ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה
15 במרץ 2018
בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג רישומים אלקטרופיזיולוגיים של תאים שלמים מנוירונים של הטקטום האופטי של הראשן על מנת ללמוד על דפוס הקישוריות שלהם במהלך ההתפתחות ובסופו של דבר להבין כיצד מעגלים עצביים נוצרים ומתפקדים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית כגון כיצד נוירונים משתנים במהלך ההתפתחות וכיצד מעגלים מתפקדים כדי לעורר התנהגות. היתרון העיקרי של תכשירים אלה הוא שהם מאפשרים רישום אלקטרופיזיולוגי של נוירונים טקטומים אופטיים כדי לספק תובנה לגבי תפקוד המעגלים העצביים המתפתחים.
מי שידגים את ההליך יהיה ג'ניו לואי, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי. בעזרת פיפטת העברת סילוק, העבר את הראשן המורדם לצלחת הקלטת דיסקציה המכילה תמיסת הקלטה חיצונית. אבטח את הראשן המורדם לגוש סיליקון שקוע על רצפת צלחת ההקלטה הניתוח.
לקבלת תצוגה ברורה של המוח, הסר את העור המכסה את המוח על ידי ביצוע חתך שטחי לאורך קו האמצע באמצעות מחט סטרילית בקוטר 25. פילט את המוח לאורך אותו ציר קו אמצע על ידי החדרת המחט לתוך הצינור העצבי ועל ידי משיכה עדינה כלפי מעלה כך שהחלק הגבי של הצינור נחתך בצורה נקייה תוך השארת לוחית הרצפה שלמה. כדי לבודד את המוח, השתמשו תחילה במחט בקוטר 25 כדי לחתוך את המוח האחורי.
לאחר מכן העבירו בעדינות את המחט מתחת למוח בכיוון זנב לרוסטרל כדי לנתק את כל רקמת החיבור הצדדית והגחונית וסיבי העצב. לאחר מכן, הצמידו את המוח לגוש של אלסטומר סיליקון על ידי הנחת סיכה אחת דרך אחת מפקעות הריח וסיכה נוספת דרך המוח האחורי. זוהי התצורה האופטימלית להקלטה מנוירונים טקטליים.
לאחר מכן העבר את הצלחת המכילה את תכשיר המוח השלם המוצמד מטווח הניתוח למתקן האלקטרופיזיולוגיה. הסר את קרום החדר באמצעות פיפטת זכוכית שבורה. כדי להפעיל ישירות את אקסוני ה-RGC, הורד בעדינות אלקטרודה מגרה דו קוטבית על הכיאזמה האופטית כך שנוצר שקע קטן ברקמה.
האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית צריכה להיות רוסטרלית וכמעט צמודה לחדר האמצעי הגדול שבו נמצאת הכיאזמה האופטית. האלקטרודה הדו-קוטבית מונעת על ידי ממריץ דופק המאפשר לשלוט במדויק בעוצמת הגירוי. כדי להכין את פרוסת המוח האופקית, התחילו עם כל הכנת המוח.
לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי לכרות את הרבע הצדדי ביותר של צד אחד של טקטום אופטי אחד. חתך זה נעשה במקביל למישור הזנב הרוסטרלי. לאחר מכן, הצמידו מחדש את המוח לצד אלסטומר הסיליקון כשהצד הפרוס פונה כלפי מעלה כך שניתן יהיה לגשת ישירות לסומטה ולנוירופיל לצורך הקלטה ומשטח החדר של המוח פונה הרחק מגוש אלסטומר הסיליקון כך שניתן יהיה למקם אלקטרודה דו-קוטבית על הכיאזמה האופטית.
לאחר מכן בצע את כל תיקון התא clamp או רישום פוטנציאל שדה מקומי. הנה הסכימה המציגה את התצורה של הכנת פרוסת מוח אופקית. שימו לב שלמרות שהאלקטרודה המגרה נשארת בכיאזמה האופטית, פיפטת ההקלטה ממוקמת כעת כדי לגשת לתאים בכל השכבות הטקטליות שנחשפו על ידי הכנת פרוסת המוח האופקית.
זוהי תגובה המעוררת RGC מתא עצב השוכן בשכבה השטחית של הטקטום. באיור זה, פוטנציאל השדה המתועד על פני הנוירופיל וצפיפות מקור הזרם המומר מוצגים על ידי תרשים תמונה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 10 דקות ובדרך כלל תימשך עד שלוש או ארבע שעות.
אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע הכנת מוח שלם ופרוסות מוח אופקיות עבור הקלטות של תאים שלמים, במטרה לכמת את התכונות החשמליות של תאי העצב הטקטליים ואת הקישוריות שלהם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן טכניקות של הקלטת patch clamp של תא שלם (whole cell) כדי לחקור את המעגל הרטינוטקטלי בגולמי Xenopus laevis. באמצעות שימוש בהכנות שונות של המוח, המחקר שואף להבין את דפוסי הקישוריות של נוירונים בטקטום האופטי (optic tectum) של הגולם במהלך ההתפתחות ואת התפקוד הכללי של מעגלים עצביים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- מעגלים עצביים
רקע
- חקירת האופן שבו מעגלים עצביים נוצרים ומתפקדים באורגניזמים מתפתחים.
- המעגל הרטינו-טקטלי (retinotectal circuit) חיוני לעיבוד חזותי בדו-מחלקים.
- ראשנים של Xenopus laevis משמשים כמודל בעל ערך לחקר קישוריות עצבית.
- הקלטות של תא שלם (Whole cell recordings) מספקות תובחנות מפורטות על פעילות נוירונלית.
מטרת המחקר
- להבנת דפוסי הקישוריות בין נוירונים ב-optic tectum.
