זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי
27 במרץ 2018
זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא גרעין האקומבנס חיוני שהבהרת בתפקוד קולטן D1 בזמן מחלה במערכת העצבים המרכזית. ביצענו את הרומן RNA בחיי עיר הכלאה assay להמחיש מולקולות RNA יחיד באזור ספציפי במוח.
המטרה הכוללת של בדיקת הכלאה חדשה זו של RNA באתרה היא לדמיין מולקולות RNA בודדות באזור ספציפי במוח שהן קריטיות להבהרת תפקוד לקוי של דופמינרגיה במהלך מחלת מערכת העצבים המרכזית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון הפרעות דופמינרגיות, תיווך תגובות התנהגותיות וויסות תפקוד זיכרון העבודה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת טכניקת הכלאה חדשה באתרה כדי לחקור תפקוד לקוי של מערכת הדופמין במהלך התקדמות מחלות מערכת העצבים המרכזית.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רמות הביטוי הכוללות של mRNA מטרה באזור נתון במוח, ניתן ליישם אותה גם כדי לקבוע כיצד תעתיקי mRNA מופצים בכל התאים של אזור נתון. כדי להתחיל בהליך זה, תוך חמש דקות לאחר קצירת מוח של חולדה בוגרת, טבלו אותו בחנקן נוזלי למשך 15 שניות. לאחר מכן, אזנו את המוח במינוס 20 מעלות צלזיוס בקריוסטט למשך שעה.
לאחר שעה, חתכו חלקים של 30 מיקרון המכילים גרעין אקומבנס מ-2.76 מילימטרים ל-2.28 מילימטרים לפני ברגמה והרכיבו אותם על המגלשות. לאחר מכן יבש את החלקים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, טבלו את המגלשות ב-4% פרפורמלדהיד מקורר מראש למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הנח את השקופיות בשיפוע אתנול הולך וגדל בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העביר את השקופיות לאתנול טרי של 100% למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, הנח את השקופיות על הנייר הסופג כדי לאפשר ייבוש באוויר. צייר מחסום סביב כל קטע בעזרת עט מחסום.
הניחו למחסום להתייבש לחלוטין למשך דקה אחת. כדי לטפל מראש בקטעי המוח, הפעל את התנור והגדר את הטמפרטורה ל-40 מעלות צלזיוס. הוסף שלוש טיפות של ריאגנט לפני הטיפול על כל חלק במוח.
לאחר מכן דגרו את החלקים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טבלו את השקופיות ב-1X PBS למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר והעבירו את השקופיות ל-1X PBS טרי למשך דקה נוספת. שקופיות לא צריכות להישאר ב-1X PBS למשך יותר מ-15 דקות.
כדי להפעיל את בדיקת המולטיפלקס, יש לחמם את בדיקת המטרה למשך 10 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס באמבט מים ולאחר מכן לקרר לטמפרטורת החדר. הנח את מגיב ה-RNA בטמפרטורת החדר. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות.
לאחר מכן הוסיפו שלוש טיפות של ה-Drd1alpha כבדיקה על כל פרוסת דגימה ודגרו את הדגימות למשך שעתיים ב-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1X במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. לאחר מכן הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות.
אל תתנו לחלקי המוח להתייבש בין שלבי הדגירה. הוסף שלוש טיפות של AMP 1FL על כל פרוסת דגימה ודגר את הדגימות למשך 30 דקות ב-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות. לאחר מכן, הוסף שלוש טיפות של AMP 2FL על כל פרוסת דגימה. דגרו את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, טבלו את השקופיות במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות. הוסף שלוש טיפות של AMP 3FL על כל פרוסת דגימה ודגר את הדגימות למשך 30 דקות ב-40 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות בעזרת נייר סופג והנח אותם בחזרה על מתלה השקופיות. לאחר מכן הוסיפו שלוש טיפות של AMP 4FL ALT A על כל פרוסת דגימה ודגרו את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
שטפו את השקופית במאגר כביסה 1X למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר פעמיים. הסר עודפי נוזלים מהמגלשות והניח מיד שתי טיפות של מגיב הרכבה על כל חלק. לאחר מכן, הניחו כיסוי בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר מעל כל חלק במוח.
לאחר מכן אחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עד לייבוש. לצורך הדמיה, הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ועבור למטרה של פי 60. השג תמונות מחסנית Z ורכוש תמונות של תאים המסומנים ב-Drd1alpha באזור גרעין האקומבנס.
עבור תמונות מגרעין האקומבנס שהציגו את דפוס צביעת הנקודות הבדידות, טווח הביטוי הדינמי הוערך באמצעות ניתוח כמותי למחצה. כל תא קיבל ציון מאפס עד תשע על סמך מספר הנקודות לתא. שיטת ציון אות היברידית זו יכולה להעריך את ההיקף והשונות של ביטוי Drd1alpha על פני תאים בודדים.
להלן התמונות הקונפוקליות המייצגות של ביטוי Drd1alpha בחולדות זכר ונקבה שיש להן דפוס צביעת נקודות בדידות. כדי לקחת בחשבון את מבנה הנתונים המקונן, ערכי ספירה ממוצעים חושבו עבור כל קטגוריה ושימשו לניתוח סטטיסטי. בדיקת Mann-Whitney U נערכה כדי להעריך את ההבדלים בספירת התאים החציונית בחולדות זכרים ונקבות.
