Name: קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: חקור ספציפיות פרוטאז בתמציות רקמת ריאה של עכברים באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקבילי של מספר דגימות לזיהוי פעילות אנזימטית בפרוטאומיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי ניהון התרופות אוניברסיטת מחקר המענק ניהון התרופות האוניברסיטה (2016), את JP17854179 מספר MEXT גראנט KAKENHI.

פרוטוקולים ניסויים בבעלי חיים אושרה על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה פרמצבטיקה ניהון וביצע בהתאם להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של האוניברסיטה פרמצבטיקה ניהון. הפרוטוקול הותאם עבור רקמות תמציות נגזר ICR עכברים. עכברים ICR נרכשו מ ניפון SLC בע מ (שיזוקה, יפן)
1. הכנת המצע התווית על-ידי Iminobiotin
המצע עובר סינתזה מוצק-שלב באמצעות קבוצה 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-מוגן חומצות אמינו כמפורט להלן11. השתמש בטבלה 2 כדי לקבוע המתחם-Fmoc נעשה שימוש, בהתאם להזמנה חומצת אמינו שלב של סינתזה.
<ol><li>סיפוריכם 0.2 גר' Fmoc-NH-סאל שרף עם 10 מ"ל של N, N-dimethylformamide (DMF) בעמודה סינתזה.</li>
	<li>הוסף 5 מ של 30% פיפרידין DMF. רוק הפתרון עבור 10 דקות לדבוק Fmoc-הקבוצה.</li>
	<li>
בדוק Fmoc מחשוף עם החומצה trinitrobenzenesulfonic (TNBS) מבחן12: צינור TNBS DMF ו 10 µL של diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 מ מ2 מבחנה, ואז העברת כמות קטנה של שרף הזכוכית להוסיף 10 µL של 1%. שרף ביקע Fmoc לפתח צבע כתום.
	<ol>
<li>חזור על שלבים 1.2-1.3 אם התוצאה היא שלילית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את השרף שלוש פעמים עם 5 מיליליטר DMF.</li>
	<li>
הוסף 5 מ של DMF המכיל mmol 0.3 של המתחם Fmoc המפורטים בטבלה מס ' 2 (החל מהמתחם נעשה שימוש בשלב 1), 0.3 mmol של O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 0.3 mmol של 1- הידרוקסי-1H-benzotriazole, monohydrate (HOBt) ו- 0.6 mmol של diisopropylethylamine (DIPEA). רוק הפתרון למשך 30 דקות לשלב זאת עם השרף.
	<ol>
<li>בדוק שלב זה עם הבדיקה TNBS. אם התוצאה היא חיובית, משמעות התגובה לא התקדם במידה מספקת, יש לחזור על שלב זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את השרף שלוש פעמים עם 5 מיליליטר DMF.</li>
	<li>חזור על התגובה התארכות מאת וחזור על שלבים 1.2-1.6, שינוי Fmoc-המתחם בשימוש בשלב 1.5 על פי בטבלה 2.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של מים 2.5%, 1% triisopropylsilane (TIS), ו- 2.5% ethanedithiol (EDT) בחומצה trifluoroacetic כדי לדבוק פפטידים מקבוצות שרף והגנה. רוק הפתרון עבור 60 דקות.</li>
	<li>לסנן, ולאסוף את פילטרט של צינור 50-mL.</li>
	<li>להוסיף 40 מ"ל אתנול diethyl קר, חנות בן לילה ב-20 ° C.</li>
	<li>צנטריפוגה g 4,000 x ב-20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לאסוף את גלולה.</li>
	<li>השתמש של desiccator עבור 3 שעות כדי להסיר את דיאתיל אתר.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 50% acetonitrile מים, לפזר את פפטידים גולמי. Lyophilize הפתרון כדי להסיר חומצה trifluoroacetic. חזור על פעולה זו מספר פעמים.</li>
	<li>
לטהר את פפטידים משתמש בעמודה מחסנית סי18.
	<ol>
<li>הפעל את השרף בעמודה מחסנית סי18 באמצעות 3 מ"ל של acetonitrile (לחצן מצוקה).</li>
		<li>Equilibrate עם 5 מיליליטר 5% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H2O.</li>
		<li>לטעון את peptides סינתטי גס לתוך העמודה מחסנית סי18.</li>
		<li>לשטוף עם 10 מ"ל של 5% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H2O.</li>
		<li>Elute את הדגימות עם 3 מ"ל של 60% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בדוק את פפטידים על ידי מדידת משקל מולקולרי שלהם באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF.
