Name: הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: למדו כיצד להרכיב ולטהר אינטאזומים של וירוס קצפית אב-טיפוס לשימוש במחקרים ביוכימיים, מבניים וקינטיים. שיטה זו מאפשרת בידוד מורכבים אינטגרציה לחקר מכניקת רטרו-וירוסים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי NIH AI099854 ו- AI126742 למפתח.

1. חישול של vDNA
<ol><li>שלב 1 X 10 מאגר (10 X 10 מניות: 100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, EDTA 10 מ מ), 10 מיקרומטר Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 מניות מיקרומטר) ו- 10 מיקרומטר Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 מניות מיקרומטר באמצעי אחסון הסופי של 1.5 מ ל) . µL 25 aliquot לתוך צינורות תגובת שרשרת (PCR) 0.2-mL פולימראז שישים. הערה: בהתאם ליישום, oligomers עשוי להיות שונה עם fluorophores או תגיות בקצה 5'-Oligo 2 או כמו של פנימי אמינו-טי בגיל 13 הבסיס מקצה 5'-Oligo 1. Oligomers ששונה לטהרו על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) לפני חישול. מצאנו כי 5'-סוף Cy3 או Cy5 fluorophore תיוג של Oligo 2 מפחית את היעילות הרכבה intasome 10-fold. תיוג fluorophore פנימי אינו מקטין את יעילות הייצור.</li>
	<li>Anneal באמצעות thermocycler התקופה הבאה על טמפרטורות: 1 מחזור ב 94.0 הלעפה תרוטרפמט 3 דקות, 99 מחזורי ב (94.0 הלעפה תרוטרפמט 1 דקות, הלעפה תרוטרפמט 93.6 1 דקות) יורד הטמפרטורות הן על-ידי הלעפה תרוטרפמט 0.8 לכל מחזור (המחזור האחרון הוא 14.8 הלעפה תרוטרפמט 1 דקות, הלעפה תרוטרפמט 14.4 1 דקות) , ולאחסן ב הלעפה תרוטרפמט 4.0.</li>
	<li>לשלב את התגובות מחזק משפופרות שישים כל. לטעון µL 500 שני 0.5-mL 3 kDa משקל מולקולרי הקיצוץ (MWCO) ultracentrifugal מסנן ריכוז היחידות. לרכז את vDNA annealed על ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge ב 14,000 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: אמצעי האחסון retentate צריך להיות µL ~ 50 בכל יחידת ריכוז.</li>
	<li>למחוק את הזרימה. להוסיף 250 µL של vDNA annealed הנותרים כל יחידת מסנן. חזור על הספין וזורקים את הזרימה. מאגר exchange לתוך מאגר TE (10 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA) ע י שטיפת שלוש פעמים עם טה µL 450.</li>
	<li>היפוך של יחידת מסנן ומסתובב ב 1,000 x g למשך 2 דקות ב- RT. האחסון retentate הסופי עבור כל יחידת מסנן צריך להיות µL ~ 50. לשלב את retentates ואת העברת צינור פקקי בורג 1.5 mL.</li>
	<li>למדוד את ספיגת 260 ננומטר אולטרה סגול (UV) של vDNA. השתמש בערך זה כדי לחשב את ריכוז הדנ א מולרי סופית. מקדם הכחדה (חדוה260) vDNA הזה הוא 622,803 ס מ-1 מ'-1 והוא משקל מולקולרי שלה חנות המחוזי 23,972 ב-20 הלעפה תרוטרפמט.</li>
</ol>2. Intasome הרכבה
<ol><li>במידת האפשר, בצע את מכלול intasome בחדר קטן עם תרמוסטט משתנה. לכוון את התרמוסטט כדי כ 18-22 הלעפה תרוטרפמט. הערה: מניסיוננו, intasome assembly הלעפה תרוטרפמט 4 זה לא יעיל.</li>
