תמונה מונחה כריתה של גליובלסטומה, ההשתלה תוך-גולגולתי של פיגומים נזרע תאי גזע טיפולית

שוחרת הגידול טיפולית בתאי גזע mesenchymal (MSCs) מבטיחים לטיפול פולשני גליובלסטומה. השתלת אופטימלית כולל משלוח של MSCs לתוך חלל כריתה הגידול על פיגומים. כאן, טכניקות פרה כדי ללמוד טיפול MSC גליובלסטומה הינם מסופקים לרבות: כריתה הגידול תמונה מונחה; השרשת נזרע MSC פיגומים; טיפול לאחר הניתוח מעקב.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכרות בניתוח סרטן מוח בעכברים ולהשתיל פיגום זרוע בתאי גזע טיפוליים בחלל הכריתה שלאחר הניתוח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הטיפול התאי והנוירו-אונקולוגיה, כגון כיצד כריתה כירורגית משפיעה על השתלת תאים בחלל הניתוח, עד כמה יעילים חומרים טיפוליים חדשים על סרטן מוח לאחר ניתוח, וכיצד מערכות אספקה מבוססות פיגומים משפיעות על תוצאות טיפוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור התערבויות בסרטן המוח בעכברים באופן המחקה מקרוב את הסטנדרט הקליני של הטיפול בחולים אנושיים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי טיפול בתאי גזע המועבר על פיגומים, ניתן ליישם אותה גם על התערבויות אחרות, כגון ננו-חלקיקים, מולקולות קטנות, וירוסים אונקוליטיים או טיפולים מתפתחים אחרים. הכן את הפיגומים 48 שעות לפני ההשתלה בעכברים על ידי חיתוך פיגומי PLA תחילה לחתיכות בגודל חלל כריתה של כשני מילימטרים. עקרו את הפיגומים על ידי טבילה באתנול 70% למשך 15 דקות.

לאחר 15 דקות, טבלו את הפיגומים ב- PBS. לאחר מכן הניחו פיגומים במדיום הנשר המותאם של Dulbecco המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין תוך הכנת תאים לזריעה. כדי להכין את התאים, הרם תחילה MSCs מתורבתים באמצעות 0.05% טריפסין.

דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, ודא שהתאים התרוממו. לאחר מכן הוסף DMEM לבקבוק כדי להשבית את הטריפסין.

לאחר מכן, העבירו את תכולת הבקבוק לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן גלולה חמש פעמים 10 ל-MSCs החמישי עבור כל פיגום באמצעות צנטריפוגה ב-100 פעמים גרם למשך חמש דקות.

לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את ה-MSCs בחמישה מיקרוליטרים של DMEM לכל חמישה פעמים 10 לתאים החמישיים. לאחר מכן הסר פיגום מטבילת DMEM בעזרת מלקחיים, והניח אותו על מכסה צלחת שש הבארות. הרם את הפיגום מהמכסה, והשאיר אחריו טיפה של עודף DMEM.

הנח את הפיגום בחזרה על המכסה במקום חדש ויבש. חזור על הפעולה שלוש עד חמש פעמים. לאחר מכן הניחו את הפיגום המיובש חלקית בצלחת חדשה בת שש בארות לזריעה.

פיגום מיובש חלקית מספק תוצאות אופטימליות של זריעת תאים. אם הפיגום רטוב מדי, התאים יחליקו מהפיגום וייצמדו לצלחת שמתחת. אם הפיגום יבש מדי, הטיפה לא תתפשט על פני כל הפיגום, וכתוצאה מכך פיזור תאים ראשוני לקוי.

בעזרת פיפטה, ערבבו בעדינות את הצינור של MSCs כדי להומוגניזציה של התרחיף, מכיוון שייתכן שחלק מהתאים שקעו בתחתית. פיפטה לאט 2.5 מיקרוליטר של תרחיף MSC טרי מעורבב ישירות על הפיגום, ויוצר טיפה קטנה מעל החלק העליון של הפיגום. הוסף 300 מיקרוליטר של DMEM לקצוות כל באר כדי למנוע אידוי מהיר של טיפת התא.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מה שמאפשר לתאים להיצמד לפיגום. לאחר הדגירה, השתמש במלקחיים כדי להפוך בעדינות את הפיגומים בצלחת הבאר. זרע 2.5 מיקרוליטר של תרחיף MSC מעורבב טרי כדי לתת בסך הכל חמש פעמים 10 לתאים החמישיים שנזרעו לכל פיגום.

לאחר דגירה של 30 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לפיגום, כסו את הפיגומים ב-DMEM על ידי הוספת שני מיליליטר לכל באר של צלחת שש הבארות. הרם בעדינות את הפיגומים כדי לאפשר למדיה לזרום מתחתיהם. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במצב זה במשך 48 שעות לפני ניתוח ההשתלה.

