Name: זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: למד טכניקת RNA in situ hybridization חדשנית לזיהוי קולטן דופמין D1-alpha בגרעין האקומבנס של מוח עכברוש. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מולקולות RNA בודדות וחשיפת הבדלי ביטוי מגדריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודות הנוכחי נתמכו על-ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים HD043680, MH106392, DA013137 ו- NS100624. קרן חלקית סופק על ידי מענק הכשרה NIH T32 במדעים ביו-רפואית-התנהגותי.

פרוטוקול נסיוני אושרה על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC)-מאוניברסיטת דרום קרוליינה (אבטחת פדרלי מספר: A3049-01).
1. הכנת חלקים במוח קפוא טרי
<ol><li>להשתמש המתח F344/N עכברוש: חולדות שלושה מכל מין, גוף 13 חודשים של גיל, משקל כ 320 גרם.</li>
	<li>התאם את הריכוז sevoflurane 5% (יתר של sevoflurane). המשך החשיפה sevoflurane לאחר נשימה עוצר לרגע נוסף.</li>
	<li>לערוף את החולדה, מסירים את המוח.</li>
	<li>להטביע את המוח חולדה בחנקן נוזלי 15 s בתוך 5 דקות של רקמות הקציר.</li>
	<li>Equilibrate המוח ל-20 ° C ב- cryostat לשעה.</li>
	<li>לחתוך 30 מיקרומטר מקטעים ולהעביר אל מגלשות (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לבחור קטעים מתוך האזור גרעין האקומבנס, כ- 2.76 מ"מ עד מ"מ 2.28 והשתרשה עמוק בלבה Bregma14.</li>
	<li>ללא הרף פורסים את מוח עכברוש מן הנורה הריח דרך האזור גרעין האקומבנס על פי מבנה המוח stereotaxic של העכברוש.</li>
	<li>הר דוגמאות על השקופיות. שמור את הסעיפים ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לייבוש.</li>
	<li>מיד לטבול שקופיות paraformaldehyde 4% צוננת מראש עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מקם את השקופיות הצבע אתנול הגוברת בטמפרטורת החדר (RT): 50% EtOH במשך 5 דקות; 70% EtOH במשך 5 דקות; ל- 100% EtOH במשך 5 דקות.</li>
	<li>. אני חוזר עם טרי 100% EtOH.</li>
	<li>במקום שקופיות על נייר סופג, אוויר יבש.</li>
	<li>לצייר חיץ סביב כל מקטע עם עט מכשול (ראה טבלה של חומרים). תן את מחסום יבש לחלוטין עבור 1 דקות.</li>
</ol>2. רעלני סעיפים המוח
<ol><li>להדליק את התנור והגדר את הטמפרטורה 40 ° C.</li>
	<li>להוסיף 3 טיפות (90 µL) של ריאגנט רעלני 4 (ראה טבלה של חומרים) על כל המוח מקטע (מקטע אחד לכל שקופית).</li>
	<li>דגירה הסעיפים למשך 30 דקות ב- RT.</li>
	<li>להטביע את השקופיות עבור 1 דקות ב- RT. חוזר עם PBS טרי 1 x 1 x PBS. הערה: שקופיות לא צריך להיות ב- PBS 1 x יותר מ 15 דקות.</li>
</ol>3. RNA מולטיפלקס פלורסנט בחיי עיר הכלאה Assay
<ol><li>החללית היעד עבור 10 דקות ב 40 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים חמים ולאחר מכן להצטנן עד RT.</li>
	<li>מקום הכימית RNA (למשל, כח 1-4 FL)-RT.</li>
	<li>הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המכשיר Drd1α (C1) על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 2 h ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.</li>
	<li>הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 1-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להטביע שקופיות במאגר שטיפת 1 למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם מאגר 1wash טריים.</li>
	<li>הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 2-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.</li>
	<li>הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 3-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.</li>