	<li>להכנת 1 ליטר של מאגר דיאליזה (20 מ מ Bis-טריס פרופאן, pH 7.5, 200 מ"מ NaCl, 2 מ מ dithiothreitol (DTT), מיקרומטר 25 ZnCl2) בתוך 2 ל' עם בר מערבבים בצלחת מערבבים. Equilibrate המאגר בחדר הלעפה תרוטרפמט 18-22 לפחות 6 שעות.</li>
	<li>להרכיב את intasomes, לשלב 50 מ"מ Bis-טריס פרופאן, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 120 מיקרומטר ב PFV ו- vDNA 50 מיקרומטר, הנפח הכולל של 150 µL. הערה: PFV IN צריך להיות חופשי של מזהם נוקלאז פעילות7,8. אם הריכוז של PFV הוא גם לדלל כדי להכיל 120 ב מיקרומטר בכרך µL 150, אז זה אפשרי להגביר את עוצמת הסופי כדי 200 µL. הגורמים הקריטיים של שלב זה הן כדי לשמור על יחס טוחנת של IN כדי vDNA (2.4:1) יש מספיק מתחם להמחיש במהלך כרומטוגרפיה.</li>
	<li>נקה פיסה מוארכת ~ 10-ס מ 10-מ מ 6-8 kDa MWCO דיאליזה אבובים, קליפים עם מים מזוקקים כפול (ddH2O), או המים טוהר הגבוהה ביותר הזמינים. קליפ קצה אחד של הצנרת. הערה: דיאליזה אבובים שצריך לנהוג בזהירות כדי למנוע כל זיהום אפשרי מן המרחב מעבדה.</li>
	<li>להפוך 15 מ"ל דיאליזה מאגר של שטיפה אבובים (50 מ מ Bis-טריס פרופאן, pH 7.5, 500 מ מ NaCl). לשטוף את החלק הפנימי של הצנרת דיאליזה שלוש פעמים עם 1-2 מ ל שטיפה מאגר. להסיר כמה המאגר שטיפה ככל האפשר עם פיפטה, ג'ל דק טעינת עצה.</li>
	<li>אם יש צורך, להשתמש גילוח נקי או אזמל לחתוך את הדיאליזה, אבובים כך טיפ הטעינה ג'ל דק עשוי להגיע לסוף של הצנרת.</li>
	<li>העבר את מכלול intasome מהשלב 2.3 הצנרת דיאליזה פיפטה, ג'ל דק טעינת עצה. קליפ את הקצה הפתוח של הצנרת דיאליזה, למזער את כמות האוויר הציג בתוך הצנרת. מקם את הצנרור למאגר דיאליזה.</li>
	<li>Dialyze לילה (16-20 h) עם ערבוב עדין כך הצנרת מסתובב אך לא נמצא מערבולת. ודא כי הצנרת דיאליזה המשוקע, ניידים. לאחר כשעה, להתבונן על התמיסה גלוי בתוך הצנרת. הערה: Cy3 או Cy5 fluorescently הנקרא vDNA, התמיסה הוא יותר ברור. זה נכון עבור סוף הנקרא והן vDNA פלורסנט פנימי עם תוויות.</li>
</ol>3. Intasome Solubilization
<ol><li>להכין שני רחב נשא פיפטה טיפים על-ידי הסרת 2-4 מ מ מהקצה של טיפ 200 µL עם סכין גילוח או אזמל חדש על משטח נקי. הערה: הטיפים ישמש בשלב 3.3 ו- 3.5.</li>
	<li>הסר את הצנרור דיאליזה המאגר דיאליזה. על מנת למנוע דילול מדגם intasome עם מאגר דיאליזה שעלולים להישאר בסוף הצנרור ליד הפריט, להשתמש micropipette עם טיפ קטן פיפטה כדי להסיר כל מאגר עודף דיאליזה. להסיר את הסרטון מקצה אחד של הצנרת דיאליזה.</li>
	<li>שימוש רחב נשא פיפטה עצה מהשלב 3.1 להעביר את הדגימה כולל את התמיסה בתוך הצנרת דיאליזה כדי צינור 1.5-mL על קרח. הערה הנפח הכולל של החומר המשוחזר; לנפח הכללי הוא בדרך כלל ~ 140 µL.</li>
	<li>המדגם עם התמיסה הוא 200 מ"מ NaCl; להגדיל את המלח כדי ריכוז סופי של 320 מ מ NaCl על-ידי הוספת נפח מתאים של פתרון NaCl 5 מ' מניות. לדוגמה, עבור מדגם של 150 µL, להוסיף µL 3.9 5 מ' NaCl ו- 1.1 µL ddH2O עבור אמצעי אחסון הסופי של 155 µL. העברת קרח בדלי עם לטעום לתוך חדר קר הלעפה תרוטרפמט 4.</li>