	<ol>
<li>פיפטה 1 µL של eluent על צלחת היעד. מיד להוסיף רוויה α-cyano-4-hydroxycinnamic תמיסה חומצית (CHCA) ב- 50% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%</li>
		<li>יצירת גביש את התערובת על-ידי air-drying.</li>
		<li>רוכשים ספקטרה המונית של דוגמאות על פי הפרוטוקול של היצרן מכשיר.<ol>
<li>להגדיר באופן ידני MALDI-TOF ספקטרומטר מסה כדי חיובית לשקף מצב.</li>
			<li>לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות CHCA, bradykinin קטע 1-7 (משקל מולקולרי monoisotopic = 756.3997 Da), ו אנגיוטנסין II (monoisotopic משקל מולקולרי = 1,045.5423 Da).</li>
			<li>לרכוש את ספקטרום המונית של peptides סינתטי ולאחר מכן להעריך על-ידי השוואתה עם משקל מולקולרי תיאורטי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת תמציות רקמות
<ol><li>עזים ומתנגד זכר ICR עכברים בתוך תא שאיפה איזופלוריין ואמת הרדמה עומק באמצעות הבוהן צביטה. המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>בעזרת מספריים, עושים חתך בבטן קו האמצע באמצעות הרחבת העור עד הסרעפת.</li>
	<li>לחתוך דרך הסרעפת ולאסוף את כל רקמת הריאה. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם סליין באגירה טריס כקרח 50 מ מ (pH 7.4).</li>
	<li>שוקלים את רקמות ואת העברת כ 100 מ ג של רקמות שפופרת זכוכית2 12 x 75 מ מ.</li>
	<li>הוסף mL 0.3 המאגר החילוץ (50 מ מ טריס-מאגר, pH 7.4, המכיל 0.1% פולי (oxyethylene) octylphenyl אתר).</li>
	<li>
Homogenize הדגימות רקמת הריאה באמצעות מהמגן ערבוב.
	<ol>
<li>מגניב הדגימות על קרח.</li>
		<li>Homogenize את הדגימות-20,000 סל ד ל 30 s בבלנדר. חזור על שלב זה עד הדגימות הומוגנית לחלוטין. הערה: לא homogenize עבור יותר מ 1 דקה ללא הרף, על מנת למנוע עלייה בטמפרטורה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העברת 1,000 µL של homogenate צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 10,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העברת µL 500 של תגובת שיקוע צינור פלסטיק 1.5 מ.</li>
	<li>השתמש µL 10 המדגם כדי לקבוע ריכוז חלבון, שימוש בשיטות כגון bicinchoninic חומצה (BCA) או בשיטה Coomassie מבריק כחול (CBB).</li>
	<li>למניעת קיפאון, להוסיף 80% גליצרול הדגימות עבור ריכוז סופי של 50% גליצרול.</li>
	<li>לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.</li>
</ol>3. העיכול של מצעים בשנת המודל פרוטאז ותמציות רקמות
<ol><li>
להוסיף 10 µL של 0.1 µg µL של N-tosyl-L-פנילאלנין chloromethyl קטון (TPCK)-טריפסין, 0.1 µg µL של Staphylococcus aureus V8 פרוטאז או µg 10/µL של רקמת תמציות לתוך µL 890 של מאגר לעיכול.
	<ol>
<li>כדי להבהיר את ההבדל בין ירידה לפרטים פרוטאז בהתאם רמת החומציות, השתמש מאגרי להתאים ל- pH 3, 5, 7 ו- 9. ההרכב של המאגר עיכול מוצג בטבלה3.</li>
		<li>לבצע את פקד שליליים באמצעות פרוטאז לא פעיל בתמציות רקמות, שהוכנו על ידי דגירה מים רותחים (או חימום ב 100 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 10 µL של סובסטרטים התווית על-ידי iminobiotin (מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), הריכוז הסופי = 100 µL pmol/10).</li>
	<li>תקופת דגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס לעכל את התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים.</li>
	<li>לאחר דגירה, לעצור את העיכול של מצעים עם מים רותחים (או על ידי חימום ב 100 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.</li>
	<li>Centrifuge של סובסטרטים מתעכל למשך 5 דקות ב 10,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש.</li>
</ol>4. טיהור של המצע התווית על-ידי Iminobiotin
<ol><li>