	<li>הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 4-FL-Alt A על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.</li>
	<li>הסרת עודפי נוזלים משקופיות ומניחים מיד 2 טיפות של ריאגנט הרכבה (ראה טבלה של חומרים) על גבי כל מקטע.</li>
	<li>מקום coverslip 22 מ"מ 22 מ מ (ראה טבלה של חומרים) מעל כל מקטע המוח.</li>
	<li>לאחסן שקופיות בחושך ב 2-8 ° C עד יבש.</li>
	<li>הפעלת מיקרוסקופ קונפוקלי ולעבור מטרה X 60.</li>
	<li>להשיג תמונות Z-מחסנית עם מיקרוסקופ קונפוקלי. ראו את הוידאו משלימה לניתוח מפורט של הדמיה קונפוקלי.</li>
	<li>לרכוש תמונות של Drd1α עם התווית תאים באזור גרעין האקומבנס (עירור: 488 ננומטר; פליטה: 515/30 ננומטר). הערה: אל תתנו את המוח מקטעים לייבש בין השלבים הדגירה.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>באופן כמותי למחצה לנתח את התבנית מכתימים: "דיסקרטית נקודות".<ol>
<li>כדי לזהות את תא בודד מתוך התמונה, לבצע דאפי מכתים כסמן גרעינית. עם זאת, עדיין קשה לנתח חלקים מסוימים של רקמת המוח, שכן יש סוגים שונים של תאים עם צורה לא סדירה של גרעינים ו/או תאים. . הנה, שני חוקרים מנוסים להקצות בנפרד בכל תא מתמונות להגדרת אזור תא.</li>
		<li>מבחינה ויזואלית ניקוד לכל תא בתוך הדימויים קונאפוקלית ייצוגית המבוססת על מספר נקודות בכל תא באמצעות קריטריונים מסוימים (איור 1B).</li>
		<li>לקבוע את מספר התאים הכולל בכל קטגוריה ולחלק לפי מספר התא סך הכל x100 ליצירת גרפים התדירות היחסית המציגים את תדירות אחוז של תאים בתוך כל קטגוריה עבור כל מקטעי רקמת (איור 2 א) ועבור זכרים ונקבות בנפרד (2E איור).</li>
		<li>לחלק את הסכום של תאים בתוך כל הקטגוריות מוקדמת לפי מספר התא סך הכל x100 כדי לקבוע תדירות המצטברת של תאי רקמת כל המקטעים (איור 2B) ועל זכרים ונקבות בנפרד (2F איור).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מבחינה סטטיסטית לנתח את "הנקודות דיסקרטית" צביעת דפוס (אופציונלי).<ol>
<li>בדוק את מספר הנקודות בכל תא לספק קטגורית משתנה זה סודר בטבע (קרי, מספר התאים אשר מתחלקים בכל קטגוריה דרגה תא הנמוך הביטוי (1) לביטוי תא הגבוה ביותר (9)) עבור ניתוחים סטטיסטיים נוספים.</li>
		<li>לאחר בדיקה של סטטיסטיקה תיאורית, להשתמש שלוש גישות עיקריות: סטטיסטיקה האח-Haenszel, מבחן מאן-ויטני U ו מבחן Kruskal-איי ווליס. למרות הגישה סטטיסטי מדויק יהיה תלוי השאלה ניסיוני, עיצוב ומחקר של עניין, עץ ההחלטה סטטיסטי (איור 4) עשויים לסייע בקבלת החלטות בנוגע לגישה האנליטית של אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכמת את עוצמת האות באזור של הריבית (ROI) עבור צביעת דוגמת: "אשכולות".<ol>
<li>לחשב את עוצמת האות של כל תמונה באמצעות המשוואה הבאה: עוצמת אות = סה כ האינטנסיביות של רועי תמונה - (רקע ממוצע עוצמת × הכולל אזור בתמונה)</li>
		<li>לספור את המספר הכולל של תאים בתוך התמונה רועי כדי לחשב את הביטוי אות משוער בכל תא. קבוצה הבדלי עוצמת האות/תמונה, כמו גם את מספר התאים/תמונה יכול להיות מעניין לשקול מנגנונים שעשויים לתרום ההבדלים קבוצה ראיתי בתא/אות ביטוי (איור 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מבחינה סטטיסטית לנתח את "אשכולות" צביעת דפוס (אופציונלי).<ol>
<li>לבחון את האות הביטוי/התא כדי לספק משתנה רציף לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף. שימוש שתי הגישות, כולל מבחן t מדגם עצמאית השונות (ANOVA), בהתבסס על מספר גורמים בין הנושאים הכלולים העיצוב. עץ החלטה סטטיסטי (איור 4) עשויים לסייע בקבלת החלטות לגבי הגישה הסטטיסטית המתאימה ביותר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