	<li>שימוש רחב נשא פיפטה עצה מהשלב 3.1 אל resuspend ואל solubilize את התמיסה על-ידי pipetting. חזור על כל 20 דקות לפחות 1 ח' להתבונן כי רוב התמיסה. כדאי שנלך לשם פתרון. הערה: Pipetting כדי resuspend את המשקע ניתן לעצור כאשר ניכר כי התמיסה מצטמצם עוד ניכר בין נקודות זמן. כאשר vDNA אינו מסומן או תוצמד באופן פנימי, התמיסה הוא מופחת על ידי ~ 90% בהתבסס על בדיקה ויזואלית. במקרה של סיום Cy5 הנקרא vDNA, התמיסה הוא מופחת על ידי ~ 20% בלבד; רוב התמיסה עם סוף fluorophore הנקרא vDNA לא solubilize. הכמות של התמיסה זה ביעילות solubilized משתנה והיא צריכה להיות נחוש מדעית.</li>
</ol>4. Intasome טיהור
<ol><li>להכין 250 מ של גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות) הפעלת מאגר (20 מ מ Bis-טריס פרופאן, pH 7.5, 320 מ מ NaCl, 10% גליצרול). מסנן סטרילי המאגר עם 0.2-מיקרומטר לסנן יחידת ולאחסן ב 4 הלעפה תרוטרפמט. הערה: כל השלבים טיהור מבוצעות בחדר קר הלעפה תרוטרפמט 4.</li>
	<li>Equilibrate עמודה agarose צולבים שניה (קוטר = 10 מ"מ; אורך = 300 מ"מ; מיטה נפח = 24 mL; לדגום נפח = 25-500 µL; לחץ מרבי = 1.5 מגפ ס; אי-הכללה של מגבלת = 4 x 107 Da; מפריד מולקולרית משקולות בין 5 ל 5,000 kDa, לראות את טבלה של מחצלת erials) עם מאגר הפעלה שניה בספיקה של 0.4 mL/min. הערה: טיהור זה שעשוי להיות מותאם גודל שונה אי-הכללה של עמודות אם הם מסוגלים ביעילות להפריד 300 kDa kDa 44, כגון Superose 12 10/300 GL או להגדיל את Superose 6. Superose 12 10/300 GL יש ברזולוציה נמוכה יותר, שמוביל יותר החפיפה של פסגות. לעומת זאת, Superose 6 להגדיל יש רזולוציה גבוהה יותר והוא מציע הפרדה טובה יותר.</li>
	<li>Centrifuge הדגימה intasome ב microfuge ב 14,000 x g 10 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט כדי הצניפה כל המשקע הנותרים. הסר בזהירות את תגובת שיקוע. לטעון את תגובת שיקוע ללולאה הזרקת 200 µL (צינורות שיכול להכיל ~ 200 μL). להחיל את הדגימה לעמודה שניה. הערה: כרכים עומס קטן יותר לאפשר רזולוציה גדולה יותר לפי סעיף</li>
	<li>Elute 25 מ ל שניה מפעיל מאגר ולאסוף 95 שברי µL 270. לבחון chromatogram שניה מציג שלוש א280/A260 פסגות (איור 1). הערה: הראשון צריך להיות צבירה (~9.0 - • תנאי 11.5 מ ל), ואחריו את שיא intasome tetramer PFV (~12.0 - 14.75 מ"ל • תנאי) ואת מונומר ב PFV עם שיא vDNA חינם (~15.0 - 18.0 מ ל).</li>
</ol>5. שילוב סטרנד העברה Assay, ובחירת שבר, אחסון
<ol><li>לשלב 2 µL של כל שבר שיא של intasome ו- 50 ng 3 kb supercoiled פלסמיד ה-DNA (ריכוז מניות הוא 50 ng/µL) במאגר התגובה (10 מ מ Bis-טריס פרופאן, pH 7.5, 110 מ מ NaCl, 5 מ מ MgSO4, ZnCl 4 מיקרומטר2, 10 מ מ DTT) באמצעי אחסון התגובה האחרונה של 15 µL. דגירה-37 הלעפה תרוטרפמט במשך 5 דקות.</li>
	<li>כוללות פקד שלילי עם לא intasome PFV נוספת. לעצור את התגובה עם µL 0.75 proteinase K (פתרון מניות 20 מ"ג/מ"ל) ו- 0.75 µL מרחביות (פתרון 10% מניות). דגירה-55 הלעפה תרוטרפמט לדוגמאות החנות ה 1 כנדרש ב-20 הלעפה תרוטרפמט עבור בהמשך מנתח. הערה: זה וזמינותו היא הערכה איכותית של פעילות האינטגרציה. ריכוז מולרי intasome של כל שבר לא נקבע לפני זה וזמינותו. שברים כלול שילוב סטרנד העברה וזמינותו ניתן לאחסן על קרח (כולל אחסון לילה) עד שילוב פעילות הוא אישר, שברים הנבחרים aliquoted. כאן אנו משתמשים pMP2, נגזרות pUC199. אנו משתמשים גם בהצלחה את pcDNA פלסמיד 5.4 kb 3.1. כל פלסמיד שעשויים להיות נחוש בדעתך בהרפיה מעגל, לינארית, טפסים supercoiled עשוי לשמש כמטרה לשילוב.</li>