להוסיף µL 50 streptavidin 50% sepharose החרוזים 1 מ' טריס-buffer (pH 9) המכיל 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl אתר.
	<ol>
<li>השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח כי הפתרון הוא סביב ה-pH 9. אם ה-pH של התמיסה נמוכה, להתאים אותו כ ה-pH 9 על-ידי הוספת 1 מ' טריס-buffer (pH 9) המכיל 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl אתר. שלב זה חשוב, כפי שהוא כרוך קשירה של המצע התווית על-ידי iminobiotin כדי streptavidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה בין לילה ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב כדי לאגד את התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים streptavidin. החרוזים צריכים להישאר מושהה במהלך הדגירה.</li>
	<li>צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג'י x ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>
לשטוף את החרוזים חמש פעמים כדלקמן:
	<ol>
<li>להוסיף 1,000 µL של חיץ לשטוף (50 מ מ טריס-buffer, pH 9) החרוזים.</li>
		<li>רחץ 10 דקות ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב. החרוזים צריכים להישאר מושהה במהלך הדגירה.</li>
		<li>צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- g x 10,000 ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להוסיף 100 µL של 0.2% חומצה trifluoroacetic החרוזים.
	<ol>
<li>השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח כי הפתרון הוא מתחת pH 2. אם ה-pH של התמיסה גבוה, להתאים את רמת החומציות אל מתחת 2 על-ידי הוספת חומצה trifluoroacetic 1%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב.</li>
	<li>צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- g x 10,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.</li>
</ol>5. לטעום והכנה לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF ספקטרומטר מסה)
הערה: כל הפתרונות בשלבים הבאים צריכים להיות מוכנים עם ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC)-מים רצף-כיתה כיתה או חומצת אמינו.
<ol><li>פיפטה 500 µL של acetonitrile על גבי שרף סי18 כדי להפעיל אותו. הסר את acetonitrile משומשים. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>Equilibrate שרף סי18 עם 100 µL של 0.1% חומצה trifluoroacetic. להסיר את eluent. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>כדי לטעון את הדגימות, לאגד את הדגימות שרף באמצעות פיפטה.</li>
	<li>לשטוף את השרף עם 20 µL של 0.1% חומצה trifluoroacetic. חזור על שלב זה חמש פעמים.</li>
	<li>Elute את הדגימות עם 3 µL של 60% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%. Pipette את eluent על צלחת היעד עבור ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. מיד להוסיף רוויה α-cyano-4-hydroxycinnamic תמיסה חומצית (CHCA) ב- 50% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%.</li>
	<li>יצירת גביש את התערובת על-ידי air-drying.</li>
	<li>
רוכשים ספקטרה המונית של דוגמאות על פי הפרוטוקול של יצרן כלי.
	<ol>
<li>להגדיר באופן ידני MALDI-TOF ספקטרומטר מסה כדי חיובית לשקף מצב.</li>
		<li>לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות CHCA, bradykinin קטע 1-7 (משקל מולקולרי monoisotopic = 756.3997 Da), ו אנגיוטנסין II (monoisotopic משקל מולקולרי = 1,045.5423 Da).</li>
		<li>רוכשים את ספקטרום המונית של דגימות, הקדשת תשומת לב ספקטרום המונית בין 700 ל 900 Da עבור הטופס cleaved של סובסטרטים התווית על-ידי ביוטין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לזהות את הפסגות שזוהו באמצעות טבלה 1. זיהוי של משקל מולקולרי המתאים מציין המחשוף ב C-הסופית של חומצת אמינו רלוונטי ביותר.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