- לניתוח האופן שבו נוירונים משתנים לאורך ההתפתחות.
- לבחינת האופן שבו מעגלים עצביים תורמים להתנהגות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שיטות patch clamp של תא שלם שימשו להקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
- המודל הביולוגי כלל מוחות של ראשנשאי שחולצו כדי לבחון נוירונים ב-optic tectum.
- לא הוזכרו תהליכי עבודה של multiomics.
- שלבים ספציפיים כללו קיבוע של ראשנשאי, בידוד המוח וביצוע הקלטות ממוקדות.
- השיטות מאפשרות הקלטה בתוך חלון זמן קריטי של 10 דקות, ונמשכות בדרך כלל מספר שעות.
תוצאות עיקריות
- ההכנות אפשרו בהצלחה את הקלטת פעילות הנוירונים בטקטום (tectum).
- נצפו שינויים אלקטרופיזיולוגיים המעידים על קישוריות עצבית.
- התוצאות עוררו דיונים על ההשלכות הפונקציונליות של המעגל הרטינוטקטלי (retinotectal circuit).
- הממצאים תורמים להבנת מעגלים עצביים התפתחותיים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטות יעילות לחקר קישוריות עצבית במוחות של ראשנים בשלבי התפתחות.
- המחקר משפר את ההבנה של תפקוד מעגלים עצביים במהלך ההתפתחות.
- להתוצאות יש השלכות רחבות יותר על בחינת תהליכים והתנהגויות נוירולוגיות בזוחלים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטת patch clamp של התא השלם בראשני Xenopus laevis מאפשרת בחינה ברזולוציה גבוהה של היווצרות ותפקוד של מעגלים עצביים, ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי קישוריות סינפטית ועירור עצבי במהלך ההתפתחות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות במדעי המוח על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה ישירה של תגובות עצביות לגירויים מוגדרים, כגון פעילות שמוגרית על ידי תאי גנגליון רשתית ב-optic tectum. יכולת ההסתגלות של השיטה להכנות in vivo, מוח שלם ופרוסות אופקיות משפרת את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) לצורך הפחתת סיכונים פרה-קליניים של מטרות נוירו-התפתחותיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות תגובות עצביות לקלט חושי, ובכך מבהיר קישוריות תפקודית במעגלים בהתפתחות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קריאות אלקטרופיזיולוגיות ישירות של פעילות עצבית, ובכך מפחית עמימות במעורבות המטרה.
- ערך חזוי: מסייע בתעדוף תיק פיתוח על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לשינויים מדידים בעירור של נוירונים בטקטום (tectal neuron) ובאינטגרציה סינפטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי ביסוס של הכנות נוירונליות יציבות וניתנות להקלטה עם תכונות תגובה-לגירוי מוגדרות.
- פלטים כמותיים: הפקת מדידות אלקטרופיזיולוגיות כגון זרמים פוסט-סינפטיים ופוטנציאלי שדה, המאפשרים ניתוח תגובה-למינון וכימות השפעת התרכובת.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: הכנת פרוסות מוח אופקיות מאפשרת הקלטה בכל שכבות הטקטום, מה שמגביר את התפוקה והעקביות עבור סבבי ניסויים חוזרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תהליכים של התפתחות נוירולוגית הרלוונטיים להפרעות הכוללות חיווט שגוי של מעגלים, ובכך תומך בחקר של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין שלב הגילוי לשלב התיקוף על ידי מתן אפשרות להקלטה עקבית של תפקוד נוירונלי לאורך נקודות זמן התפתחותיות.
- החלטות מותאמות סיכון: תומך בקריטריונים של go/no-go המבוססים על פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים של תוכניות פיתוח נוירולוגיות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן תיקוף פונקציונלי של מטרות עצביות לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), כאשר התוצאים מסייעים הן בבחירת המטרה והן בהבנה המכניסטית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי הקלטת תגובות מעוררות מנוירונים טקטליים בעקבות גרייה של אקסונים של תאי גנגליונים ברשתית.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות הכנות הדירות של מוח שלם ושל פרוסות, ומספקת תוצרי קריאה אלקטרופיזיולוגיים מדידים לסריקת תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כגון אמפליטודות של זרם וזמן השהיה (latency), ובכך מקלה על השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתקפות פרה-קלינית על ידי שמירה על תכונות של מעגלים רלוונטיים למחלה לאורך ההכנות, ובכך תומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה להקשרים ניסיוניים מרובים, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של שיטות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור המטרה על ידי צמצום העמימות המכניסטית באמצעות הקלטה עצבית ישירה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות פרוטוקולי הכנה מוגדרים לשיטות in vivo, מוח שלם ופרוסות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של תרכובות לא יעילות, ובכך מפחית את ההשקעה במטרות שאינן ברות-השגה.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס לקבלת החלטות על קידום מותאמות סיכון על ידי קישור תוצאות אלקטרופיזיולוגיות לתפקוד ברמת המעגל.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופיזיולוגיה ובטכניקות של דיסקציה מיקרו-כירורגית כדי להבטיח הכנה עקבית של המוח.
- התהליך תלוי בתמיסות יציבות להקלטה חוץ-תאית ובציוד סטימולציה תקין לקבלת תגובות מעוררות אמינות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הגירוי והגדרות ההקלטה כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- התאמה למערכות מודל שונות עשויה לדרוש התאמות בשיטות הדיסקציה וההנחה על תחתית הכלי, בהתאם לגודל המוח ולנגישותו.
- מגבלות מעשיות כוללות שיעורי הצלחה התלויים במבצע והיציבות של ההכנה לאורך סשני הקלטה ממושכים.
