קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

המטרה הכוללת של ניסוי זה, היא לקבוע ספציפיות פרוטאז בתמציות גולמיות מרובות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כדי לקבוע את הספציפיות של פרוטאז. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא יכולה לזהות ספציפיות פרוטאז של דגימות מרובות בהימור.

דגימות רקמת ריאה קרות שהתקבלו מעכברי ICR זכרים בקרח. הומוגניזציה של הדגימות ב-20,000 RMP למשך 30 שניות בבלנדר. חזור על שלב זה עד שהדגימות יהיו הומוגניות לחלוטין.

אין לבצע הומוגניזציה במשך יותר מדקה אחת ברציפות על מנת למנוע עלייה בטמפרטורה. העבירו 1,000 מיקרוליטר של ההומוגנאט לצינור של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב -10,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. העבירו 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור פלסטיק חדש בנפח 1.5 מיליליטר.

השתמש ב-10 מיקרוליטר מהדגימה כדי לקבוע את ריכוז החלבון. שימוש בשיטות, כגון בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית או בדיקת ברדפורד. כדי למנוע הקפאה, הוסף 80% גליצרול לדגימות לריכוז סופי של 50% גליצרול.

כדי להבהיר את ההבדל בספציפיות הפרוטאז בהתאם ל-pH, השתמש במאגרי עיכול המותאמים ל-pH שלוש, חמש, שבע ותשע. לתוך 890 מיקרוליטר של מאגר עיכול, הוסף 10 מיקרוליטר של 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר או טריפסין TPCK, 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר של סטפילוקוקוס אוראוס V8 פרוטאז, או 10 מיקרוגרם למיקרוליטר של תמציות רקמות. הכן בקרות שליליות על ידי השבתת פרוטאז בתמציות רקמות על ידי דגירה ומים רותחים למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטר של מצעי תווית ביוטין MNO לדגימות ודגרו במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול. לאחר הדגירה יש להפסיק את עיכול המצעים במים רותחים למשך 10 דקות. צנטריפוגה את המצעים המעוכלים למשך חמש דקות ב -10, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.

העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 50 מיליליטר של 50% חרוזי סטרפטווידין ספרוז במאגר טריס טוחנת אחד, המכיל 0.1% פוליאוקסיאתילן אוקטיל פניל אתר. השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח שהתמיסה היא סביב pH תשע.

חשוב להתאים את ה-pH המתאים לתשע או יותר. אמינו ביוטין לא יכול לנגוס בחרוז אלא אם כן הוא pH תשע ומעלה. אם ה-pH של התמיסה נמוך, התאם אותו ל-pH תשע בערך על ידי הוספת חיץ נוסף.

בנוסף ניתן להוסיף בופר טריס טוחנת אחד כדי להעלות את ה-pH במידת הצורך. דגרו את המתלה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין מתמשך על גלגל מסובב כדי לקשור את המצעים המסומנים בביוטין MNO לסטרפטווידין. החרוזים צריכים להישאר תלויים לאורך כל הדגירה.

למחרת, צנטריפוגה את הדגימות למשך דקה אחת ב-10,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט יש לשטוף את החרוזים על ידי הוספת 1,000 מיקרוליטר של מאגר כביסה. לאחר מכן, דגרו במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין מתמשך על מסובב.

צנטריפוגה את החרוזים למשך דקה אחת ב 10, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. הסירו את החומר וחזרו על הכביסה ארבע פעמים. לאחר מכן, הוסף לחרוזים 100 מיקרוליטר של 0.2% חומצה טריפלואורואצטית.

השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח שהתמיסה נמוכה מ-pH שתיים. אם ה-pH של התמיסה גבוה, התאם את ה-pH מתחת לשניים על ידי הוספת 1% חומצה טריפלואורואצטית. דגרו את המתלה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין רציף על גלגל מסובב.

לאחר צנטריפוגה של החרוזים כמו קודם, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. שפכו 20 מיקרוליטר של אצטוניטריל על שרף C18 כדי להפעיל אותו. הסר את האצטוניטריל המשומש וחזור על שלב הפעלה זה שלוש פעמים.

לאחר מכן, יש לאזן את שרף C18 עם 20 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית. הסר את הנוזל וחזור על שלב שיווי משקל זה שלוש פעמים. כדי לטעון את הדגימות, קושרים אותן לשרף באמצעות פיפט.

שוטפים את השרף עם 20 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית. חזור על שלב זה חמש פעמים. יש להוציא את הדגימות עם שלושה מיקרוליטרים של 60% אצטוניטריל ב-0.1% חומצה טריפלואורואצטית.

הצמד את הנוזל על לוחית מטרה עבור ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF. הוסף מיד תמיסת CHCA, רוויה ב-50% אצטוניטריל ב-0.1% חומצה טריפלואורואצטית. מגבשים את התערובת על ידי ייבוש אוויר.

רכוש ספקטרום מסה של דגימות, על פי פרוטוקול יצרן המכשיר, תוך שימת לב רבה לספקטרום המסה בין 700 ל-900 דלטון עבור הצורה המפוצלת של מצעי תוויות הביוטין. ספקטרום מסה של מצעים סינתטיים מוצג כאן. פסגות המתאימות למשקל המולקולרי של המבשר זוהו בין 850 ל-1,050.

השברים השסועים זוהו בטווח שבין 700 ל-850. מוצג כאן הספקטרום של מצעים מסומנים בביוטין MNO שטופלו בטריפסין TPCK. פסגות דלתון 839.81 ו-796.76 דלטון תואמות את השברים שנבקעו מקצה C של ליזין וארגינין בהתאמה.

מוצג כאן ספקטרום המסה של מצעים סינתטיים המתעכלים עם פרוטאז V8. פסגות 769.78 דלתון ו-755.62 דלתון תואמות את השברים שנבקעו מקצה C של חומצה גלוטמית וחומצה אספרטית בהתאמה. הספקטרום של תוויות ביוטין MNO מצעים שטופלו בתמצית רקמת ריאה בתנאי pH שונים מוצג כאן.

במצב החומצי, ב-pH 5, המשקל המולקולרי של שבר שסוע היה 770.13 דלטון ו-826.66 דלטונים, מה שמעיד על מחשוף בקצה C של חומצה גלוטמית וטריפטופן. במצב הנייטרלי והבסיסי, ב-pH 7 ו-9, המשקל המולקולרי של שבר שסוע גדל בשיא של 767 דלטון ו-840 דלטונים, מה שמצביע על שסע בקצה C של ארגינין וליזין. לעומת זאת, השיאים של החומצה הגלוטמית והטריפטופן ירדו.

בנוסף, שיטה זו אינה יכולה לזהות שברים שסועים עם תמציות מושבתות. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי, למעט סינתזה של מצע. בנוסף, לאחר סינתזה של המצע, ניתן למדוד אותו במספר דגימות. למה?

כשאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור לפעול ב-pH המאגר, בערך תשע. בדרך כלל, התגובה של קומפלקס האמינו ביוטין אבידין. בעקבות הליך זה, ניתן לכמת את פעילות האנזים על ידי ביצוע CMS.

שיטה זו תאפשר לחוקרים בתחום הפרוטיאון לסלול את הדרך לחקר ביטוי הפרוטאז במספר תנאים.