פרוטוקול זה משתמש ספקטרומטר מסה MALDI-TOF לזיהוי ירידה לפרטים פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות, יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות. בפרט, אנו מניפולציות pH כדי לגרום לשינוי במצב המצע ירידה לפרטים.
אבידין-ביוטין מורכבים (ABC) השיטה, אשר כבר בשימוש נרחב בביוכימיה עקב ירידה לפרטים שלה מחייב, היה מנוצל פרוטוקול שלנו. בשל בזיקה חזקה של ABC, הכריכה של אבידין כדי ביוטין הוא כמעט בלתי הפיך. זיקה טיהור על ABCs לכן מאוד לא יעיל. מסיבה זו, אנו מדווחים כי שיעור שחזור עבור התווית על-ידי ביוטין...

פרוטאזות לווסת תהליכים פיזיולוגיים על ידי ביקוע חלבונים, הייזום של פעילות פרוטאז לתשמיש, המיקומים מוסדר1. לכן חשוב לזהות את הביטוי ואת הפעילות של רקמות שמווסתים באופן מקומי, וכן לפתח שיטה לגילוי פרוטאזות. פעולת השירות המוצע במחקר זה שמטרתו לזהות ירידה לפרטים פרוטאז במקביל גילוי פרוטאזות.
ישנן כמה שיטות לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים. שיטת azocasein הינו ידוע בשל השימוש בו הגילוי של פרוטאזות2 . מוגבלת יכולתו להשיג עוד מידע Zymography הוא שיטה לזיהוי פרוטאז מקיפה אחרת זה יכול לשמש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של פרוטאזות3, אבל זה לא יכול לשמש כדי לבחון המצע ירידה לפרטים. ירידה לפרטים פרוטאז יכול להיקבע על ידי מבחני spectrometric, באמצעות סובסטרטים כגון p-nitroanilide4, מבחני fluorometric, באמצעות קומרין סובסטרטים5 או מבחני פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)6. שיטות אלה מאפשרות זיהוי חד-ירידה לפרטים של סובסטרטים הכלול לבאר בודדת. במחקר הנוכחי, יחודיות פרוטאז של רקמות תמציות נבדק בתנאים שונים, כמו תמציות אלה מכילים פרוטאזות מרובים. פרוטאז פעילות מוסדר על ידי מספר גורמים, כולל ה-pH, קואנזימים, prosthetic קבוצות של יון כוח. לאחרונה, שיטות מבוססות פרוטאומיקס שימשו לזיהוי פרוטאז ירידה לפרטים; לדוגמה, שיטת שדווחו על-ידי Biniossek et al. 7 משתמש את פרוטאום כדי לקבוע ירידה לפרטים המצע אפילו בתמציות גולמי ומאפשר נחישות מדויק של הפעילות המחשוף של פרוטאזות לזהות רצפים מרובים של חומצת אמינו8. עם זאת, שיטה זו אינו מתאים לניתוח של דוגמאות רבות. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשר עיבוד סימולטני של דגימות מרובות ושימוש של Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון זמן-של-טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה לניתוח מדגם מקלה על זיהוי מהיר וקל של cleaved מצעים.
מאמר זה מתאר שיטה להעריך ירידה לפרטים פרוטאז באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף כדי למדוד את המשקל המולקולרי של מצעים ייחודי. הצורות מולקולרית של מצעים cleaved, יחד עם משקולות מולקולרית התיאורטי שלהם, מוצגים באיור 1 ושל טבלה 1. מחקרים קודמים השתמשו סובסטרטים המכיל מפרידי polyglycine וביוטין9; עם זאת, אלה סובסטרטים מתגברת כי ייתכן ביקע את רצף polyglycine על ידי אנזימים לזהות את רצף גליצין. בנוסף, בזיקה גבוהה בין אבידין ביוטין עלול להוביל קצב החלמה נמוכים. כדי לשפר את החסרונות האלה, במחקר זה שאנו מסונתז מצע ייחודי, אשר הולחן של פוליאתילן גליקול (PEG), iminobiotin, חומצת אמינו שיכול לזהות את האתר המחשוף (איור 1). להפלות בין חומצות אמינו של משקולות מולקולרי דומה, D-סרין נוסף בין חומצת אמינו ביותר באתר cleaved את מרווח פג.
N-מסוף של המצע סומן עם iminobiotin, המאפשרת טיהור זיקה מדגימות גולמי. השימוש iminobiotin במקום ביוטין הוא קריטי; ביוטין יש זיקה חזקה עם אבידין, דבר המתבטא המחירים נמוך השחזור של התווית על-ידי ביוטין מצעים מ שרף אבידין, בזמן אהדה של iminobiotin אבידין יכולים להשתנות על ידי ה-pH. התווית על-ידי Iminobiotin סובסטרטים יהיה לאגד אבידין בתנאים לעיל pH 9, בעוד אבידין משחרר התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים בתנאים להלן pH 4. לכן, iminobiotin שימש לטיהור זיקה10. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים באמצעות מצעים ייחודי.