ישנם שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה הרומן של הכלאה בחיי עיר פרוסות המוח מוקפאות להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc) וביטוי hydroxylase (ה) טירוזין באזור הסובסטנציה ניגרה (SNR). כמו כן אנו מספקים שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: "dot דיסקרטית" או "אשכולות".
השלבים הקריטיים קרינה פלואורסצנטית מולטיפלקס מוצלחת RNA בחיי עיר הכלאה assay הינם כלולים. לאחר עריפת ראשו העכברוש והסרה של המוח, להקפיא את המוח של חנקן נוזלי בתוך 5 דק לשמור הסעיפים המוח ב-20 ° C עד 4% p...

תפקוד לקוי של מערכת הדופמין striatal מעורב ההתקדמות של סימפטומים קליניים שנצפתה במספר מחלות נוירוקוגניטיבי. קולטני D1 דופמין נוכחים קליפת המוח הקדם חזיתית (PFC) והאזורים striatal של המוח ולהשפיע בכבדות תהליכים קוגניטיביים1, כולל עבודה זיכרון, עיבוד טמפורלית ו-2,קטר התנהגות3 , 4 , 5 , 6 , 7. מחקרים הקודם הובהר כי שינויים של קולטני דופמין D1 היו קשורים עם ההתקדמות של תשומת לב קשב (ADHD) הפרעת8, הסימפטומים נוירוקוגניטיבי סכיזופרניה9, 10 והלחץ הרגישות11. באופן ספציפי, בסכיזופרניה, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מחקרים ציינו כי היכולת מחייב של רצפטורים D1 דופמין cortices הקדם חזיתית היה מאוד קשור קוגניטיבית ואת נוכחותם של סימפטומים שליליים11. הגידול דנדריטים של נוירונים סינאפסות בתוך קליפת המוח הקדם חזיתית מוסדר על ידי רצפטור דופמין D1 מקלה על רגישות ללחץ. יתר על כן, נוקאאוט של קולטן D1 בנוירונים המדיאלי הקדם חזיתית בקליפת המוח (mPFC) יכול לשפר מפגינות הימנעות חברתית מפלה חברתית12.
כאן, אנחנו מציגים טכניקה הרומן של RNA בחיי עיר הכלאה להמחיש יחיד מולקולות RNA בתא עם דגימות רקמה מוקפאות. הטכניקה הנוכחית יש מספר יתרונות על פני שיטות הקיימות בתוך הספרות הנוכחי. ראשית, ההליך הנוכחי המשמרת את ההקשר המרחבי, מורפולוגיים של הרקמה, בוצעה על דגימות רקמה מוקפאות כך הליכים אחרים הדורשים טריים, רקמות-מוטבע יכול להיות משולב עם השיטות הנוכחי. נהלים דומים ברקמות פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע יש מאויר כי הרזולוציה שעתוק יחיד המתאפשר באמצעות של RNA בחיי עיר הכלאה טכניקה13. זיהוי של RNA ברמת שעתוק יחיד מספקת רגישות מעולה ביטוי מספר עותק נמוך, כמו גם את ההזדמנות להשוות ביטוי גנים ברמה של תאים בודדים, כי אינה יכולה להיות מושגת על ידי שיטות זיהוי חומצות גרעין אחרות, כגון טכניקות (PCR), תגובת שרשרת של פולימראז. בנוסף, השיטה הנוכחית שומרת על תמונות עם יחס אות לרעש גבוה דרך הגששים RNA ספציפי מאוד hybridized אל יעד בודד RNA תעתיקים, והוא מחויב ברצף עם מפל של מולקולות איתות הגברה זיהוי מערכת. לבסוף, הטכנולוגיה הנוכחי מספק הזדמנות להעריך את מספר מערכות ביולוגיות עם הגששים קניינית שלה במטרה, במקום להגביל את החקירה שלנו לכיתה אחת בלבד הקשורות למערכת סמנים כגון זיהוי חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה שיטות.
במחקר שלנו, השתמשנו הזה RNA הרומן בחיי עיר הכלאה להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc), טירוזין hydroxylase (ה) ביטוי הסובסטנציה ניגרה (SNR) של חולדות F344/N גם זכר וגם נקבה. RNA חדשני בחיי עיר הכלאה אפשרה לנו לחקור את המנגנונים המשפיעים על ספיגת DA והן שחרור דא בו זמנית, שיפור ההבנה שלנו של המורכבויות של המערכת striatal DA. כאן, אנו מתארים את ההליך עבור המוח קפוא טרי פרוסות ולספק שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: "dot דיסקרטית" או "אשכולות".