	<li>להכין משקולת 1% 120 מ לכל אמצעי אחסון (w/v) ג'ל agarose במאגר טה X 1 (40 מ"מ טריס-אצטט, 1 מ"מ EDTA) עם 0.1 μg/mL אתידיום ברומיד (EtBr, פתרון מניות 10 מ"ג/מ"ל)10. להמיס את הפתרון agarose ויוצקים אותו לתוך מגש הליהוק של ג'ל 15 ס"מ, 10 ס"מ. הכנס מסרק 15-ובכן עם 5 מ מ רחב, 0.75 מ מ עבה וולס. הערה: בארות צר יותר תשואה רזולוציה להקה טובה יותר בהשוואה ולס בעובי 1.5 מ מ.</li>
	<li>לאפשר את הג'ל שבמהלכו בטמפרטורת החדר. לטבול את ג'ל טה X 1 עם 0.1 μg/mL EtBr.</li>
	<li>להוסיף 3 גליצרול 50% µL כל התגובה אינטגרציה מהשלב 5.2. לטעון את אמצעי האחסון כולו התגובה הג'ל. לטעון µL 1 של 10 kb DNA גודל סמן (150 ריכוז מניות ng/µL) על הנתיבים משני צדי הדגימות; במילים אחרות, דה מרקר גודל דנ א צריך לאגף המסלולים לדוגמה.</li>
	<li>. בנתיב החיצוני לטעון µL 6 כתום G צבען (0.25% כתום G, 30% גליצרול). הפעל את הג'ל עם מתח קבוע, 10 V/ס מ (100 וולט) בטמפרטורת החדר למשך 1 h, או עד לחזית צבע כתום G מגיע לסוף הג'ל.</li>
	<li>תמונה מיד את הג'ל agarose עם סורק פלורסנט מוגדר לזהות EtBr (532 ננומטר עירור, 610 ננומטר מסנן פליטה). אם נעשה שימוש fluorophore הנקרא vDNAs, גם תמונה עם הגדרות fluorophore המתאים. הערה: לדוגמה, כדי לזהות Cy5 בתווית ה-DNA, התמונה באמצעות עירור nm 633 ומסננים פליטה 670 ננומטר. מוצרים אינטגרציה מתואמת (CI, DNA ליניארי) צריך להפעיל נכון גודל ב ~ 3 kb, פלסמיד supercoiled unreacted (SC) צריך לרוץ מהר יותר (~ 2 kb) ולאחר חצי-אתרים שילוב מוצרים (מצב HSI, רגועה מעגל ה-DNA) לפעול לאט יותר (~3.5 kb). Unreacted vDNA כדאי נכון להפעיל גודל ~ 40 bp.</li>
	<li>לכמת הלהקות בנתיב כל עם תוכנת הדמיה7. לחשב את השבר של ה-DNA בנתיב כל זה CI, מצב HSI או SC; חישוב זה אינו כולל vDNA. הערה: יעילות שילוב, או את חלק SC להמיר מוצר ליניארי, מחושב על ידי חלוקת כמות פיקסלים מתואמת שילוב מוצרים (CI) על ידי כמות הפיקסלים הכולל שלוש להקות (מצב HSI + CI + SC). אם intasomes fluorophore שכותרתו, ייתכן מצב HSI את המוצרים CI גם quantitated על-ידי קרינה פלואורסצנטית.</li>
	<li>בחר בשברים עם פעילות האינטגרציה ביותר מתואמת. הערה: מניסיוננו, פעילות האינטגרציה שיא ופעולה מתואמים עולה בקנה אחד עם הפסגה חלבון המזוהה tetrameric PFV intasomes. למדוד את A280 של כל אלו שברים ולחשב את הריכוז intasome הסופי. חדוה280 עבור tetramer מסוג בר ב PFV עם שני vDNAs המתוארים כאן הוא 908,339 ס מ-1מ'-1 והוא משקל מולקולרי 225.5 kDa. הריכוזים פעל על פי אותו דפוס כמו הפסגה chromatogram שניה ו ב- strand העברה וזמינותו.</li>
	<li>להפיץ כל השבר 5 µL aliquots והכנס להקפיא במצב חנקן נוזלי. חנות aliquots ב-80 הלעפה תרוטרפמט. שברים שנבחר עבור אחסון הם בדרך כלל בין 200-600 ננומטר.</li>
</ol>