<table><tbody><tr><td>שרף Fmoc-NH-SAL (-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide (DMF)</td> <td>Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>פיפרידין</td><td>וואטאנאבה כימית ושות', בע"מ</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריניטרובנזנסולפונית (TNBS)</td> <td>WAKO כימית</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-הידרוקסי-1H-בנזוטריאזול, מונוהידראט (HOBt)</td> <td>Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td> <td>Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropylsilane (TIS)</td> <td>Watanabe כימיקלים ושות', בע"מ</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td> <td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית (TFA)</td> <td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 עמוד מחסנית</td><td>Waters</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>poly (oxyethylene) octylphenyl ether</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>ערבוב הומוגנייזר</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>הומוגנייזר פוליטרון</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosyl-L-פנילאלנין כלורו-מתיל קטון (TPCK)-טריפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין ספרוז</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&אלפא;-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמית (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה</td><td>Bruker Daltonics, גרמניה</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו Fmoc</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה maldi-תוף: מניפולציה ph כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

פרוטאזות יש כמה פונקציות ביולוגיות, כולל הפעלה/איון חלבון ועיכול המזון. המזהה פרוטאז ירידה לפרטים חשוב לחשוף פרוטאז פונקציה. השיטה המוצעת במחקר זה קובע פרוטאז ירידה לפרטים על ידי מדידת משקל מולקולרי של סובסטרטים ייחודי באמצעות מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (MALDI-TOF). סובסטרטים מכילים iminobiotin, בעוד האתר cleaved מורכב חומצות אמינו, מרווח מורכב פוליאתילן גליקול. המצע cleaved יפיק משקל מולקולרי ייחודי בעזרת של חומצת אמינו cleaved. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי זה יכול להתבצע בסיר אחד באמצעות דגימות גולמי, הוא גם מתאים להערכת מספר דוגמאות. במאמר זה, אנו מתארים שיטה ניסיונית פשוטה ממוטבת עם דגימות שחולצו מן העכבר רקמת הריאה, כולל רקמות החילוץ, השמה של סובסטרטים עיכול לתוך דגימות, טיהור של סובסטרטים העיכול בתנאים שונים pH , או מידה של משקל מולקולרי של סובסטרטים באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. לסיכום, טכניקה זו מאפשרת זיהוי היחודיות פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף, אשר יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות.

הערכה של השיטה לזיהוי היחודיות פרוטאז על ידי מודל פרוטאז
היעילות של מערכת זו הוערך באמצעות TPCK-טריפסין ו- V8 פרוטאז, specificities המצע אשר התקבלו. TPCK-טריפסין, V8 פרוטאז הוערך כדי לבקע את רצף חומצות אמיניות בטרמינל-C של משקעי ליזין, ארגינין, על הצד carboxy של חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית משקעים, בהתאמה. טבלה 1 מציגה את המשקל המולקולרי תיאורטי של המצע, מתעכל שברי ביקע על ידי פרוטאזות ספציפיים. המצע העיכול באמצעות...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע ירידה לפרטים פרוטאז ברקמת העכבר גולמי תמציות באמצעות ספקטרומטר MALDI-TOF.