<table><tbody><tr><td>מערכת תנורים HybEZ</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת RNAscope - Rn-Drd1a</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td></td><td>ערוץ צבע 317031 1,</td></tr><tr><td>בדיקת RNAscope ירוקה - Rn-Th-C2</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>ערוץ צבע 2,</td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים פלואורסצנטיים של RNAscope</td> כתום<td>, אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge מעבדת וקטור עט מחסום הידרופובי</td><td></td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt אספקה וטרינרית</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek אנכי 24 מתלה שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מכתים Tissue-Tek</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>דיוק אמבטיות לשימוש כללי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>טיפול מקדים 4</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>320850</td><td>חלקי ערכות</td></tr><tr><td>ProLong Gold מגיב נגד דהייה</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>אמפר 1-FL</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>320850</td><td>חלקי ערכות</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>320850</td><td>חלקי ערכות</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>320850</td><td>חלקי ערכות</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>אבחון תאים מתקדם&nbsp;</td><td>320850</td><td>חלקי ערכות</td></tr><tr><td>חבילת תוכנה EZ-C1</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>גרסה 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td> <td>גרסה 9.4</td></tr></tbody></table>

זיהוי של דופמין קולטן d1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית rna בחיי עיר זיהוי

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

מערכת העצבים המרכזית, הקולטן סוג D1-אלפא (Drd1α) הוא הקולטן דופמין (DA) הנפוץ ביותר, אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות עצביים צמיחה והתפתחות. עם זאת, המנגנונים חריגות קולטן Drd1α תיווכה תגובות התנהגותיות, להתכוונן פונקצית זיכרון העבודה הם עדיין לא ברור. באמצעות ה-RNA הרומן בחיי עיר הכלאה assay, המחקר הנוכחי מזוהה דופמין Drd1α קולטן טירוזין hydroxylase (ה) RNA והביטוי של המעגלים הקשורות DA גרעין האקומבנס (NAc) אזור ואזור הסובסטנציה ניגרה (SNR), בהתאמה. Drd1α ביטוי ה-NAc מראה "דיסקרטית נקודה" צביעת דפוס. מין ברורים ההבדלים בביטוי Drd1α נצפו. לעומת זאת, תאנון מציג תבנית מכתימים "אשכולות". לגבי ביטוי TH, חולדות נקבות מוצגים ביטוי האות גבוה יותר בכל תא יחסית חיות זכר. השיטות המובאות כאן מספקים טכניקה הכלאה הרומן בחיי עיר חוקרת שינויים בתפקוד מערכת הדופמין במהלך ההתקדמות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

המחקר הנוכחי בחן של "נקודות דיסקרטית" צביעת דפוס להבעה RNA קולטני D1-אלפא דופמין (Drd1α) של ה-NAc בחולדות F344/N (איור 1 א'). אותות פלורסצנטיות בודדים זוהו בקלות, ניתן לראות יחיד "נקודות", שכל אחד מהם מייצג תעתיק רנ א יחיד בתוך התא. עבור תמונות של ה-NAc המציגים את "הנקודות דיסקרטית" צביעת דפוס, אנחנו העריכו את הטווח הדינמי של ביטוי באמצעות ניתוח כמותי למחצה (איור 1A, איור 2A&amp; 2B)...

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא גרעין האקומבנס חיוני שהבהרת בתפקוד קולטן D1 בזמן מחלה במערכת העצבים המרכזית. ביצענו את הרומן RNA בחיי עיר הכלאה assay להמחיש מולקולות RNA יחיד באזור ספציפי במוח.

