זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

המטרות הכלליות של פרוטוקול זה הן לבחון את הפעלת הדלקת ברמת התא הבודד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולמדוד ליזה במהלך פירופטוזיס על ידי לקטט דהידרוגנאז, או בדיקת שחרור LDH. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדלקתי, כגון כיצד מווסתת הפעלת Caspase-1. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מאפשרות למשתמש לבחון שלבים מרובים של מסלולי ההפעלה הדלקתית והפירופטוזיס.

מי שידגים את ההליך יהיה אנדראס דן הארטי, מדען חוקר מהמעבדה שלי. התחל בהחלפת המדיום ממקרופאגים שמקורם במח עצם LPS שנזרעו על כיסויי זכוכית ב-290 מיקרוליטר של מדיום DMEM 5, בתוספת חמישה ניגריצין מיקרו-מולרי וחמישה מילי-מולרי גליצין, לבאר. החזירו את צלחת 24 הבארות לחממת תרבית התאים למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, והוסיפו 10 מיקרוליטר של 30X FAM-YVAD-FMK לאחר 15 הדקות הראשונות.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים במיליליטר PBS קר לבאר, שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל שטיפה ולתקן את התאים עם 250 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד לבאר למשך 30 דקות על קרח מוגן מאור, תוך סימון התאים בצבע גרעיני פלואורסצנטי מתאים במהלך חמש הדקות האחרונות. בתום הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כפי שהודגם זה עתה וטענו כל שקופית בשבעה מיקרוליטרים של אמצעי הרכבה נגד דהייה. הנח כיסוי על כל שקופית ואפשר למדיום ההרכבה להתקשות למשך הלילה לפני איטום הכיסויים בלק.

כדי לדמות את התאים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית, הנח את שקופית הבקרה הלא מטופלת על שלב המיקרוסקופ והתמקד ידנית בתאים. בעזרת המיקרוסקופ חפש את הגדרות הטבלה, התאם את ההיסט עד שלא נצפה צביעת בדיקה חיובית בתאים הלא מטופלים. לאחר מכן, באמצעות דגימה שטופלה בניגריצין, אתר שדה המכיל תאים חיוביים ושליליים כאחד לצביעה של הגשושית והתאם את מישור ההדמיה של תעלת הבדיקה למישור בעל העוצמה הגבוהה ביותר של צביעה חיובית.

לאחר מכן התאם את הרווח עד שהמוקדים נראים בתאים עם גרעינים מעובים וקבל תמונות של חמישה שדות שנבחרו באקראי לכל שקופית בהגדלה כוללת של פי 100. לניתוח אימונופלואורוכימי של התאים שטופלו בניגריצין, שטפו את התאים המסומנים באביזרים כפי שהודגמו זה עתה ודגרו על התאים ב-250 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע וחדירה לבאר למשך 30 דקות על קרח, מוגנים מפני אור. שטפו את המקרופאגים שלוש פעמים נוספות עם מאגר שטיפה טרי וסמנו את התאים ב-250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני כנגד חלבון דמוי כתם הקשור לפטוזיס המכיל תחום גיוס קספאז C-terminal, או ASC, לבאר, למשך שעה אחת על קרח.

שטפו את התאים בסוף הדגירה וסמנו את הדגימות ב-250 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המצומד בצבע פלואורסצנטי מתאים למשך שעה נוספת על קרח, והוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של צבע פלואורסצנטי מתאים במהלך חמש הדקות האחרונות. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים במאגר כביסה קרה, הרכיבו את הכיסויים על השקופיות עם שבעה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד דהייה, כפי שהודגם, ודמו את המקרופאגים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. כדי לבצע בדיקת שחרור LDH, הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום DMEM 5 בתוספת 10 ניגריצין מיקרו-מולרי לכל באר ניסוי ו-50 מיקרוליטר של DMEM 5 לבארות הבקרה הספונטניות ו-100% ליזה למשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר 30 דקות, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה 10X לבארות בקרת הליזה של 100% והוסף 10 מיקרוליטר של מדיום לבארות האחרות. בתום הדגירה יש לצנטריפוגה את הצלחת ולהעביר 50 מיקרוליטר סופרנטנט מכל באר לצלחת שקופה עם תחתית שטוחה. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מצע מופשר ומוכן טרי לכל באר למשך 30 דקות דגירה בחושך, בדוק את הצלחת לאחר 15 דקות כדי לאשר שהאות לא יחרוג ממגבלת הזיהוי של קורא הצלחות.

בתום הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר ומדוד את ה-OD490 על קורא צלחות מתאים כדי לאפשר חישוב של אחוז ליזיס התאים לבאר. בעוד שמקרופאגים מסוג שנחשפו לניגריצין מדגימים היווצרות של מוקד ASC באזור הפרה-גרעיני המכילים גם Caspase-1 פעיל, מה שמעיד על כך שתאים אלה עוברים פירופטוזיס. בעוד שמקרופאגים מעכברים חסרי Caspase-111 מייצרים גם הם מוקד ASC, לתאים אלה אין Caspase-1 פעיל הקשור למוקד זה, כפי שמעיד היעדר צביעת FAM-YVAD-FMK.

גם גרעיני התאים הללו אינם מעובים, מה שמעיד על היעדר מוות של תאים פירופטוטיים. יתר על כן, אחוז גדול מהמקרופאגים מסוג הבר עוברים מוות תאי לאחר חשיפה לניגריצין, כפי שנמדד על ידי ניתוח שחרור LDH של הסופרנטנטים התרבית שלהם, בעוד שמקרופאגים עם מחסור ב-Caspase-1 אינם משחררים LDH לתוך הסופרנטנט, מה שמצביע על כך שהתאים עדיין שלמים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין היווצרות דלקתית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולקבוע את רמת ליזיס התאים על ידי מדידת שחרור LDH.

ניתן לשנות הליך זה לשימוש בגירויים או התערבויות דלקתיות אחרות המשנות את הפעלת הדלקת או הפירופטוזיס.