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה, היא לקבוע ספציפיות פרוטאז בתמציות גולמיות מרובות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כדי לקבוע את הספציפיות של פרוטאז. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא יכולה לזהות ספציפיות פרוטאז של דגימות מרובות בהימור.דגימות רקמת ריאה קרות שהתקבלו מעכברי ICR זכרים בקרח. הומוגניזציה של הדגימות ב-20,000 RMP למשך 30 שניות בבלנדר. חזור על שלב זה עד שהדגימות יהיו הומוגניות לחלוטין.אין לבצע הומוגניזציה במשך יותר מדקה אחת ברציפות על מנת למנוע עלייה בטמפרטורה. העבירו 1,000 מיקרוליטר של ההומוגנאט לצינור של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב -10,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. העבירו 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור פלסטיק חדש בנפח 1.5 מיליליטר.השתמש ב-10 מיקרוליטר מהדגימה כדי לקבוע את ריכוז החלבון. שימוש בשיטות, כגון בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית או בדיקת ברדפורד. כדי למנוע הקפאה, הוסף 80% גליצרול לדגימות לריכוז סופי של 50% גליצרול.כדי להבהיר את ההבדל בספציפיות הפרוטאז בהתאם ל-pH, השתמש במאגרי עיכול המותאמים ל-pH שלוש, חמש, שבע ותשע. לתוך 890 מיקרוליטר של מאגר עיכול, הוסף 10 מיקרוליטר של 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר או טריפסין TPCK, 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר של סטפילוקוקוס אוראוס V8 פרוטאז, או 10 מיקרוגרם למיקרוליטר של תמציות רקמות. הכן בקרות שליליות על ידי השבתת פרוטאז בתמציות רקמות על ידי דגירה ומים רותחים למשך 10 דקות.לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטר של מצעי תווית ביוטין MNO לדגימות ודגרו במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול. לאחר הדגירה יש להפסיק את עיכול המצעים במים רותחים למשך 10 דקות. צנטריפוגה את המצעים המעוכלים למשך חמש דקות ב -10, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 50 מיליליטר של 50% חרוזי סטרפטווידין ספרוז במאגר טריס טוחנת אחד, המכיל 0.1% פוליאוקסיאתילן אוקטיל פניל אתר. השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח שהתמיסה היא סביב pH תשע.חשוב להתאים את ה-pH המתאים לתשע או יותר. אמינו ביוטין לא יכול לנגוס בחרוז אלא אם כן הוא pH תשע ומעלה. אם ה-pH של התמיסה נמוך, התאם אותו ל-pH תשע בערך על ידי הוספת חיץ נוסף.בנוסף ניתן להוסיף בופר טריס טוחנת אחד כדי להעלות את ה-pH במידת הצורך. דגרו את המתלה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין מתמשך על גלגל מסובב כדי לקשור את המצעים המסומנים בביוטין MNO לסטרפטווידין. החרוזים צריכים להישאר תלויים לאורך כל הדגירה.למחרת, צנטריפוגה את הדגימות למשך דקה אחת ב-10,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט יש לשטוף את החרוזים על ידי הוספת 1,000 מיקרוליטר של מאגר כביסה. לאחר מכן, דגרו במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין מתמשך על מסובב.צנטריפוגה את החרוזים למשך דקה אחת ב 10, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. הסירו את החומר וחזרו על הכביסה ארבע פעמים. לאחר מכן, הוסף לחרוזים 100 מיקרוליטר של 0.2% חומצה טריפלואורואצטית.השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח שהתמיסה נמוכה מ-pH שתיים. אם ה-pH של התמיסה גבוה, התאם את ה-pH מתחת לשניים על ידי הוספת 1% חומצה טריפלואורואצטית. דגרו את המתלה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין רציף על גלגל מסובב.לאחר צנטריפוגה של החרוזים כמו קודם, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. שפכו 20 מיקרוליטר של אצטוניטריל על שרף C18 כדי להפעיל אותו. הסר את האצטוניטריל המשומש וחזור על שלב הפעלה זה שלוש פעמים.לאחר מכן, יש לאזן את שרף C18 עם 20 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית. הסר את הנוזל וחזור על שלב שיווי משקל זה שלוש פעמים. כדי לטעון את הדגימות, קושרים אותן לשרף באמצעות פיפט.שוטפים את השרף עם 20 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית. חזור על שלב זה חמש פעמים. יש להוציא את הדגימות עם שלושה מיקרוליטרים של 60% אצטוניטריל ב-0.1% חומצה טריפלואורואצטית.הצמד את הנוזל על לוחית מטרה עבור ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF. הוסף מיד תמיסת CHCA, רוויה ב-50% אצטוניטריל ב-0.1% חומצה טריפלואורואצטית. מגבשים את התערובת על ידי ייבוש אוויר.רכוש ספקטרום מסה של דגימות, על פי פרוטוקול יצרן המכשיר, תוך שימת לב רבה לספקטרום המסה בין 700 ל-900 דלטון עבור הצורה המפוצלת של מצעי תוויות הביוטין. ספקטרום מסה של מצעים סינתטיים מוצג כאן. פסגות המתאימות למשקל המולקולרי של המבשר זוהו בין 850 ל-1,050.השברים השסועים זוהו בטווח שבין 700 ל-850. מוצג כאן הספקטרום של מצעים מסומנים בביוטין MNO שטופלו בטריפסין TPCK. פסגות דלתון 839.81 ו-796.76 דלטון תואמות את השברים שנבקעו מקצה C של ליזין וארגינין בהתאמה.מוצג כאן ספקטרום המסה של מצעים סינתטיים המתעכלים עם פרוטאז V8. פסגות 769.78 דלתון ו-755.62 דלתון תואמות את השברים שנבקעו מקצה C של חומצה גלוטמית וחומצה אספרטית בהתאמה. הספקטרום של תוויות ביוטין MNO מצעים שטופלו בתמצית רקמת ריאה בתנאי pH שונים מוצג כאן.במצב החומצי, ב-pH 5, המשקל המולקולרי של שבר שסוע היה 770.13 דלטון ו-826.66 דלטונים, מה שמעיד על מחשוף בקצה C של חומצה גלוטמית וטריפטופן. במצב הנייטרלי והבסיסי, ב-pH 7 ו-9, המשקל המולקולרי של שבר שסוע גדל בשיא של 767 דלטון ו-840 דלטונים, מה שמצביע על שסע בקצה C של ארגינין וליזין. לעומת זאת, השיאים של החומצה הגלוטמית והטריפטופן ירדו.בנוסף, שיטה זו אינה יכולה לזהות שברים שסועים עם תמציות מושבתות. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי, למעט סינתזה של מצע. בנוסף, לאחר סינתזה של המצע, ניתן למדוד אותו במספר דגימות. למה?כשאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור לפעול ב-pH המאגר, בערך תשע. בדרך כלל, התגובה של קומפלקס האמינו ביוטין אבידין. בעקבות הליך זה, ניתן לכמת את פעילות האנזים על ידי ביצוע CMS.שיטה זו תאפשר לחוקרים בתחום הפרוטיאון לסלול את הדרך לחקר ביטוי הפרוטאז במספר תנאים.