<ol><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasome+assembly+and+inhibition+of+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer.</a> Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).</li>
<li>Li, M., Lin, S., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+domains+of+integrase+within+retroviral+intasomes+are+dispensible+for+catalysis+of+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration.</a> Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).</li>
<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+conformations+of+prototype+foamy+virus+integrase+and+its+stable+synaptic+complex+with+U5+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA.</a> Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+to+DNA+target+sites+in+folded+chromatin+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers.</a> J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li>
<li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li>
<li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

תוספות retroviral טופס של multimeric מורכבים עם ה-DNA גנומי הנגיפי לבצע אינטגרציה ולהמשיך את מחזור החיים ויראלי. המספר של מונומרים לכל intasome ייתכן tetramers, octamers או אולי גבוה יותר סדר multimers11,12,13,14. PFV intasomes הם tetramer של רקומביננטי עם כפול גדילי DNA oligomers המחקים נגיפי DNA גנומי מסתיים3. Intasomes אלה שימשו מחקרים דינמיים מבניים<sup clas...

שילוב של הגנום הנגיפי לתוך הגנום המארח הוא צעד הכרחי במחזור החיים של רטרווירוסים כל1. Integrase אנזים ויראלי (ב) מזרז בהצטרפות קוולנטיות בסוף כל הגנום DNA נגיפי למחשב המארח הדנ א. במהלך זיהום הסלולר, הוא חלק ממתחם אינטגרציה קדם המעביר אינטגרציה. ב רקומביננטי ומורכבת עם כפול oligomers DNA נטושים מחקה את הקצוות DNA נגיפי ניתן גם לבצע אינטגרציה לתוך ה-DNA היעד במבחנה2. יישום נפוץ השילוב assay במבחנה מנצל של פלסמיד supercoiled כיעד הדנ א. שילוב של שני oligomers DNA נגיפי (vDNA) כדי פלסמיד התוצאה היא מוצר ליניארי, הנקרא מתואמת אינטגרציה (איור 2 א). שילוב assay במבחנה גם תניב מוצרים עם אחד בלבד vDNA covalently לצרף את פלסמיד המטרה וכתוצאה מכך עיגול רגוע. מוצר זה שילוב חצי-אתר שנראה חפץ של assay בתוך חוץ גופית.
ב רקומביננטי, vDNA ניתן לבצע אינטגרציה במבחנה, אבל הם לא ריאגנטים אידיאלי עבור חקר הדינמיקות או מבנה של אינטגרציה מתחמי כאשר ב monomeric יטשטש ויזואליזציה הרלוונטיים. מתחמי אינטגרציה מטוהרים, או "intasomes", נדרשים ללימודי ניתוח או מבנה דינמי מולקולה בודדת. ב PFV ו- vDNAs עשוי להיות התאספו על-ידי דיאליזה מתוך מאגר ריכוז המלח גבוה יחסית ל-3,ריכוז מלח נמוך4. במהלך דיאליזה, התמיסה טפסים. המשקע הזה יוסר דיאליזה, ריכוזי המלח הוא גדל. ריכוז המלח גבוה יותר solubilizes את intasomes PFV המכיל precipitate. Intasomes כבר אז טהור לפי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות). אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס (PFV) ב הוכח קיימים מונומר בפתרון בריכוזים עד מיקרומטר 2255. Fractionation שניה מפריד ביעילות את intasomes PFV (225.5 kDa), הכוללת של tetramer PFV IN, שני vDNAs, PFV monomeric ב (44.4 kDa), חינם vDNA (24.0 kDa). Intasomes PFV יתכן מוקפאות ולשמר את פעילות האינטגרציה במשך לפחות שישה חודשים של אחסון ב-80 הלעפה תרוטרפמט.
Intasomes PFV רקומביננטי ניתן לשינוי כדי לכלול החלפות חומצת אמינו או לחיתוך מוטציות או vDNAs עם4,fluorophores או ביוטין6תוויות. Intasomes PFV מטוהרים בקלות לבצע אינטגרציה לתוך פלסמיד supercoiled יעד ה-DNA במבחנה. תפזורת מבחני הביוכימי אינטגרציה עם intasomes עשוי לבחון את ההשפעות של מוטציות, מעכבי, או תוספים כימיים אחרים. Biotinylated intasomes יכול לשמש כדי לחקור זיקה עם חומצות גרעין או חלבונים. PFV intasomes פונקציונליים בטמפרטורת הסביבה ומאפשר לבדיקה מיקרוסקופית מולקולה בודדת על-ידי פינצטה מגנטי כדי למדוד את הזמן בין הצטרפות של שני הקצוות vDNA או קרינה פלואורסצנטית גמורה להמחיש את החיפוש intasome על המטרה דנ א6. בנוסף, PFV intasomes היו הראשונים להיות מבנית מאופיין להשפיע באופן משמעותי בתחום של שילוב retroviral3.