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

המטרה הכוללת של בדיקת הכלאה חדשה זו של RNA באתרה היא לדמיין מולקולות RNA בודדות באזור ספציפי במוח שהן קריטיות להבהרת תפקוד לקוי של דופמינרגיה במהלך מחלת מערכת העצבים המרכזית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון הפרעות דופמינרגיות, תיווך תגובות התנהגותיות וויסות תפקוד זיכרון העבודה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת טכניקת הכלאה חדשה באתרה כדי לחקור תפקוד לקוי של מערכת הדופמין במהלך התקדמות מחלות מערכת העצבים המרכזית.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רמות הביטוי הכוללות של mRNA מטרה באזור נתון במוח, ניתן ליישם אותה גם כדי לקבוע כיצד תעתיקי mRNA מופצים בכל התאים של אזור נתון. כדי להתחיל בהליך זה, תוך חמש דקות לאחר קצירת מוח של חולדה בוגרת, טבלו אותו בחנקן נוזלי למשך 15 שניות. לאחר מכן, אזנו את המוח במינוס 20 מעלות צלזיוס בקריוסטט למשך שעה.לאחר שעה, חתכו חלקים של 30 מיקרון המכילים גרעין אקומבנס מ-2.76 מילימטרים ל-2.28 מילימטרים לפני ברגמה והרכיבו אותם על המגלשות. לאחר מכן יבש את החלקים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, טבלו את המגלשות ב-4% פרפורמלדהיד מקורר מראש למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הנח את השקופיות בשיפוע אתנול הולך וגדל בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העביר את השקופיות לאתנול טרי של 100% למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, הנח את השקופיות על הנייר הסופג כדי לאפשר ייבוש באוויר. צייר מחסום סביב כל קטע בעזרת עט מחסום.הניחו למחסום להתייבש לחלוטין למשך דקה אחת. כדי לטפל מראש בקטעי המוח, הפעל את התנור והגדר את הטמפרטורה ל-40 מעלות צלזיוס. הוסף שלוש טיפות של ריאגנט לפני הטיפול על כל חלק במוח.לאחר מכן דגרו את החלקים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טבלו את השקופיות ב-1X PBS למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר והעבירו את השקופיות ל-1X PBS טרי למשך דקה נוספת. שקופיות לא צריכות להישאר ב-1X PBS למשך יותר מ-15 דקות.כדי להפעיל את בדיקת המולטיפלקס, יש לחמם את בדיקת המטרה למשך 10 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס באמבט מים ולאחר מכן לקרר לטמפרטורת החדר. הנח את מגיב ה-RNA בטמפרטורת החדר. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות.לאחר מכן הוסיפו שלוש טיפות של ה-Drd1alpha כבדיקה על כל פרוסת דגימה ודגרו את הדגימות למשך שעתיים ב-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1X במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. לאחר מכן הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות.אל תתנו לחלקי המוח להתייבש בין שלבי הדגירה. הוסף שלוש טיפות של AMP 1FL על כל פרוסת דגימה ודגר את הדגימות למשך 30 דקות ב-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות. לאחר מכן, הוסף שלוש טיפות של AMP 2FL על כל פרוסת דגימה. דגרו את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, טבלו את השקופיות במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות. הוסף שלוש טיפות של AMP 3FL על כל פרוסת דגימה ודגר את הדגימות למשך 30 דקות ב-40 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות. לאחר מכן הוסיפו שלוש טיפות של AMP 4FL ALT A על כל פרוסת דגימה ודגרו את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.שטפו את השקופית במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. הסר עודפי נוזלים מהמגלשות והניח מיד שתי טיפות של מגיב הרכבה על כל חלק. לאחר מכן, הניחו כיסוי בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר מעל כל חלק במוח.לאחר מכן אחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עד לייבוש. לצורך הדמיה, הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ועבור למטרה של פי 60. השג תמונות מחסנית Z ורכוש תמונות של תאים המסומנים ב-Drd1alpha באזור גרעין האקומבנס.עבור תמונות מגרעין האקומבנס שהציגו את דפוס צביעת הנקודות הבדידות, טווח הביטוי הדינמי הוערך באמצעות ניתוח כמותי למחצה. כל תא קיבל ציון מאפס עד תשע על סמך מספר הנקודות לתא. שיטת ציון אות היברידית זו יכולה להעריך את ההיקף והשונות של ביטוי Drd1alpha על פני תאים בודדים.להלן התמונות הקונפוקליות המייצגות של ביטוי Drd1alpha בחולדות זכר ונקבה שיש להן דפוס צביעת נקודות בדידות. כדי לקחת בחשבון את מבנה הנתונים המקונן, ערכי ספירה ממוצעים חושבו עבור כל קטגוריה ושימשו לניתוח סטטיסטי. בדיקת Mann-Whitney U נערכה כדי להעריך את ההבדלים בספירת התאים החציונית בחולדות זכרים ונקבות.תדירות התאים בכל קטגוריה מנותחת באמצעות תדירות יחסית ותדירות מצטברת. חיות נקבות הראו שינוי משמעותי בהתפלגות עם שכיחות גבוהה יותר של תאים בקטגוריות מסדר נמוך יותר בהשוואה לבעלי חיים זכרים. בסך הכל, התוצאות מצביעות על הבדלים ברורים בין המינים בביטוי Drd1alpha בגרעין האקומבנס.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות מכיוון ששינויי טמפרטורה או התייבשות של הרקמה עלולים לפגוע ב-mRNA ולהפריע ליכולתנו לקבל אות אמין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את טכניקת ההכלאה באתרה ברקמות קליפת המוח, תעתיקי mRNA של אותות פלואורסצנטיים בתוך אזורי מוח נבחרים, ולאפיין את התפלגות תעתיקי ה-mRNA לניתוח סטטיסטי.

