי עניין (Regions of interest) זוהו ונותחו במדויק.
- נקבעו קריטריונים להדרה של תמונות שאינן במיקוד או תמונות פגומות.
מסקנות
- פרוטוקול הסגמנטציה האוטומטי מקצר משמעותית את זמן האנליזה.
- ניתן ליישם שיטה זו על מגוון רחב של רקמות ביולוגיות.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את המחקר בתחומים מדעיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקה וסגמנטציה אוטומטית של סליידים באמצעות מערכת ניתוח רחבת שדה בעלת תוכן גבוה (WHCAS) פותרת את צוואר הבקבוק בכימות סמנים פלואורסצנטיים בחתכי רקמה גדולים, ומאפשרת ניתוח בר-שחזור ובעל תפוקה גבוהה לצורך תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות. באמצעות סטנדרטיזציה של תהליכי רכישת תמונות וסגמנטציה, שיטה זו מפחיתה שונות ומאיצה את ההערכה הפרה-קלינית של ביומרקרים מבוססי רקמה, ובכך תומכת בקבלת החלטות go/no-go מבוססות נתונים בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות דפוסי ביטוי של חלבונים ברקמות הרלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: מפחית את הזמן המוקדש לאופטימיזציה של פרוטוקולים עבור ניסויים בודדים, ומאפשר יישום מהיר על פני מספר מטרות המסומנות פלואורסצנטית.
- ערך חזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות קריאות כמותיות ועקביות של לוקליזציה של סמנים ושל רמות ביטוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לבדיקות סריקה המשך, באמצעות יצירת תמונות רקמה מקובעות ומסגמנטות המתאימות לבדיקות בעלות תוכן גבוה (high-content assays).
- ערך תפעולי: שיפור הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות בחירה אוטומטית של אזורים והדרה של אתרים פגומים (למשל, רקמה לא ממוקדת, מקופלת או עם בועות).
- סקילביליות (יכולת הרחבה): מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה עבור סממנים וסוגי רקמות מגוונים, באמצעות מודולי תוכנה מובנים למיקום חלבונים, פרוליפרציה, חיוניות, אפופטוזיס ואנגיוגנזה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומר על עקביות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי אספקת נתונים כמותיים לגבי פרופורציות של תאים חיוביים לסמן, שטח צביעה ממוצע ועוצמת פלואורסצנציה.
- קידום מותאם סיכון: תומך בקבלת החלטות פרה-קליניות באמצעות אספקת מערכי נתונים אמינים ומסוננים מהחרגות, המשקפים סיגנל ביולוגי אמיתי.
- מערכת רלוונטית למחלה: הוכח כי השטתו ישימה בניתוח רקמות של גידולי מוח, עם יכולת הרחבה לכל סמן גרעיני או ציטופלזמי מסומן פלואורסצנטית ברקמות המעוגנות על סלייד.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי מוביל ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשרת ניתוח רקמות סטנדרטי בכל שלב.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי כימות ביטוי של סמנים באזורי רקמה ספציפיים בעלי עניין.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות סגמנטציה אוטומטית ופלט כמותי המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות בין אתרים שונים.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות מדידות הכוללות את שיעור התאים החיוביים, שטח צביעה ממוצע ועצימות פלואורסצנציה ממוצעת, המאפשרות השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי אספקת נתוני רקמה כמותיים המותאמים לסממנים ביולוגיים ומתאימים למחקרי תיקוף.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כבסיס ליכולת הניתנת לשימוש חוזר בפרויקטים שונים, תוך מינוף מודולי תוכנה מובנים והגדרות שמורות (Setting A and B) לסריקת סליידים וסגמנטציה עקביים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף מטרות, הפחתת עמימות מכניסטית במערכי בדיקה מבוססי רקמות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה (scalability) של תהליכי עבודה לדימות וניתוח רקמות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go), יעילות הונית באמצעות צמצום זמן אופטימיזציית הפרוטוקול, והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נתוני רקמות כמותיים שעברו תיקוף שלל (exclusion-validated).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול מערכת ניתוח רחבת-שדה בעלת תוכן גבוה (widefield high-content analysis) ובניווט בתוכנה הנלווית.
- תלוי במכשור המסוגל לבצע סריקת סליידים, רכישת תמונות באורכי גל מרובים, ומיקוד מבוסס לייזר ותמונה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרות הרכישה (למשל, הגדלה, binning, gain) ופרוטוקולים להגדרת אזורי עניין (region-of-interest).
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על סוגי רקמות שונים, ביטויי סממנים או עוביים שונים של הסלייד.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך להסיר ידנית אתרים עם ארטיפקטים (למשל, תמונות לא ממוקדות, קיפולי רקמה, בועות) למרות הרכישה האוטומטית.