התחל בהנחת המסגרת הסטריאוטקסית על הבמה של סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי המנתח. לאחר מכן אבטח את העכבר המורדם במסגרת הסטריאוטקסית עם אספקת הרדמה בשאיפה רציפה באמצעות מתאם חרוט אף איזופלורן. שמרו על טמפרטורת הגוף בעזרת כרית חימום.

יש למרוח משחה עיניים על העיניים למניעת ייבוש הקרנית. לאחר מכן עקר את מקום החתך בקרקפת עם סדרה של שלושה אלכוהול ושלושה מגבוני בטדין. בצע את בדיקת רפלקס צביטת הבוהן בכל איבר, ואשר תגובה שלילית כדי להבטיח הרדמה נאותה.

בעזרת מלקחיים, צבטו והרימו בעדינות את הקרקפת. לאחר ביצוע חתך ליניארי בקו האמצע עם מספריים כירורגיים, יש להשקות את מקום החתך עם PBS, ולהסיר שומן תת עורי בעזרת מוליך קצה כותנה בתנועת צחצוח סיבובית. סדרו את העור כך שחלון הגולגולת שהוקם בעבר נראה במלואו.

השתמש במחט בגודל 18 כדי לנקב בעדינות את הדורה ממש בפנים לגבולות חלון הגולגולת. חזור על הפעולה עד שהחתך עוקב במלואו אחר פנים החלון. הסר את הדורה על ידי קילוף באמצעות מלקחיים עדינים, וחושף את הפרנכימה והגידול הבסיסיים.

לאחר מכן, עמעם את אורות החדר והפעל את מצב הקרינה הסטריאומיקרוסקופ. אתר את הגידול U87 mCherry ו-Firefly המבטא לוציפראז. טען קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר לקצה הצינור של משאבת ואקום.

ואז הפעל את משאבת הוואקום. כרתו את הגידול על ידי שאיבת הרקמה הפלואורסצנטית בעדינות עד שלא יישאר אות. כדי לשלוט בדימום, יש להשקות עם PBS קר ולהפעיל לחץ יציב עם אפליקטור עם קצה כותנה.

השתמש בשילוב של מי מלח, לחץ יציב עם אפליקטור כותנה ו/או חומר המוסטטי, כגון SURGICEL, כדי לעצור את הדימום לפני השתלת הפיגום. אם לא שולטים בו כראוי, עלולה להיווצר המטומה שעלולה להיות מסוכנת. לאחר הכריתה, כבה את משאבת הוואקום והשליך את קצה הפיפטה.

כבה את הקרינה והאורות בחדר נדלקים בחזרה. מיד לפני ההשתלה, טבלו לאט פיגום PLA עם זרעי MSC ב-PBS כדי להסיר מדיה לא רצויה ורכיבים נלווים. השתל את הפיגום בחלל הכריתה.

במידת הצורך, הוסף מיקרוליטר אחד של פיברינוגן ואחריו מיקרוליטר אחד של תרומבין כדי לאבטח את הפיגום במקומו. לאחר הסרת הדורה ודש העצם מחלון הגולגולת כבר הושלך, אטום את הפצע על ידי סגירת העור ומריחת דבק כירורגי. הסר את החיה מההרדמה בשאיפה, ואפשר לה להתאושש על משטח מחומם.

תמונות ניגודיות פאזה, פלואורסצנטיות ומשולבות אלה מראות תאי סרטן U87 מהונדסים עם מבנים לנטי-ויראליים כדי לבטא סמני mCherry ו-Firefly luciferase. תמונות ניגודיות פאזה, פלואורסצנטיות ומשולבות אלה מציגות תמונות תואמות של תאי גזע שהונדסו לבטא GFP-Renilla luciferase אבחנתי או GFP-TRAIL טיפולי שנזרעו על חומר פיגומי PLA. תמונת השדה הבהיר והפלואורסצנטי הזו מציגה את מיקום הגידול.

כאן נראה חלל הכריתה שלאחר הניתוח עם מוקדי גידול שנותרו. תמונה זו מציגה את פיגום ה-PLA המושתל עם MSC-TRAIL. כאן, רקמת מוח לאחר המוות נראית עם הפיגום מונח מעל.

שכבת-על פלואורסצנטית זו מדגישה את תאי GFP-TRAIL. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-30 דקות לכל עכבר, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שתהיה שונות מהותית בהיקף הכריתה המושגת מעכבר לעכבר, בדומה למה שנראה במרפאות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע כריתה כירורגית של גידול במוח ולהעריך את השפעתו על התערבויות טיפוליות הכוללות טיפול בתאי גזע מבוססי פיגומים.