the-determination-protease-specificity-mouse-tissue-extracts-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

השליח השני c-di-GMP הנפוץ בכל מקום שולט בגדילה ובהתנהגות של חיידקים רבים. פיתחנו טכנולוגיה חדשה המבוססת על ספקטרומטריית מסה של תרכובת לכידה לזיהוי ואפיון ביוכימי של חלבונים קושרים c-di-GMP כמעט בכל מין חיידקים.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

ניתן להשתמש במערכי פפטידים המסונתזים בשיטת SPOT כדי לנתח את ספציפיות הסובסטרט של חלבון ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) ולהגדיר את ספקטרום הסובסטרט של PKMTs כדי להבין את תפקידם הביולוגי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנתז מערכי פפטידים, לבצע מתילציה שלהם עם PKMTs ולנתח את התוצאות.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.

טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכימות הרכיבים בתערובות של מינים בעלי חלבונים דומים. ספקטרומטריית מסה מזהה פפטידים לזיהוי, ונותנת כימות יחסי לפי יחסים של אזורי שיא. ככלי לזיהוי הונאה, השיטה יכולה לזהות 1% סוס בבשר בקר.

נחישות כימות המינים בשנת תערובות שימוש ספקטרומטריית מסה MRM של פפטידים יישומית כדי אימות בשר

חקור ספציפיות פרוטאז בתמציות רקמת ריאה של עכברים באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקבילי של מספר דגימות לזיהוי פעילות אנזימטית בפרוטאומיקה.

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

גלה סרטונים נוספים