<table><tbody><tr><td>DNA אוליגומרים</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>מותאם אישית DNA Oligos</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>פרופאן SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS,>=99.0% (טיטרציה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל, 1 - 200 &mu; L</td> סכין גילוח <td>קורנינג</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>; חד קצוות; 100 / חבילה; חבילה של 100</td> יחידות סינון חד פעמיות סטריליות של <td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>עם קרום PES > 250 מ"ל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>קליפים צינורות דיאליזה</td><td>ספקטרום מעבדות</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 מ"מ צינורות דיאליזה</td><td>ספקטרום רפואי</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agarose</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500 נתיבים</td><td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

הרכבה ולטיהור intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

א הגדרת תכונה, צעד הכרחי של מחזור חיי הרטרווירוס הוא השילוב של הגנום הנגיפי לתוך הגנום המארח. כל רטרווירוסים לקודד אנזים integrase (ב) אשר מזרז קוולנטיות בהצטרפות של נגיפי למארח ה-DNA, הידוע בשם strand העברה. שילוב יכול להיות מעוצבת במבחנה עם IN retroviral רקומביננטי ו- DNA oligomers מחקה את הקצוות של הגנום הנגיפי. על מנת לסכם באופן הדוק יותר התגובה אינטגרציה המתרחשת ויוו, אינטגרציה מתחמי are התכנסו from IN רקומביננטי, oligomers סינתטי על-ידי דיאליזה במאגר מלח בריכוז. מורכבות, השילוב של intasome, שנקרא יכולים להיטהר על-ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. במקרה של אב-טיפוס קצפית וירוס (PFV), intasome של tetramer של oligomers דנ א שני והוא מופרד ברצון monomeric IN, אוליגומר חינם הדנ א. יעילות שילוב PFV intasomes ייתכן לבדיקה תחת מגוון תנאים ניסיוני כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה, מכניקה של retroviral אינטגרציה.

PFV intasomes are התכנסו from רקומביננטי IN ו- vDNA. לאחר ההרכבה, intasomes כבר טהור על ידי שניה (איור 1). שילוב פעילות של כל שבר לבדיקה עם supercoiled DNA היעד ואת agarose בג'ל (איור 2). הג'ל הזה הוא עם תמונה עם סורק פלורסנט מוגדר לזהות EtBr (וגם fluorophore, אם התווית על-ידי fluorophore vDNA משמש). באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, להקה פיקסל כרכים ניתן לחשב את יעילות שילוב (איור 3). שברים עם יעילות שילוב...

Integrase retroviral רקומביננטי oligomers DNA מחקה מסתיים DNA נגיפי יכול יוצרים קומפלקס פעיל enzymatically המכונה של intasome. Intasomes עשוי לשמש ללימודי הביוכימי, מבניים קינטי. פרוטוקול זה מפרט כיצד להרכיב ולטהר intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס.