תדירות התאים בכל קטגוריה מנותחת באמצעות תדירות יחסית ותדירות מצטברת. חיות נקבות הראו שינוי משמעותי בהתפלגות עם שכיחות גבוהה יותר של תאים בקטגוריות מסדר נמוך יותר בהשוואה לבעלי חיים זכרים. בסך הכל, התוצאות מצביעות על הבדלים ברורים בין המינים בביטוי Drd1alpha בגרעין האקומבנס.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות מכיוון ששינויי טמפרטורה או התייבשות של הרקמה עלולים לפגוע ב-mRNA ולהפריע ליכולתנו לקבל אות אמין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את טכניקת ההכלאה באתרה ברקמות קליפת המוח, תעתיקי mRNA של אותות פלואורסצנטיים בתוך אזורי מוח נבחרים, ולאפיין את התפלגות תעתיקי ה-mRNA לניתוח סטטיסטי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מזהה את קולטן הדופמין D1-alpha בגרעין האקומבנס (nucleus accumbens) באמצעות בדיקת היברידיזציה של RNA in situ חדשנית, המאפשרת הדמיה של מולקולות RNA בודדות. המחקר נועד להבהיר תפקוד לקוי דופמינרגי הקשור למחלות של מערכת העצבים המרכזית, ובוחן כיצד חריגות אלו משפיעות על ההתנהגות ועל זיכרון העבודה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירופרמקולוגיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- קולטני דופמין ממלאים תפקיד מכריע בוויסות התפקוד הנוירונלי.
- תפקוד לקוי של קולטן D1 קשור להפרעות שונות במערכת העצבים המרכזית.
- הבנת התהלוּת של הקולטנים עשויה לשפוך אור על גירעונות התנהגותיים וקוגניטיביים.
- טכניקות של היברידיזציה במקום (In situ hybridization) חיוניות לחקר ביטוי mRNA באזורי מוח ספציפיים.
מטרת המחקר
- להדמיות של התפלגות RNA בגרעין האקומבנס (nucleus accumbens).
- לזיהוי חריגות בביטוי של רצפטורים לדופמין.
- לתרומה להבנת תגובות התנהגותיות ותפקוד הזיכרון העובד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בבדיקת RNA in situ hybridization חדשנית.
- מוחות של חולדות בוגרות נאספו ועובדו להכנת ס स्लाइड्स.
- השיטה מאפשרת הדמיה של התפלגות mRNA ברמת התא הבודד.
- נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך הדמיה כדי לנתח דפוסי ביטוי של Drd1alpha.
תוצאות עיקריות
- נצפו הבדלים משמעותיים בין המינים בביטוי של Drd1alpha בגרעין האקומבנס (nucleus accumbens).
- המחקר הראה דפוסים מובחנים של התפלגות RNA, כאשר שיטת דירוג העריכה העריכה את רמות הביטוי.
- הממצאים מרמזים על השלכות להבנת תפקוד לקוי דופמינרגי בהקשרים התנהגותיים.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת בחינה ברזולוציה גבוהה של ביטוי קולטנים והתפלגות mRNA.
- הממצאים עשויים לשפר את ההבנה של הבדלים תלויי-מין בתפקוד דופמינרגי ובמחלות של ה-CNS.
- להשלכות יש משמעות הן עבור מחקרים בסיסיים במדעי העצבים והן עבור אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו של היברידיזציה של RNA in situ מאפשרת ויזואליזציה של תמלילי mRNA בודדים באזורי מוח מוגדרים, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות במסלולים דופמינרגיים. על ידי פיתרון דפוסי ביטוי תלויי-מין של Drd1alpha בגרעין האקומבנס (nucleus accumbens), היא מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית עבור תוכניות לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי קישור התכוון של הרצפטורים לפנוטיפים התנהגותיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי ביטוי RNA של Drd1alpha במעגלי תגמול.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הערכה כמותית של הטרוגניות רצפטורים.
- ערך ניבוי: תומך בתעדוף פורטפוליו על ידי זיהוי מעורבות מטרה התלויה במין.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה המשכית של מודולטורים דופמינרגיים.
- ערך תפעולי: אספקת קריאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור באמצעות דירוג נקודות חצי-כמותי.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה במודלים של מחלות CNS הדורשים רזולוציית טרנסקריפט מרחבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למערכות רלוונטיות למחלה על ידי בחינת תפקוד לקוי דופמינרגי במסלולי זיכרון עבודה.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות זיהוי mRNA עקבי.
- הפחתת סיכונים: מספק מידע לקבלת החלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הבהרת השונות בביטוי המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בזרימות עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהן רזולוציית תמלול מרחבית מספקת מידע על מידת הביטחון במטרה לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור של פיזור Drd1alpha לפנוטיפים התנהגותיים ב-NAc.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה באמצעות מדדי ביטוי כמותיים ברמת התא.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים סטטיסטיים (Mann-Whitney U, התפלגויות תדירות) להשוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית באמצעות מידול של תגובות דופמינרגיות תלויות-מין.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת הניתנת לשימוש חוזר למיפוי של כל mRNA של מטרה במערכת העצבים המרכזית (CNS) ברקמה מקובעת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית בסיגנל דופמינרגי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה (scalability) על פני אזורי מוח ומינים שונים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשכה או הפסקת הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף וקבלת החלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נאמנות הביטוי של המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, טיפול ב-RNA והדמיה קונפוקלית.
- תלוי בתשתית של קריוסטט, חנקן נוזלי ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית לעיצוב גשמיות (probes) וכמימות אות.
- שיקולי התאמה כוללים את זמן קיבוע הרקמה ויעילות החדירה (permeabilization) במודלים השונים.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכון לפירוק RNA עקב תנודות בטמפרטורה או התייבשות במהלך העיבוד.
