Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

הודעה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח Immunophenotyping במודלים מורין, כגון סמנים המשמשים לזיהוי שושלת חסינות שונים ואסטרטגיות הזדקנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מצבים סמן והזדקנות, כאשר immunophenotyping, ניתן להחיל על מגוון רחב של מודלים מורין. לפקח על משקל הגוף של C57 שחור 6 עכברים באמצעות איזון.

כמו כן, לפקח על נפח הגידול של עכברים תורמים שונים על ידי מדידת קליבר. בעקבות המתת חסד של החיה במכסה המנוע biohazard לפי פרוטוקול, לעקר את העור סביב הגידול באמצעות ספוגיות יודפור. לאחר ניתוח הסרת הגידול כמפורט בפרוטוקול הטקסט, מניחים את הגידול בצלחת פטרי המכילה 20 מיליליטר של PBS כי כבר מקורר מראש ל 4 מעלות צלזיוס.

אם יש דם מזהם, להעביר את הגידול לתוך צלחת פטרי אחרת לשטוף את הגידול עם PBS. חותכים את הגידול לשניים. הסר כל עור נוסף, כלי דם, הסתיידות ונמק.

בחר רק חתיכות שלמות של גידול למקם אותם בצינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של PBS לפני הובלת צינור לחדר בעלי חיים נפרד למחקרים פרמקולוגיים. כדי להתכונן להשתלה אורתוטופית, לתקן עכבר הרדמה מלאה על לוח ניסוי במצב בצד ימין.

לחטא את העור סביב הטחול עם אידודין ולאחר מכן דה יוד עם 75% אלכוהול אתיל. מצא את הנקודה החציונית של הטחול ולעשות חתך אנכי 1 ס"מ על הבטן כדי לחשוף את הטחול. בעדינות, למשוך חלק של רקמת הלבלב מתחת הטחול באמצעות פינצטה קצה שטוח.

ועכבר סוטרו הומוגרפט חתיכת גידול מעכבר C על הלבלב של העכבר הנמען על ידי 9-O תפר כירורגי bsorbable. סגור את הבטן עם תפר משי 6-O בתפר כפול. להשיג הוקמפוסטזיס על ידי דחיסה.

לאחר סיום השתלת הגידול, יש להשאיר את החיה בכלוב חם כל עוד לא מתרחשת דימום או דליפת רקמת גידול. לפקח על החיה עד שהם חוזרים להכרה מספקת כדי לשמור על שליטה בעצם החזה. החזירו את החיה לחדר החיות לאחר החלמה מלאה מההרדמה.

לפקח על הגידול עכברים משתנים על ידי palpating הבטן ליד הטחול ולבחור את העכברים הנושאים גידולים אורתוטופיים. עבור כל גידול, להכין צינור C אחד עם חיץ עיכול הגידול. השתמש 3 מיליליטר של חיץ העיכול עבור שברי הגידול פחות מ 0.8 גרם כדי להבטיח את הגידול מתעכל במלואו.

סמן את הגידול עם קוד המחקר, הגידול, מזהה העכבר, קבוצת הטיפול ומשקל הגידול. לאסוף את הגידול מהעכבר. לשטוף את הגידול ב- PBS קר ולנקות את הרקמה המצורפת על הגידול.

מניחים את הגידול בתקשורת העיכול באר אחת של צלחת סטרילית 6 באר. להחזיק את הגידול במקום עם פינצטה סטרילית או מדפים לחתוך עם אזמל. חותכים את הגידול מספיק טוב כדי לפרוץ לחתיכות קטנות יותר.

עכשיו, למקם את חתיכות הגידול בחזרה לתוך C-צינור ולהשתמש במאגר העיכול הנותר לשטוף את הצלחת. מעבירים את הנוזל לצינור C ומ מניחים אותו על קרח עד לעיכול. לאחר מכן הפעל את הדיסוציאטור עם תנורי חימום.

מניחים את דיסוציאציה הגידול C-צינור הפוך לתוך השרוול של המיקום הריק. התאם את מצב מיקום הצינור מ'חופשי' ל'נבחר'. בחר תוכנית דיסוציאציה ולאחריה הבחירה של התיקיה הדרושה שבה מוצגת רשימת התכנתים.