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להרכיב ולטהר אב טיפוס של אינטזומי וירוס מוקצף אשר עשויים לשמש לאחר מכן למחקרים ביוכימיים, מבניים וקינטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרטרו-וירולוגיה כגון המכניקה והדינמיקה של האינטגרציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד של מתחמי אינטגרציה ולא תערובת הטרוגנית של מינים.הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה שכן התאוששות והמסה של מתחמי אינטגרציה הם קריטיים כדי להבטיח תשואה אופטימלית של אינטזום. כדי להתחיל, שלב מאגר 1XTEN, 10 אוליגו-1 מיקרומולרי ו-10 אוליגו-2 מיקרומולרי בנפח סופי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, יש לחלק 25 מיקרוליטר מהתערובת ל-60 צינורות תגובה של פולימראז בנפח 0.2 מיליליטר.חישול ה-DNA באמצעות תרמו-סייקלר עם הזמנים והטמפרטורות המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר התגובה, שלב את תגובות החישול מכל 60 הצינורות. לאחר מכן טען 500 מיקרוליטר של שתי יחידות ריכוז מסנן אולטרה-צנטריפוגלי במשקל מולקולרי של 0.5 מיליליטר שלושה קילודלטון.רכז את ה- DNA הנגיפי המחוסל על ידי צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה ב -14, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הזרימה, הוסף 250 מיקרוליטר מה- DNA הנגיפי המחושל שנותר לכל יחידת סינון. חזור על הסיבוב עד שיישארו כ -50 מיקרוליטר והשליך את הזרימה.לאחר מכן, באגר מחליף את הדגימה למאגר TE על ידי שטיפה שלו

assembly-and-purification-of-prototype-foamy-virus-intasomes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח...

פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

הכינו שני טיפים של פיפט בעלי פיה רחבה על ידי הסרת 2-4 מ"מ מקצה של טיפ בנפח 20 µL באמצעות תער או להב סכיפה חדשים על משטח נקי.

טיהור של אינטסומים של Prototype Foamy Virus באמצעות כרומטוגרפיית הדירה של גדלים (SEC)

הפשיר משקע חיידקי אחד על קרח.

טיהור של אינטגראז ויראלי באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

כרומטוגרפיית זיקה להפרין. הכין 250 מ"ל של Buffer C (50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 500 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) ו-250 מ"ל של Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). הערה: בפרוטוקול זה, מערכת הכרומטוגרפיית נוזלים מהירה של חלבונים (FPLC), הבאפרים והדגימה נשמרים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 ˚C. סנן באופן סטרילי את Buffers C ו-D...

טיהור של אינטגראז ויראלי באמצעות כרומטוגרפיית זיקה להפרין

מקור: Gao, Y., et al. יצירה והרכבה של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף של נגיף הסינציטיומ של דרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הרכבה in vitro של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף מקומפלקס מטהר של נוקלאופרוטאין-פוספופרוטאין נטול RNA, את טיהורן באמצעות כרומטוגרפיית החרגתו גודל, ואימות של RNA ויראלי באורכו המלא בתוך החלקיקים המורכבים.

שחזור וטיהור במעבדה (In Vitro) של חלקיקים דמויי נוקלאוקפסיד נגיפיים

פירוק ליבות נגיף שפעת A במהלך כניסת הנגיף לתאי המארח הוא תהליך רב-שלבי. אנו מתארים שיטה במבחנה לניתוח השלבים המוקדמים של הסרת ציפוי נגיפי. בגישה זו, צנטריפוגה בשיפוע מהירות משמשת לניתוח ביוכימי של השלבים המתחילים הסרת ציפוי בתנאים מוגדרים.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

אב טיפוס רקומביננטי וירוס קצפית integrase חלבון נגוע לעיתים קרובות נוקלאז חיידקי במהלך טיהור. שיטה זו מזהה נוקלאז זיהום ומסירה אותו הכנת הסופי של האנזים.

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

כאן, אנו מתארים שיטת מיקרו-השאיפה תא אחד להפרדה של אמבות נגוע. על מנת להפריד אוכלוסיות משנה ויראלי ב Vermamoeba vermiformis נגוע על ידי פאוסטווירוסים ווירוסים ענקיים לא ידוע, פיתחנו את הפרוטוקול מפורט להלן והפגינו את יכולתה להפריד בין שני שפע ווירוסים ענק הרומן.

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

למדו כיצד להרכיב ולטהר אינטאזומים של וירוס קצפית אב-טיפוס לשימוש במחקרים ביוכימיים, מבניים וקינטיים. שיטה זו מאפשרת בידוד מורכבים אינטגרציה לחקר מכניקת רטרו-וירוסים.

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

גלה סרטונים נוספים