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים השתלת אלקטרודות וצינוריות בחולדה מורדמת כדי למדוד שחרור דופמין בגרעין האקומבנס באמצעות פוטנציוסטט ועירוי תרופות לוויסות הפעילות הדופמינרגית באזור הטגמנטל הגחוני.

ניטור שחרור דופמין במודל חולדה באמצעות מניפולציה של קולטן נוירונים דופמינרגיים VTA

סרטון זה מדגים את הזיהוי של סינתזת RNA של קולטני סרוטונין באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים ברקמת מוח של חולדות המושפעות מתסמונת סרוטונין. הפרוטוקול כולל טיפול מקדים ברקמות, הכלאת בדיקה וזיהוי אנזימטי כדי לדמיין ולכמת את ביטוי ה-RNA של קולטני סרוטונין במיקרוסקופ.

הכלאה באתרה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים לחקר ביטוי RNA בחלקי מוח של חולדות

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

במחלת פרקינסון (PD), חומר שחור (SNC) נוירונים דופאמינרגיים להתנוון, שמובילים מוטורי. כאן אנו מדווחים פרוטוקול נוירונים culturing מוח תיכון גחון של עכבר להביע eGFP מונע על ידי hydroxylase טירוזין (TH) רצף אמרגן, קצירת נוירונים ניאון פרט מן התרבויות, ומדידת transcriptome שלהם באמצעות-seq RNA.

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

כאן אנו מציגים שיטה אוטומטית לקביעה כמותית למחצה של מספר נוירון דופאמין בסובסטנציה חולדה nigra pars compacta.

קביעה כמותית למחצה של צפיפות נוירון דופאמין בסבסטנציה ניגרה של מודלים מכרסמים באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי

מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) הועסק כדי לדמיין בו זמנית את התמלילים עבור שני קולטנים מצמידי חלבון G וגורם שעתוק אחד בכל הקומפלקס הגנגליוני של העכבר הבוגר. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים vagal afferent.

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

מחקר זה מציג שיטה איתנה לבידוד mRNA אקסונים באמצעות הכנסות ממברנה נקבוביות, המאפשרת הפרדה מלאה בין נוירונים לנויריטים וטיהור RNA. בשילוב עם RTddPCR, הגישה מאפשרת כימות מוחלט של תמלילים בעותק נמוך, ומקלה על מחקרים של העברת mRNA ותרגום מקומי עם רגישות גבוהה, שחזוריות ויישום ניסויי רחב.

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

למד טכניקת RNA in situ hybridization חדשנית לזיהוי קולטן דופמין D1-alpha בגרעין האקומבנס של מוח עכברוש. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מולקולות RNA בודדות וחשיפת הבדלי ביטוי מגדריים.

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי

גלה סרטונים נוספים