לאחר סיום התוכנית, לקחת C-tube את הדיסוציאטור ולסובב בקצרה כדי משטח המדגם. עכשיו, להשעות מחדש את הדגימות ולשים אותם לתוך מסננת תא מעל צינור 50 מיליליטר. לשטוף את התא דרך מסננת התא עם 10 מיליליטר של חיץ לשטוף כדי לספק השעיה תא יחיד.

לאחר צינור צנטריפוגה ב 300 G במשך 5 דקות, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים עם 5 מיליליטר של חיץ לשטוף. לספור תאים קיימא ולהתאים את ריכוז התאים ל 1 מיליון תאים לכל צינור או לכל מדגם. בצע תכנון לוח חיסוני, כשל חיסוני ו פלואורסצנטיות פחות שליטה אחת כפרט בפרוטוקול הטקסט.

הכינו חמוזי UltraComp בזמן שמכשירי הזרימה מתחממים על ידי מערבולות ביסודיות לפני השימוש. סמן צינור דגימה נפרד של 12 x 75 מילימטר עבור כל נוגדנים נדונים פלואורוכרומים. הוסף 100 מיקרוליטר של חיץ כתמים לכל צינור ואחריו טיפה אחת מלאה של חרוזים.

הוסף נוגדנים ובצע את הליך הכתמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר של חיץ כתמים לכל גלולת חרוזים לחלוטין להשעות מחדש באמצעות מערבולת. עכשיו, להגדיר מתח PMT ציטומטריה זרימה לכל רקמת היעד לניסוי נתון.

הפעל את המדגם באמצעות מדגם דרך cytometry זרימה עבור רכישת נתונים על ידי צובר על אוכלוסיית חרוזים בודדים לכל פיזור קדימה קריאות פיזור בצד. הגדר את קצב הזרימה סביב 200 עד 300 אירועים לשניה. הגדר את הפיצוי המתאים עבור נוגדנים ההטיה FITC פלואורסין נתון באמצעות FL1 לעומת התוויית נקודה FL1.

מניחים שער רבעים כך חרוזים שליליים נמצאים בתוך הרבע השמאלי התחתון ואת חרוזים חיוביים נמצאים בתוך הרבע הימני העליון או התחתון. התאם את ערכי הפיצוי עד שעוצמת הפלואורסאצין החציונית של כל אוכלוסייה שווה בקירוב. חזור על שלבים אלה עבור כל הצינורות.

עכשיו, להמשיך לרכישת דגימות כתם בפועל. הפעל את אשף הפיצויים ושמור את ההגדרה בתבנית:date, בניסוי ובתיבות התיבות שלך. השתלה אורתוטופית של אדנוקרצינומה צינורית הלבלב הביאה לצמיחה מהירה של גידול דומה לזו שנראתה בהשתלה תת עורית.

תמונות הכתמת המטוקסילין ואאוסין מייצגות מוצגות ומדגימות צמיחה דומה של שתלים תת עוריים ו אורתוטופיים. תפוקות תאים קיימא גבוהות למדי היו להשיג מדגם הגידול של שני סוגים של השתלה. SPLAT FACS נציג מראה תאים קיימא מגידול מופרדים מן התאים המתים ופסולת התא.

מוצג כאן, הוא גידול חודר השוואת פרופיל החיסון של האוכלוסייה העיקרית ואת אוכלוסיית תאי הנומרטור של מספר תת קבוצות מפתח של תאים חיסוניים סרטניים. הומוגרפט תת עורי לעומת אורתוטופי של סרטן הלבלב מוצגים. הנתונים מראים בבירור כי הגידול הגדיל באופן משמעותי את חדירת תאי החיסון בהשוואה ללבלב של עכברים בריאים.

בנוסף, נמצאו אחוזים שונים של תת-קבוצות של תאים חיסוניים שחדרו לגידולים אורתוטופיים לעומת הומוגרפטים תת עוריים. לדוגמה, ישנם באופן משמעותי יותר תאי B אורתוטופיים מאשר תת עורית. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להכין את כל החומרים הקשורים reagents מראש.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע ניתוח FACS עבור מודלים מורין.